CN113943697B - 非人动物的眼房水的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了非人动物的眼房水的应用。本发明所提供应用为非人动物的眼房水在制备哺乳动物卵母细胞体外成熟培养用的体外胚胎培养液中的应用，以及非人动物的眼房水在作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养用的体外胚胎培养液中的应用。实验证实，动物眼房水可以作为体外胚胎培养液的基础液，且眼房水和CR1aa培养液按体积比1:1混合培养所得的体外胚胎培养液培养后，牛体外受精胚胎囊胚质量相比于单独使用眼房水或CR1aa培养液培养的胚胎更好。

Description

非人动物的眼房水的应用

技术领域

本发明具体涉及非人动物的眼房水的应用。

背景技术

家畜胚胎的体外生产技术（IVP）是胚胎工程研究领域的一项关键技术，是研究发育生物学、动物生殖生理学的基础，同时体外胚胎生产技术对于促进家畜遗传进展、保存稀有物种和胚胎商业化生产提供了技术保障[1]。

目前在牛、羊的体外胚胎生产中，国内外学者己经开发出了多种体外发育培养液，如TCM199[2]，输卵管合成液（synthetic oviduct fluid，SOF）[3]，CR1［4］等。然而，当前无论从胚胎形态还是物质代谢方面，体外培养的胚胎在质量上都还达不到体内胚胎的水平[5]。例如在牛的体外胚胎培养中，目前最常使用的培养液为（CR1aa和SOF液），所培养的牛体外受精的囊胚发育率较低，而且胚胎质量也远不及体内胚胎，导致胚胎移植受体后的妊娠率低，因此如何提高囊胚发育率及胚胎质量成为体外受精胚胎生产的重点和研究的焦点。

通常情况下，大多数学者对于评价体外胚胎质量的优劣以及后期发育潜力，主要是通过在显微镜下观察胚胎在特定发育时期下的形态是否正常，发育过程是否符合培养日龄，胚胎卵裂率及囊胚发育率以及囊胚总细胞数等指标来评判。同时通过对体外生产的囊胚细胞进行滋养层细胞（TE）和内细胞团细胞（ICM）的差异染色方法，对不同培养体系下的囊胚细胞进行内细胞团细胞和滋养层细胞分染，统计各自细胞数和比例，直观判断囊胚的质量，也是一个有效的方法。并且此种方法近年来己在多种动物的胚胎质量鉴定中被广泛采用[6]。

发明内容

针对于背景技术中存在的问题与限制，本发明拟解决的技术问题是如何提高体外胚胎的生产效率。

本发明首先提供非人动物的眼房水在制备哺乳动物卵母细胞体外成熟培养用的体外胚胎培养液中的应用。

本发明还提供非人动物的眼房水在作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养用的体外胚胎培养液中的应用。

上述应用中，所述体外胚胎培养液为以眼房水和CR1aa培养液按体积比1：1混合而成。

上述应用中，所述CR1aa培养液的配制方法如下：将氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、丙酮酸钠、酚红、乳酸钙、牛血清白蛋白、BME、MEM、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素溶于水得到CR1aa培养液，使CR1aa培养液中氯化钠的浓度为114.7 mM、氯化钾的浓度为3.1 mM、碳酸氢钠的浓度为26.2 mM、丙酮酸钠的浓度为20.4 mM、酚红的浓度为1μL /mL、乳酸钙的浓度为5mM、牛血清白蛋白的浓度为3mg/mL、必需氨基酸（BME）的浓度为20μL/mL、非必需氨基酸（MEM）的浓度为10μL/mL、L-谷氨酰胺（L-Glutamin）的浓度为1 mmol/L、青霉素和链霉素的浓度均为1 %（具体青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为100μg/mL）。

上述应用中，所述非人动物的眼房水来自家畜动物，包括且不限于牛、羊、猪等。

本发明还保护一种体外受精胚胎培养的方法，包括将非人动物的眼房水用于非人哺乳动物体外受精胚胎培养。

上述方法中，所述非人动物的眼房水作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时体外胚胎培养液的组成成分。

上述方法中，所述体外胚胎培养液为前述的体外胚胎培养液。

上述体外胚胎培养液或上述体外受精胚胎培养的方法在动物人工辅助生殖中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述动物为非人哺乳动物，包括且不限于牛、羊、猪等。

眼房水是一种由睫状体上皮细胞分泌的透明细胞外液，它维持眼内压和眼球的外形，并且负责营养没有血管生长的角膜、晶状体和小梁网，因此眼房水中含有大量的细胞所需各种营养物质（均衡的氨基酸，丰富的维生素，高纯度血清等）及富含抗氧化成分，且房水中分布的蛋白质在数量和性质两方面都不同于血浆中的蛋白质。目前，在人眼的房水中己经发现了若干种生长因子，例如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白（Tf）[7]等。这些营养成分、抗氧化成分及细胞因子，对于胚胎的发育均具有非常重要的作用。

本发明提供了一种全新的体外受精胚胎培养的方法。本发明经大量的实验研究证实，动物眼房水可以作为体外胚胎培养液的基础液，且眼房水和CR1aa培养液按体积比1:1混合培养所得的体外胚胎培养液培养后，牛体外受精胚胎囊胚质量相比于单独使用眼房水或CR1aa培养液培养的胚胎更好。

附图说明

图1为BO洗精液的溶质浓度。

图2为BO受精液的溶质浓度。

图3为CR1aa培养液的溶质浓度。

图4为不同培养液对牛体外受精胚胎发育率的影响，其中，同列中不同上标小写字母表示存在显著差异(P <0.05)。

图5为不同培养液对牛体外受精胚胎发育细胞数的影响，其中，同列中不同上标小写字母表示存在显著差异(P <0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、材料。

以下实施例中，牛卵巢购自河北省大厂县的屠宰场。

以下实施例中，牛冷冻精液购自北京奶牛中心。

2、试剂。

以下实施例中，TCM199粉末（31100035）、L-谷氨酰胺（A2916801）、胎牛血清（FBS，货号10100-147）、必需氨基酸（11130051）、非必需氨基酸（11140076）、PBS液（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline，货号14190144）、青霉素-链霉素（15140163，含10,000 单位/mL 青霉素和10,000 µg/mL 链霉素的溶液）是ThermoFisher公司产品。

以下实施例中，促卵泡素（FSH）（F8174-1VL）、雌激素（E₂，货号E2758）、促黄体素（LH，货号L5269-1）、丙酮酸钠（P4562）、牛血清白蛋白（BSA）（10735086001）、咖啡因（C0750）、肝素（H3149）、酚红（Phenol Red，货号P3532）、乳酸钙（C1000）、Triton（93443）、PI（碘化丙碇，货号P4864）、Hoechst 33342（14533）均为Sigma-Aldrich公司产品。

3、溶液。

以下实施例中，卵母细胞成熟培养液（配方为：TCM199+10μg/ml FSH+1μg/ml E₂+1μg/ml LH+10% FBS+ 100U/mL penicillin+ 100μg/mL streptomycin）的具体配制方法如下：以TCM199培养基为基础培养基，添加促卵泡素（FSH）、雌激素（E₂）、促黄体素（LH）、胎牛血清（FBS）、青霉素（penicillin）和链霉素（streptomycin），使卵母细胞成熟培养液中促卵泡素（FSH）的浓度为10μg/ml、雌激素（E₂）的浓度为1μg/ml、促黄体素（LH）的浓度为1μg/ml、胎牛血清（FBS）的体积百分含量为10%、青霉素-链霉素的体积百分含量为1%

以下实施例中，以下实施例中，BO洗精液的溶剂为水，溶质如图1。将图1中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，BO受精液的溶剂为水，溶质如图2。将图2中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，CR1aa培养液的溶剂为水，溶质如图3。将图3中的试剂依次按照浓度要求加入水中，调PH值至7.2-7.4，0.2μm滤器过滤后分装，负4度冰箱保存，保质期1个月。

以下实施例中，体外胚胎培养液（配方为：CR1aa+5%FBS）的具体配制方法为：在CR1aa中加入FBS，使体外胚胎培养液中FBS的体积百分含量为5%，即得到体外胚胎培养液。

以下实施例中，含1 % Triton和100μg/mL PI 的PBS的配制方法为：在PBS液（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline）中添加Triton和PI，使Triton的体积百分含量为1%，PI的浓度为100μg/mL。

以下实施例中，固定液（配方为：含25μg/mL Hoechst 33342 的100 %的乙醇）的配制方法为：在100 %的乙醇中添加Hoechst 33342，使固定液中Hoechst 33342的浓度为25μg/mL。

以下实施例中各处理重复至少三次以上，所得数据以平均值±标准误表示，并对实验数据平均值进行ANOVA显著性分析，p<0.05统计为是差异显著，P<0.01统计为差异极显著，检验结果用字母法表示。

实施例1 牛眼房水的采集及体外胚胎培养液的配制

本实施例比较3种体外胚胎培养液（CR1aa+5%FBS培养液；眼房水培养液；CR1aa和眼房水各占50%混合培养液）分别培养牛体外受精胚胎对胚胎发育程度的影响，对囊胚细胞计数、内细胞团和滋养层细胞比例的影响。具体步骤如下。

1、眼房水的采集。

屠宰场对待宰牛进行电击，击晕后立即进行眼房水的抽取，用5ml无菌注射器，针头从正对眼球45度角方向，轻柔插入眼房，抽取其中眼房水，直至眼球塌陷。然后将眼房水立即转移至无菌离心管中，封口后置于冰盒中，拉回实验室，在超净工作台中，用0.22μM滤膜滤器过滤除菌后分装备用。

2、牛卵母细胞的采集和体外成熟。

屠宰后采集牛卵巢于37℃加双抗（100U/mL 青霉素+100μg/mL 链霉素）的生理盐水中，2-4h内送到实验室。随后用37℃灭菌生理盐水冲洗，置于38.5℃的恒温板上水浴保温。用10mL注射器抽吸直径2mm-8mm 卵泡中的卵泡液（COCs含于其中），将抽取的卵泡液置于提前划线的6cm培养皿中。收集含3层以上卵丘细胞的卵丘－卵母细胞复合体（COCs），用PBS清洗3次，卵母细胞成熟培养液洗2次，移入装有卵母细胞成熟培养液的四孔板，每孔放卵母细胞50枚左右。38.5℃、5 % CO₂ 培养箱中成熟培养22-24h。

3、体外受精程序及体外受精胚胎的培养。

用受精液在一次性塑料培养皿上形成体积为80-100 μL的受精小滴，盖上石蜡油后放入38.5℃、5 % CO₂ 培养箱中预热2小时。

将储存在液氮罐中的牛冷冻精液解冻，然后用洗精液洗涤获能后备用。

将成熟培养22小时后的牛卵母细胞和洗涤获能后的精子一同放入受精小滴，在38.5℃、5 % CO₂ 的环境内，精卵共孵育6-8小时，然后去除卵母细胞周围的卵丘细胞和残余精子，观察卵母细胞第二极体排出情况，并以此为依据统计卵母细胞受精率。

将受精后卵母细胞移入体外胚胎培养液，体外胚胎培养液设为3种。

CR1aa+5%FBS培养液（简写为：CR1aa+5%FBS）的具体配制方法如下：在CR1aa培养液中添加胎牛血清（FBS），使CR1aa+5%FBS培养液中胎牛血清（FBS）的体积百分含量为5%。

眼房水培养液（简写为：眼房水）即步骤1中过滤除菌后的眼房水。

CR1aa和眼房水各占50%混合培养液（简写为：眼房水+CR1aa）：将CR1aa培养液和步骤1中过滤除菌后的眼房水按照体积比1:1混合而成的培养液。

以上述3种体外胚胎培养液分别培养牛体外受精胚胎，均重复至少三次以上。在38.5℃、5 % CO₂的培养箱中培养继续培养7-9天。受精后48小时观察统计卵裂情况，第6-8天观察统计囊胚发育情况。

详细数据见图4，眼房水+CR1aa在卵裂率、桑椹胚率、囊胚率和孵化囊胚率上均高于其它2组培养液( P <0.05) ，眼房水组在卵裂率、桑葚胚率、囊胚率和孵化囊胚率率上均比CR1aa+5%FBS组稍低，其中桑葚胚和囊胚发育率两组间差异显著，但卵裂率和孵化囊胚率两组间差异不显著( P >0.05) 。

上述结果表明，眼房水可以单独作为牛体外受精胚胎发育的培养液，但是与CR1aa培养液按照体积比1:1混合使用，胚胎发育情况更好。

根据Thouas 等[8]囊胚简易差异染色的方法加以改进，将培养至第7d 的牛体外受精扩张囊胚放入含1 % Triton和100μg/mL PI 的PBS中孵育15-20 s，然后立即转入固定液中于4℃过夜，然后直接转移到甘油中，吸取少量的甘油和胚胎一起置于载玻片上，用盖玻片覆盖并轻压，最后置于荧光显微镜下观察并统计囊胚滋养层细胞（TE）与内细胞团细胞（ICM）的数量和比例。

结果见图5：眼房水+CR1aa培养的囊胚总细胞数、内细胞团（ICM）细胞数和滋养层（TE）细胞数均显著高于其他两组培养液的囊胚（P <0.05），说明该培养基培养的囊胚发育质量最好。

综上，动物眼房水可以作为体外胚胎培养液的基础液，且眼房水和CR1aa培养液按体积比1:1混合培养所得的体外胚胎培养液培养后，牛体外受精胚胎的体外发育效率及囊胚质量相比于单独使用眼房水或CR1aa培养液培养的胚胎更好。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

参考文献。

[1] Cognie Y, Guerin Y, Poulin N et al.Current status of embryotechnologies in sheep and goat [J] . Theriogenology .2003, 59 :171-188。

[2] Wani NA.In vitro maturation and in vitro ferti lization of sheepoocytes[ J] .Small Rum Res .2002, 44 :89 -95。

[3] Wang S , Liu Y, Holyoak GR, et al.A protocol for in vit romaturation and fertilization of sheep oocytes[ J] .Small Rum Res, 1998, 29 :83-88。

[4] Rosenkrans CF, Zeng GQ, McNamara GT, et al.Development of bovineembryos in vitro as affected by energy substrates[ J] .Biol Reprod .1993, 49:459-462。

[5] Palmer E, Bezard J, Magistrini M et al.In vitro fertilization inthe horse:A retrospective study[ J] .J Reprod Fert, 1991, 44 :375 -384。

[6] Stojkovi c M, ButtnerM, Zakhart chenko V, et al.A reliableprocedure for differential staining of in vitro produced bovine blastocysts :comparison of tissue culture medium 199 and Menezo' s B2 medium[ J] .AnimReprod Sci, 1998, 50 :1-9。

[7] Inada K, Baba H, Okamura R. Quantitative determination of humanaqueous proteins by crossed immunoelectrophoresis[J] Japanese Journal ofOphthalmology. 1984, 28 1-8。

[8] Thouas G, Korfiatis N, French A, et al.Simplified chemicaltechnique for differential staining of mouse and bovine blastocysts[ J].Reprod Biomed Online, 2001b, 3 :25 -29。

Claims (4)

1.非人动物的眼房水在制备哺乳动物卵母细胞体外成熟培养用的体外胚胎培养液中的应用；所述体外胚胎培养液为以眼房水和CR1aa培养液按体积比1：1混合而成；

所述CR1aa培养液的配制方法如下：将氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、丙酮酸钠、酚红、乳酸钙、牛血清白蛋白、必需氨基酸、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素溶于水得到CR1aa培养液，使CR1aa培养液中氯化钠的浓度为114.7 mM、氯化钾的浓度为3.1 mM、碳酸氢钠的浓度为26.2 mM、丙酮酸钠的浓度为20.4 mM、酚红的浓度为1μL /mL、乳酸钙的浓度为5mM、牛血清白蛋白的浓度为3mg/mL、必需氨基酸的浓度为20μL/mL、非必需氨基酸的浓度为10μL/mL、L-谷氨酰胺的浓度为1 mmol/L、青霉素的浓度为100U/mL，链霉素的浓度为100μg/mL；

所述非人动物的眼房水来自牛。

2.一种体外受精胚胎培养的方法，其特征在于：将非人动物的眼房水用于非人哺乳动物体外受精胚胎培养；所述非人动物的眼房水作为哺乳动物卵母细胞体外成熟培养时体外胚胎培养液的组成成分；所述体外胚胎培养液为权利要求1中所述的体外胚胎培养液。

3.权利要求1项中所述的体外胚胎培养液在非人动物人工辅助生殖中的应用。

4.权利要求2所述的体外受精胚胎培养的方法在非人动物人工辅助生殖中的应用。

Images