CN110055212B - 一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物繁育领域，具体涉及一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法。该方法包括离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离，绵羊卵母细胞体外培养成熟，胞浆单精子注射ICSI，ICSI胚胎体外培养等步骤。本发明中所涉及的睾丸组织精子分离技术操作简单省时，不需要考虑杂细胞、精子数量和活力的因素，填补了利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎技术的空白。

Description

一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法
技术领域
本发明属于动物繁育领域，具体涉及一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法。
背景技术
优良的种质资源是牧业生产的重要项目，优良的种质资源是否能大量繁育决定着牧业经济效益的高低。以盘羊的繁育工作为例，盘羊野性大，主要分布于青海甘肃境内，属国家二级保护动物。盘羊具备适合做肉羊亲本的体型优势，且盘羊肉脂肪含量低、瘦肉率高、味道鲜美。利用野生盘羊优良的肉用性能优势对现有藏系绵羊品种进行杂交改良，培育适应青藏高原特殊生态环境、具有优秀肉用性能的绵羊新品系，会极大地促进高原农业动物种质创新。
现有技术中，制约优良品种动物繁育的重要原因是该品种胚胎供体数量不足，也就是说，优良品种动物数量本身不足，因此依靠自然交配方式进行繁育不能满足牧业生产需求。为了改变原有品种的生长特性，使优良品种动物数量增加，促进牧业的经济发展，需要开发一种盘羊睾丸组织精子生产体外胚胎的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，通过胞浆单精子注射(Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI)技术体外生产盘羊-绵羊杂交胚胎，能使优良品种动物数量增加，促进牧业的经济发展。
本发明提供的一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，包括以下步骤：
S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用
将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2-3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；
S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离
将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，置于37℃水浴中解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液液悬浮，制成精子悬液，备用；
S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟
从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；
S4，胞浆单精子注射ICSI
准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液液分别配制12g/100mL、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；
ICSI操作：取熟卵母细胞置于羊精子上浮液液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于G1发育液中准备进行孤雌激活处理；
S5，ICSI胚胎体外培养
孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d移入G2发育液中继续培养至7-8d，得到盘羊-绵羊杂交囊胚。
优选的，S4中，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液液注射滴4个、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴2个、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴4个和S2的精子悬液滴2个。
优选的，所述羊精子上浮液为HEPES-SOF液，10ml的HEPES-SOF液配方如下：胚胎培养水7.8ml，100×HEPES-SOF液1ml,10×NaHCO3溶液0.2ml，100×Na pyruvate溶液0.1ml，100×CaCl2·2H2O溶液0.1ml，100×Hepes溶液0.8ml；上述组分混匀后弃掉0.2ml，再加入0.2ml的FBS。pH值调至7.2-7.4；
100×HEPES-SOF液配方如下：NaCl 6.29g，KCl 0.534g，KH2PO4 0.162g，MgSO4·7H2O 0.182g，链霉素0.05g，青霉素0.065g，乳酸钠0.6ml，加胚胎培养水定容至100ml。
10×NaHCO3溶液配方：NaHCO3 0.221g溶于10ml胚胎培养水中。
100×Na pyruvate溶液配方：丙酮酸钠0.044g溶于10ml胚胎培养水中。
100×CaCl2·2H2O溶液配方：CaCl2·2H2O 0.262g溶于10ml胚胎培养水中。
100×Hepes溶液配方：Hepes 0.651g溶于10ml胚胎培养水中。
优选的，取外径1.0mm、内径0.75mm的毛细玻璃管用拉针仪制作注射针，注射针前端直径6-8μm，前端的弯曲角度为30度；取外径1.0mm、内径0.8mm的毛细玻璃管，用酒精灯拉制外径100-120μm的持卵针，持卵针前端口径20-30μm，持卵针前端的弯曲角度为30度。
优选的，所述冻存液由以下体积分数的液体混合而成：70％的高糖型DMEM液体培养基、20％的胎牛血清、10％的二甲基亚砜。
优选的，S2中，精子悬液在20倍显微镜下时，看到单个精子之间的距离大于等于0.3cm。
优选的，S3的具体步骤如下：将离体的绵羊卵巢用37℃预热的含有青霉素和链霉素的生理盐水清洗，剪去周围粘连组织；然后置于M199采卵液内，割破卵泡，使卵丘卵母细胞复合体从卵泡中释放出来，挑出卵丘卵母细胞复合体，并置于新的M199采卵液中，将挑出的卵丘卵母细胞复合体用体外成熟液清洗，38.5℃，5％CO2的培养箱中培养22-24h，挑出含有第一极体的成熟卵母细胞置于体外成熟液中，备用。
优选的，每升M199采卵液中含有9.5g M199培养基粉末、5mmol NaHCO3、10mmolHEPES、10mmol HEPES-Na、10mL FBS、0.01g肝素钠和100×青链霉素混合液，溶剂为超纯水。
优选的，每升体外成熟液中含有0.4mmol丙酮酸钠、10mL FBS、10mg促卵泡素FSH、10mg促黄体素LH、20μg表皮生长因子EGF、1mg雌二醇，溶剂为M199液体培养基。
与现有技术相比，本发明提供的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法至少具有以下有益效果：
1、本发明中所涉及的睾丸组织精子分离技术操作简单省时，不需要考虑杂细胞、精子数量和活力的因素。
2、本发明中所涉及的ICSI注射盘的制作和ICSI操作流程，通过尽量减少注射针在各操作滴之间的移动次数和距离，从而可尽快完成卵母细胞的注射，以减少卵子在外界环境中的时间，填补了利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎技术的空白。
附图说明
图1是ICSI注射盘的制作及注射针移动顺序；
图2是ICSI胚胎体外培养20小时后形成原核并排出第二极体的合子；
图2A是显微镜明场拍摄的发育至20h的ICSI胚胎；图2B显微镜紫外光激发的发育至20h的ICSI胚胎的细胞核和极体；图2A和图2B是同一个细胞；
图3是ICSI胚胎体外培养8d后形成的盘羊-绵羊杂交囊胚。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的试验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
实施例1
一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，包括以下步骤：
S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用
将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后用刀片进行纵切，将睾丸切成两半，将睾丸实质部分剪碎并置于含1ml冻存液的冻存管中，4℃放置2h后投入液氮中长期冷冻保存，备用。
所述冻存液由以下体积分数的液体混合而成：70％的高糖型DMEM液体培养基、20％的FBS(胎牛血清)、10％的DMSO(二甲基亚砜)。
S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离
将液氮中冻存的1管盘羊睾丸组织取出，迅速置于37℃水浴中解冻，冻存管变成液态即完成解冻。将解冻的睾丸组织吹打混匀后2000rpm离心10min，弃上清后加入1ml的羊精子上浮液(HEPES-SOF液)中吹打混匀后2000rpm离心10min，弃上清后再加入1ml的HEPES-SOF液。吹打混匀后吸取10μL上清液置于载玻片上显微镜下观察精子密度。如果精子密度太稠看不到单个的精子，用HEPES-SOF液稀释上清液，直至20倍显微镜下看到单个精子之间的距离大于等于0.3cm(显微镜下看到的距离)。最后用含12g/100ml聚乙烯吡咯烷酮的HEPES-SOF液进行1：1体积稀释，吸取10μL精子悬液用于ICSI操作。精子悬液中聚乙烯吡咯烷酮的浓度为6g/100ml。
本发明实施例施用的溶液配方如下：
100×HEPES-SOF液配方如下：NaCl 6.29g，KCl 0.534g，KH2PO4 0.162g，MgSO4·7H2O 0.182g，链霉素0.05g，青霉素0.065g，乳酸钠0.6ml，加胚胎培养水定容至100ml。
10×NaHCO3溶液配方：NaHCO3 0.221g溶于10ml胚胎培养水中。
100×Na pyruvate溶液配方：Na pyruvate(丙酮酸钠)0.044g溶于10ml胚胎培养水中。
100×CaCl2·2H2O溶液配方：CaCl2·2H2O 0.262g溶于10ml胚胎培养水中。
100×Hepes溶液配方：Hepes 0.651g溶于10ml胚胎培养水中。
HEPES-SOF液(10ml)配方如下：胚胎培养水7.8ml，100×HEPES-SOF液1ml,10×NaHCO3溶液0.2ml，100×Na pyruvate溶液0.1ml，100×CaCl2·2H2O溶液0.1ml，100×Hepes溶液0.8ml；上述组分混匀后弃掉0.2ml，再加入0.2ml的FBS；最后用5M的氢氧化钠或HCL调pH值至7.2-7.4。
需要说明的是，本实施例1中所用胚胎培养水为water for embryo transfer，sigma货号W1503；本领域技术人员实际操作过程中，也可将胚胎培养水替换为三蒸水。
S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟
将刚刚离体的绵羊卵巢置于37℃预热的生理盐水中2h内运回实验室，再用37℃预热的含有双抗的生理盐水清洗3遍，双抗分别为链霉素、青霉素，且链霉素、青霉素的浓度均为200单位/mL；剪去周围粘连组织。90mm平皿内倒上37℃预热的M199采卵液，夹取5-6个卵巢至平皿内，用无菌手术刀片将卵巢表面的卵泡割破，使卵丘卵母细胞复合体(COCs)从卵泡中释放出来，随后置于体视镜下，用玻璃针将COCs捡至新的M199采卵液中。捡出的COCs用体外成熟液清洗三遍，最后置于含有体外成熟液的四孔板中，每500μL体外成熟液中含35枚COCs，38.5℃，5％CO2的培养箱中培养22-24h至成熟(排出第一极体)。24h后将COCs置于含有0.1g/100mL透明质酸酶的DPBS(购买的商品化的磷酸盐缓冲液，pH7.0，Gibco货号14190-136)中，枪头吹打脱去颗粒细胞，挑出含有第一极体的卵母细胞置于体外成熟液中，含有第一极体的卵母细胞即为成熟卵母细胞，准备ICSI。
每升M199采卵液中含有9.5g M199培养基粉末、5mmol NaHCO3、10mmol HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、10mmol HEPES-Na(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸钠盐)、10mL FBS、0.01g肝素钠和100×双抗(市售的青链霉素混合液，Gibco货号15140-163)，溶剂为超纯水。
每升体外成熟液中含有0.4mmol丙酮酸钠、10mL FBS、10mg促卵泡素FSH、10mg促黄体素LH、20μg表皮生长因子EGF、1mg雌二醇，溶剂为M199液体培养基。
S4，胞浆单精子注射ICSI
准备ICSI注射盘：用HEPES-SOF液分别配制12g/100mL、6g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮溶液，充分溶解后过滤。取直径60mm的培养皿作为ICSI注射盘，分别制作10μL的HEPES-SOF液注射滴4个、12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴2个、6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴4个和S2制备的精子悬液滴2个，每个液滴上覆石蜡油。各液滴之间的距离尽量小，以相互之间不发生融滴为原则。
持卵针的制备：取外径1.0mm、内径0.8mm的毛细玻璃管，用酒精灯拉制外径100-120μm的持卵针，用断针仪将持卵针前端口径烧至20-30μm，断针仪80℃加热使持卵针前端的弯曲角度为30度。
注射针的制备：取外径1.0mm、内径0.75mm的毛细玻璃管用拉针仪制作注射针，注射针前端直径6-8μm。采用两步法拉制注射针，拉针仪参数：heat NO.1为95℃，heat NO.2为63℃。80rpm磨针1.5分钟，磨出45度斜面，再依次用体积分数1％氢氟酸、双蒸水和无水乙醇洗针，断针仪45℃加热使注射针前端的弯曲角度为30度。
ICSI操作：各吸取成熟卵母细胞置于HEPES-SOF液注射滴中，每个HEPES-SOF液注射滴放10枚成熟卵母细胞，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下。持卵针和注射针在安装之前先虹吸少部分的HEPES-SOF液。在4倍镜下以注射滴为参照调整持卵针和注射针的位置，之后先抬起持卵针；将注射针移至12g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹3-4遍后，注射针再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至HEPES-SOF液注射滴中，图1为ICSI注射盘的制作及注射针移动顺序，图1中箭头为注射针的移动方向。10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射，应在30min内完成10枚卵母细胞的注射。注射后将活的卵母细胞置于G1发育液(卵裂胚培养液G1，厂家Vitrolife,货号10128)中准备进行孤雌激活处理。
孤雌激活处理方式如下：注射后的卵母细胞用含10μM离子霉素的M199采卵液避光38.5℃孵育5min，然后在饱和湿度的培养箱中以20枚/65μL滴的密度再置于预平衡好的含有2mM N6,N6-二甲基氨基嘌呤的G1发育液滴培养4h，得到ICSI胚胎，培养条件38.5℃、5％CO2。
S5，ICSI胚胎体外培养
孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中，以20枚/65μL滴的密度置于预平衡好的G1发育液滴中继续培养，18-20h后观察原核形成和第二极体排出，参见图2，48h后观察胚胎的卵裂情况，培养条件38.5℃、5％CO2。48h后在G1发育液滴中加入体积分数10％FBS继续培养至72h，在第3d以20枚/65μL滴的密度移入预平衡好的G2发育液(囊胚培养液，厂家Vitrolife,货号10132)滴中继续培养至7-8d观察囊胚情况.，统计胚胎发育率。图3是ICSI胚胎体外培养8d后形成的盘羊-绵羊杂交囊胚。
实施例2
一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，与实施例1的方法基本相同，区别在于将S2改为如下步骤：
S2，睾丸组织穿刺分离精子
盘羊阴囊表面用体积分数75％酒精消毒处理，在精索处注射2ml的盐酸利多卡因麻醉剂，麻醉时注射器先往回抽看是否有血，若无血可直接将其注射进精索内。麻醉5min后睾丸穿刺。取20ml注射器，预先吸入5ml HEPES-SOF液。在穿刺点剪开阴囊和睾丸外膜，将针头插入睾丸后针管抽真空，来回抽送6次后慢慢往外拔，用吸力将生精小管带出，将睾穿组织转入15ml离心管中，室温离心2000r/min 10min。弃上清后加入1ml的HEPES-SOF液，吹打混匀后吸取10μL上清液中置于载玻片上显微镜下观察精子密度。如果密度太稠看不到单个的精子，用HEPES-SOF液再次稀释上清液，直至20倍显微镜下看到单个精子之间的距离大于0.3cm。之后用含12g/100ml聚乙烯吡咯烷酮的HEPES-SOF液进行1：1稀释，吸取10μL精子悬液用于ICSI操作。
HEPES-SOF液和含12g/100ml聚乙烯吡咯烷酮的HEPES-SOF液配方与实施例1相同。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (4)

1.一种利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，离体盘羊睾丸组织的冷冻保存，备用
将离体的盘羊睾丸组织剥去外膜后，将睾丸实质部分剪碎并置于含冻存液的冻存管中，4℃放置2-3h后投入液氮中长期冷冻保存，备用；
S2，冷冻盘羊睾丸组织中精子分离
将液氮中冻存的盘羊睾丸组织取出，解冻，将解冻的睾丸组织混匀后离心，弃上清，并用羊精子上浮液清洗沉淀，最后将沉淀用羊精子上浮液悬浮，制成精子悬液，备用；
所述羊精子上浮液为HEPES-SOF液，10ml的 HEPES-SOF液配方如下：胚胎培养水7.8ml，100×HEPES-SOF液1ml, 10×NaHCO3溶液0.2ml，100×Na pyruvate溶液0.1ml，100×CaCl2·2H2O溶液0.1ml，100×Hepes溶液0.8ml；上述组分混匀后弃掉0.2ml，再加入0.2ml的FBS，pH值调至7.2-7.4；
100×HEPES-SOF液配方如下：NaCl 6.29g，KCl0.534g，KH2PO40.162g，MgSO4·7H2O0.182g，链霉素 0.05g，青霉素0.065g，乳酸钠 0.6ml，加胚胎培养水定容至100ml；
10×NaHCO3溶液配方：NaHCO30.221g溶于10ml胚胎培养水中；
100×Na pyruvate溶液配方：丙酮酸钠0.044g溶于10ml胚胎培养水中；
100×CaCl2·2H2O溶液配方：CaCl2·2H2O0.262g溶于10ml胚胎培养水中；
100×Hepes溶液配方：Hepes0.651g溶于10ml胚胎培养水中；
S3，绵羊卵母细胞体外培养成熟
从离体的绵羊卵巢采集卵丘卵母细胞复合体，并培养至排出第一极体，得到含有第一极体的成熟卵母细胞，备用；
具体步骤如下：将离体的绵羊卵巢用37℃预热的含有青霉素和链霉素的生理盐水清洗，剪去周围粘连组织；然后置于M199采卵液内，割破卵泡，使卵丘卵母细胞复合体从卵泡中释放出来，挑出卵丘卵母细胞复合体，并置于新的M199采卵液中，将挑出的卵丘卵母细胞复合体用体外成熟液清洗，38.5℃，5% CO2的培养箱中培养22-24h，挑出含有第一极体的成熟卵母细胞置于体外成熟液中，备用；
每升M199采卵液中含有9.5g M199培养基粉末、5mmol NaHCO3、10 mmol HEPES、10 mmolHEPES-Na、10 mL FBS、0.01g肝素钠和100×青链霉素混合液，溶剂为超纯水；
每升体外成熟液中含有0.4 mmol丙酮酸钠、10 mL FBS、10 mg促卵泡素FSH、10 mg促黄体素LH、20 µg表皮生长因子EGF、1 mg 雌二醇，溶剂为M199液体培养基；
S4，胞浆单精子注射ICSI
准备ICSI注射盘：用羊精子上浮液分别配制12 g/100mL、6 g/100mL的聚乙烯吡咯烷酮溶液，取容器作为ICSI注射盘，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液注射滴、12 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴、6 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴和S2的精子悬液滴，每个液滴上覆石蜡油；
ICSI操作：取成熟卵母细胞置于羊精子上浮液注射滴中，将ICSI注射盘置于37℃恒温板的显微镜下，在4倍镜下将注射针移至12 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中反复吸吹几遍后，再移至精子悬液滴中，20倍镜下吸取单个精子，再移至6 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴中确定精子在针中的位置，并弹掉针壁上沾上的多余精子，最后将注射针移至羊精子上浮液注射滴中，10倍镜下用持卵针调整并固定卵母细胞，使第一极体处于12点钟或6点钟位置，将注射针内的精子推至针尖处，在3点钟方向进注射针，进注射针后先回吸少量的胞质后再注射精子，注射后将活的卵母细胞置于卵裂胚培养液G1中准备进行孤雌激活处理；
S5，ICSI胚胎体外培养
孤雌激活处理后的胚胎在饱和湿度的培养箱中继续培养，48h后在卵裂胚培养液G1液滴中加入体积分数10%FBS继续培养至72h，在第3d移入囊胚培养液中继续培养至7-8d，得到盘羊-绵羊杂交囊胚；
所述冻存液由以下体积分数的液体混合而成：70%的高糖型DMEM液体培养基、20% 的胎牛血清、10%的二甲基亚砜。
2.根据权利要求1所述的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，S4中，在ICSI注射盘上分别制作羊精子上浮液注射滴4个、12 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴2个、6 g/100mL聚乙烯吡咯烷酮滴4个和S2的精子悬液滴2个。
3.根据权利要求1所述的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，取外径1.0mm、内径0.75mm的毛细玻璃管用拉针仪制作注射针，注射针前端直径6-8μm，前端的弯曲角度为30度；取外径1.0mm、内径0.8mm的毛细玻璃管，用酒精灯拉制外径100-120μm的持卵针，持卵针前端口径20-30μm，持卵针前端的弯曲角度为30度。
4.根据权利要求1所述的利用盘羊睾丸组织精子体外生产胚胎的方法，其特征在于，S2中，精子悬液在20倍显微镜下时，看到单个精子之间的距离大于等于0.3cm。
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