CN101962627A - 一种犊牛体外胚胎生产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种高效的犊牛体外胚胎生产的方法，包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。犊牛体外胚胎生产可以充分利用犊牛卵巢中卵母细胞作为丰富的胚源，对犊牛进行超排采卵。将其与奶牛性控技术相结合，并根据育种目标，有选择地用性控X精子或Y精子进行体外受精，生产血统明确的良种奶牛胚胎；经移植后所产犊牛可以直接补充到高产奶牛核心群或者用于后备种公牛的选育。

Description

一种犊牛体外胚胎生产的方法

技术领域

本发明涉及一种胚胎体外生产的方法，具体地说，涉及一种犊牛体外胚胎生产的方法。

背景技术

JIVET(Juvenile In Vitro Embryo Transfer/Technology)技术即幼畜胚胎体外生产技术，是集幼畜超数排卵与采卵、卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养和胚胎移植等技术为一体的生物高新技术体系。JIVET技术不仅可以极大提高动物的繁殖潜能，而且还可以缩短世代间隔，加速遗传改良进程。

犊牛体外胚胎生产技术的研究源于20世纪50年代，Black等给未成年的小牛注射促性腺激素后，诱发了卵巢卵泡发育并获得发育正常的卵子，从而证明激素诱导也能使犊牛卵泡发育、排卵和受精。之后，很多学者就犊牛卵母细胞的发育能力进行了大量研究。20世纪90年代以后，人们对犊牛卵泡发育及胚胎体外培养进行了更为深入的研究。Armstrong等(1997)指出，无论是犊牛还是成年牛，卵母细胞在体外培养都能发育到囊胚，移植后都可以妊娠。Maneesh等(2000)对2～3月龄犊牛重复诱导采卵，结果指出供体牛在15月龄后繁殖性能基本正常，说明对犊牛进行激素处理、超排采卵对其发育影响不大或者没有影响。2005年Kauffold等首次报道，未经激素处理的不到2月龄的犊牛卵母细胞能够发育到囊胚，移植后产下正常犊牛。

目前，在国内有关犊牛JIVET技术的报道还较少，科农创新公司(2006)对犊牛JIVET进行了初步尝试。李瑞岐等(2009)对4～9周龄犊牛进行了超排，平均获得的卵母细胞数为25枚左右，70％(7/10)的个体对激素诱导反应良好。

影响犊牛JIVET技术的因素主要包括：

1、激素超排处理方法

性成熟前动物激素处理方法的建立主要以成年动物超数排卵技术为基础，虽然自然状况下性成熟前动物卵泡生长和发育的模式并不同于成年动物，但是同样能够受外源激素刺激而生长发育。

Armstrong等采用GnRH、hCG、FSH+LH 3种方法对犊牛进行激素处理，均获得了可用的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，但以FSH+LH方法获得的COCs数量较另外两种方法高。

2、体外培养体系

Revel等对3月龄犊牛卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养进行了研究，结果发现，受精率和卵裂率与成年牛差异不显著，但是，体外培养7d后囊胚率显著低于成年牛，同样妊娠率也显著低于成年牛，这说明犊牛卵母细胞中控制囊胚形成的一些关键因子可能尚未完全出现或表达。有学者指出，这可能是因为犊牛卵母细胞胞质存在缺陷造成的。

3、犊牛月龄

供体犊牛月龄对激素处理后卵泡数量和胚胎发育具有较大的影响。Majerus等的试验结果显示，荷斯坦犊牛在7～11月龄时的卵母细胞与成年牛卵母细胞发育能力相当。另外，其他一些对不同品种牛的试验结果也显示，供体在接近性成熟时，卵母细胞才与成年牛卵母细胞有相似的发育能力。Presicce等指出不经激素处理的犊牛卵母细胞发育能力与供体月龄相关，激素处理后可消除这种差异，说明激素处理可减弱年龄因素的影响。

4、犊牛个体差异

Maneesh等观察到供体牛间卵泡发育数量和胚胎发育能力存在很大的个体差异，个体间可用卵泡数变化范围为5～164枚，胚胎移植后，所有妊娠受体的胚胎均来自激素诱导卵泡发育好的个体。

个体差异的原因有多种，不仅受外源激素处理方法的影响，而且还因内源性激素的分泌水平不同而出现差异，不同的饲养方法也可能产生不同的结果。根据个体的重量调整卵泡激素处理的剂量可以在一定程度上改善性成熟前犊牛获得的卵母细胞的数量和质量。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的犊牛体外胚胎生产的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供一种犊牛激素超排的方法，其包括选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植CIDR(羊用)，分别在第5d和第6d注射FSH(Folltronpin-V)，第7d采用手术方法采卵，可以获得较多数量的可用卵母细胞，每次犊牛超排头均获得的可用卵母细胞数为48枚。

前述的方法，在第5d间隔12h注射FSH，注射剂量为40mg-45mg和30mg-35mg，第6d间隔12h注射FSH，剂量为30mg-35mg。优选在第5d间隔12h注射FSH，注射剂量为40mg和30mg，第6d注射剂量为30mg/12h。

本发明还提供一种高效的犊牛体外胚胎生产的方法，包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。具体方法为：

1)犊牛激素超排：选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH，第7d采卵，采集直径为3～6mm的卵泡液。

2)犊牛卵母细胞体外成熟：将步骤1)中得到的卵母细胞加入到成熟培养液中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养22-24h。

3)将得到的成熟犊牛卵母细胞进行体外受精。

4)受精卵在体外发育成胚胎。

前述的方法，步骤1)中在第5d间隔12h注射FSH，注射剂量为40mg-45mg和30mg-35mg，第6d间隔12h注射FSH，剂量为30mg-35mg。

前述的方法，步骤2)中成熟培养液的成分为：步骤2)中成熟培养液的成分为：TCM199+10mM HEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

前述的方法，步骤3)中受精时间为8h。

前述的方法，步骤4)包括：在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下，将受精卵置于前期发育培养液中培养48h，卵裂后移入后期发育培养液中继续培养，间隔2d半量换液一次，胚胎发育第7d、8d统计囊胚；

其中，所述CR I aa液为：114.7mM NaCl+3.1mM KCl+26.2mMNaHCO₃+10μg/ml苯酚红+1mM谷氨酸+0.4mM丙酮酸钠+5.5mM半乳酸钙+2％EAA+1％NEAA+141mM MgCl₂6H₂O+100IU/ml青链霉素；所述前期发育培养液为：CR I aa液+6mg/ml BSA，后期发育培养液的成分为：CR I aa液+10％FBS。

本发明的优点在于：

(1)本发明建立了一种高效的犊牛体外胚胎生产的方法，可以充分利用犊牛卵巢中卵母细胞作为丰富的胚源，对犊牛进行超排采卵。将其与奶牛性控技术相结合，并根据育种目标，有选择地用性控X精子或Y精子进行体外受精，生产血统明确的良种奶牛胚胎；经移植后所产犊牛可以直接补充到高产奶牛核心群或者用于后备种公牛的选育。

(2)本发明筛选了一套最佳外源促性腺激素诱导卵泡发育方案，包括最佳处理周龄、外源激素种类和剂量等。

(3)本发明建立了犊牛优质体外胚胎生产的技术规程，包括高效的卵母细胞体外成熟、体外受精、胚胎体外培养技术等。犊牛卵母细胞的体外成熟率达到85％，体外受精率达到80％，囊胚发育率达到35％。

(4)本发明采用含有半胱胺的卵母细胞体外成熟培养液进行培养，可以获得较高的囊胚发育率。

附图说明

图1为本发明较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发育获得的4-8细胞胚胎(显微镜下观察结果)。

图2为本发明较佳实施例犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发育获得的囊胚(显微镜下观察结果)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中体外胚胎生产的常规操作采用本领域技术人员熟知的方法和技术进行。实施例中的犊牛来自于北京奶牛中心良种场。

实施例1    犊牛激素超排及采卵

犊牛超排处理当天为第0d，用送栓器经阴道埋植羊用CIDR(羊用，产地新西兰)，分别在第5d(40mg、30mg)、6d(30mg、30mg)间隔12h注射FSH(FSH，商品名为Folltronpin-V，购自加拿大BionicheAnimal Health公司)，第7d采卵，同时撤栓。

每次犊牛超排头均获得的可用卵母细胞数为48枚。

实施例2    犊牛卵母细胞体外成熟

体外成熟操作前2h在6孔圆锥型培养板的每孔中放入适量成熟培养液(平均每枚卵母细胞10μl成熟培养液)，上覆盖矿物油，放入38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的培养箱中预平衡。其中，成熟培养液的成分为：TCM199+10mM HEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/mlLH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

将经过鉴定可用的卵母细胞放到预热的成熟培养液中，轻轻洗涤4遍后，移入预先在培养箱平衡2h的6孔圆锥型培养板的成熟液中，放入恒温培养箱中培养22h-24h。培养条件为38.5℃，5％CO₂，饱和湿度。

实施例3    犊牛卵母细胞体外受精

取细管(0.25ml)冻精(精液来源于北京奶牛中心种公牛冷冻精液)，置37℃水浴中停留约10s，直至有气泡上浮时即可取出，用面巾纸擦干，并用酒精棉球消毒细管；将预平衡2h的装有6ml受精液(114.0mM NaCl+4.02mM KCl+2.25mM CaCl₂.2H₂O+0.52mMMgCl₂6H₂O+0.83mM NaH₂PO₄H₂O+37.0mM NaHCO₃+13.9mM葡萄糖+0.5mM丙酮酸钠+3mg/ml BSA+10μg/ml苯酚红+100IU/ml青链霉素+10μg/ml肝素)的离心管从恒温培养箱中取出，将精液细管一端剪掉，插入离心管中再剪掉另一端直至精液全部进入离心管，轻轻转动离心管混匀。300-400g，离心5min。用移液管吸去上清液，管中留0.5ml左右即可，用手搓2～3次以使液体均匀。加入预平衡的受精液至总体积为6ml，用同样的方法再离心一次，最后留0.5ml液体，用手搓两次使其均匀，用受精液稀释最终受精浓度为5×10⁶/ml～1×10⁷/ml。

实施例4    犊牛卵母细胞体外发育

将受精后的卵子洗涤4次，吸卵管口径应与卵子直径大小接近，洗掉透明带上粘着的精子即可，不要将卵丘细胞全部洗掉以留下2层颗粒细胞为宜。将洗涤干净的卵子放入预先平衡2h的含有前期发育液(CR I aa液+6mg/ml BSA)的4孔培养板中，放回培养箱中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养48h，统计卵裂后转移至500μl后期发育培养液(CR I aa液+10％FBS)中继续培养，间隔2d半量换液一次。胚胎发育第7d、8d统计囊胚数量。图1和图2所示分别为本发明犊牛经激素超排后获得的卵母细胞，经体外受精后，发育获得的4-8细胞胚胎以及囊胚在显微镜下观察到的结果。

结果表明，犊牛卵母细胞的体外成熟率分别达到85％，体外受精率达到80％，囊胚发育率达到35％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

[1]Black W，Ulberg L，Christian RCL.Ovulation and fertilization in the hormone-stimulated calf[J].J.Agric.Sci，1953，36：274-280.

[2]Armstrong D T，Kotaras P j，Earl C R.Advances in production of embryos in vitro fromjuvenile and prepubertal oocytes from the calf and lamb.Reprod Fertil Dev，1997，9：333-339.

[3]Kauffold J，Amer HA，Bergfeld U，et al.Offspring from non-stimulated calves at an ageyounger than two months：a preliminary report[J].Journal of reproduction and development，2005，51(4)：527-32.

[4]李瑞岐，孙树春，田树军等.诱导荷斯坦犊牛卵泡发育及体外受精研究.畜牧兽医，2009，6：18-21.

[5]Armstrong D T，Holm P，Irvin B，et al.Pregnancies and live birth from in vitro fertilization ofcalf oocytes collected by laproscopic follicular aspiration[J].Theriogenology，1992；38，667～678.

[6]Armstrong DT，Irvine BJ，Earl CR，McLean D，Seamark RE.Gonadotropin stimulationregimens for follicular aspiration and in vitro embryo production from calfoocytes.Theriogenology，1994；42：1227-1236

[7]Revel F，Mermillod P，Peynot N，et al.Low developmental capacity of in vitro atured andfertilized oocytes from calves compared with that of cows[J].Reprod.ertil，1995；103(1)：115～20.

[8]Luberda Z.The role of glutathione in mammalian gametes.Biol Reprod，2005；5：5-17.

[14Presicce G A，Jiang S，Simkin M，et al.Age and hormonal dependence of acquisition of oocytecompetence for embryogenesis in prepubertal calves[J].Biol Reprod，1997，56：386～392.

[15]Rawlings N C，Evans A C，Honaramooz A，et al.Antral follicle growth and endocrinechanges in prepubertal cattle，sheep and goats[J].Anim Reprod Sci.2003，78(3-4)：259～70.

[16]Freret S，Grimard B，Ponter A A，et al.Reduction of body-weight gain enhances in vitroembryo production in overfed superovulated dairy heifers[J].Reproduction，2006，131：783～794.

Claims (8)

1.一种犊牛激素超排的方法，其特征在于，选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在第5d注射FSH，注射剂量为40mg-45mg，间隔12h再注射30mg-35mg，第6d注射FSH，剂量为30mg-35mg，间隔12h再注射同等剂量的FSH。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在第5d间隔12h注射FSH，注射剂量为40mg和30mg，第6d注射剂量为30mg/12h。

4.一种犊牛体外胚胎生产的方法，包括步骤：

1)犊牛激素超排：选用9-12周龄犊牛，经阴道埋植CIDR，分别在第5d和第6d注射FSH，第7d采卵；

2)犊牛卵母细胞体外成熟：将步骤1)中得到的卵母细胞加入到成熟培养液中，在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下培养22-24h；

3)将得到的成熟卵母细胞进行体外受精；

4)受精卵在体外发育成胚胎。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1)中在第5d间隔12h注射FSH，注射剂量为40mg-45mg和30mg-35mg，第6d间隔12h注射FSH，剂量为30mg-35mg。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中成熟培养液的成分为：TCM199+10mM HEPES+5％FBS+0.5μg/ml FSH+5μg/ml LH+1μg/ml E₂+27.5μg/ml丙酮酸钠+100IU/ml青链霉素+100μM半胱胺。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中受精时间为8h。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)包括：在38.5℃，5％CO₂，饱和湿度的条件下，将受精卵置于前期发育培养液中培养48h，卵裂后移入后期发育培养液中继续培养，间隔2d半量换液一次，胚胎发育第7d、8d统计囊胚数量；

其中，所述CR I aa液为：114.7mM NaCl+3.1mM KCl+26.2mMNaHCO₃+10μg/ml苯酚红+1mM谷氨酸+0.4mM丙酮酸钠+5.5mM半乳酸钙+2％EAA+1％NEAA+141mM MgCl₂6H₂O+100IU/ml青链霉素；所述前期发育培养液为：CR I aa液+6mg/ml BSA，后期发育培养液的成分为：CR I aa液+10％FBS。

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