CN105259007B - 一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 - Google Patents
一种牛体外受精囊胚双重染色的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种牛体外受精囊胚双重染色的方法，它是将培养至7~9d的牛体外受精囊胚用0.5%链蛋白酶处理囊胚55s，后于PBS中洗2~3遍，在100µg/mlPI (1%TritonX‑100/PBS) 中染色20s，于PBS中洗2~3遍后移入45µg/ml Hoechst33342中染色50s，用PBS洗2~3遍后进行压片。压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相。囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层(TE)细胞细胞核呈红色。本染色方法3min即可完成染色，而以前的报道中最少需要47min。因此大大降低了囊胚双重染色所需时间，提高了效率，从而可快速对牛囊胚质量做出评价。
Description
技术领域
本发明属于牛体外受精生物技术领域，涉及牛体外受精囊胚的质量评价方法，更具体的说是一种简便、快速的牛囊胚双重染色方法。
背景技术
自从牛IVP体系的成功建立开始，人们试图从不同的角度对这一体系进行改进，
例如改变培养系统、添加脂质代谢调节因子(lipid metabolic regulators).、添加cAMP调节因子(Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) modulators)等，但和体内胚胎相比牛体外胚胎的质量仍然较差，不仅囊胚细胞数较少而且移植妊娠率也不高。这使得人们认识到提高牛胚胎质量的必要性，为此胚胎质量的检验逐渐成为评估体外培养体系好坏的重要指标之一。与传统单一染色方法相比，双重染色方法能清晰的将囊胚内细胞团(ICM)和滋养层细胞(TE)区分开来，在评估上具有更高的准确性。目前的囊胚双重染色方法是在Thous等利用TritonX-100对囊胚双重染色的基础上建立起来的, 但是存在的最大问题是程序繁琐，每步染色花费时间多，整个染色程序下来最少在47min以上，因此染色时间长（李瑞岐, 桑润滋. 以囊胚双重染色方法检验果糖对牛胚胎早期发育效果的影响[J].中国畜牧杂志, 2010 (9): 23-25；李 荣,刘 颖,赵兴波,等.无血清培养基IVD101和G1/G2在牛体细胞核移植中的应用研究[J].畜牧兽医学报,2008,39(11) :1487-1492； Thouas GA, Korfiatis N A, French A J, et al. Simplified technique for differentialstaining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovineblastocysts[J]. Reproductive biomedicine online, 2001, 3(1): 25-29.）。
通常在评价囊胚质量时，因胚胎日龄、发育阶段不同，需要对胚胎进行分类，多批次染色，因此染色花费时间长，效率低，并可能影响染色的效果。
为了降低囊胚双重染色所需时间，提高效率，我们经过试验摸索，对牛体外受精囊胚的双重染色步骤进行了优化，3min即可完成染色，而以前的报道中最少需要47min。因此大大降低了囊胚双重染色所需时间，提高了效率。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了一种牛体外受精囊胚双重染色的方法，包括（1）卵母细胞的采集；（2）体外成熟培养；（3） 体外受精；（4） 胚胎的体外培养；（5）囊胚双重染色五个步骤，其特征在于步骤（5）囊胚双重染色: 它是将培养至7-9d的牛囊胚用0.5%（w/w）Pronase (链霉蛋白酶) 处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液) 中洗2-3遍，在100µg/ml PI（碘化丙啶） (1%TritonX-100 （聚乙二醇辛基苯基醚） /PBS) 中染色20s，于PBS中洗2-3遍后移入45µg/ml Hoechst33342（双苯酰亚胺）中染色50s，用PBS洗2-3遍后进行压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层(TE)细胞细胞核呈红色。
本发明更加详细的描述如下：
1.卵母细胞的采集
牛卵巢取自屠宰场，卵巢置于37℃加有青霉素、链霉素的生理盐水中，2~3h运回实验室，除尽周围脂肪组织，然后用加有青霉素、链霉素的生理盐水冲洗5~6次，用采卵液抽吸法吸取直径2～8mm的卵泡，根据实验不同的需求挑选裸卵、半裸卵及具有三层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)用于试验；
采卵液：TCM-199(组织培养基) +5% FBS(胎牛血清)+30µg/ml Heparin(肝素钠)+4.766g/l Hepes (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)
2.体外成熟培养
将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40-60个移入平衡至少2h的1ml成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23~24h；若卵丘细胞共培养则用微滴法（100µl），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志；
成熟液：TCM-199+10% FBS+10µg/ml FSH(促卵泡激素)+20µg/ml LH(促黄体素)+1µg/ml E2（雌二醇）；
3. 体外受精
受精液为IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides ,Yamagata, Japan，用直接离心法对精子进行洗涤，即用6ml受精液稀释解冻的精液并于2000r/min下离心7分钟，弃去上清液，重复一次后用受精液稀释精子，密度为1×106~6×106个/ml，然后放入CO2培养箱中备用，IVF-100受精时间为6h；
4.胚胎的体外培养
将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用1ml移液管部分或全部去除周围的卵丘细胞，以10枚假定受精卵/100µl微滴将假定受精卵随机平等的移入平衡至少2h的微滴中进行体外培养，从体外受精开始算起，第48h对各组卵裂率进行观察与记录，第7-9d对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液，胚胎培养液为CR1aa。
．囊胚双重染色
我们对传统的囊胚双重染色方法进行了改进，最重要的改进就是在保证染色效果的前提下，缩短相应步骤的操作时间，具体方法如下：将培养至7~9d的牛囊胚用0.5%Pronase (链霉蛋白酶) 处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液) 中洗2~3遍，在100µg/ml PI（碘化丙啶） (1%TritonX-100 （聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS) 中染色20s，于PBS中洗2~3遍后移入45µg/ml Hoechst33342（双苯酰亚胺）中染色50s，用PBS洗2~3遍后进行压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层(TE)细胞细胞核呈红色。
本发明重点解决了传统的囊胚双重染色法，相应步骤染色处理时间多，造成整个染色程序时间长，效率低的问题。本发明的简便、快速的牛囊胚双重染色法就是优化每一步染色步骤，在保证染色效果的前提下，尽量缩短染色时间，从而整体减少囊胚双重染色时间，这一结果为简便、快速评价囊胚质量奠定了基础。
本发明公开的简便、快速的牛囊胚双重染色法与现有的技术相比所具有的优点在于：
通过优化牛体外受精囊胚的双重染色的每一步骤，在保证染色效果的前提下，尽量缩短染色时间，3min即可完成染色，而以前的报道中最少需要47min。因此大大降低了囊胚双重染色所需时间，提高了效率，从而可快速对牛囊胚质量做出评价。
附图说明：
图1为改进的囊胚双重染色效果图。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，使本领域专业技术人员更好的理解本发明。实施例仅为解释性的，绝不意味着它以任何方式限制本发明的范围。特别加以说明的是：
TCM199（组织培养基）、FCS（胎牛血清）、PBS（磷酸缓冲液）购自Gibco公司；FSH（促卵泡激素） 、LH（促黄体素）购自宁波激素制品厂；17β-E2（雌二醇）、Hochest33342（双苯酰亚胺） 、Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）、PI（碘化丙啶）、Hepes (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、 Heparin（肝素钠）、 Pronase (链霉蛋白酶) 购自Sigma公司；IVF-100 受精液购自Research Institute for the Functional Peptides , Yamagata, Japan。
实施例1：
1．材料与方法
1.1 卵母细胞的采集
牛卵巢取自屠宰场，卵巢置于37℃加有青霉素、链霉素的生理盐水中，2~3h运回实验室，除尽周围脂肪组织，然后用加有青霉素、链霉素的生理盐水冲洗5~6次，用采卵液抽吸法吸取直径2～8mm的卵泡，根据实验不同的需求挑选裸卵、半裸卵及具有三层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)用于试验；
采卵液：TCM-199(组织培养基) +5% FBS(胎牛血清)+30µg/ml Heparin(肝素钠)+4.766g/l Hepes (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)
1.2 体外成熟培养
将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40-60个移入平衡至少2h的1ml成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23~24h；若卵丘细胞共培养则用微滴法（100µl），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志；
成熟液：TCM-199+10% FBS+10µg/ml FSH(促卵泡激素)+20µg/ml LH(促黄体素)+1µg/ml E2（雌二醇）；
1.3 体外受精
受精液为IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides ,Yamagata, Japan，用直接离心法对精子进行洗涤，即用6ml受精液稀释解冻的精液并于2000r/min下离心7分钟，弃去上清液，重复一次后用受精液稀释精子，密度为1×106~6×106个/ml，然后放入CO2培养箱中备用，IVF-100受精时间为6h；
1.4胚胎的体外培养
将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用1ml移液管部分或全部去除周围的卵丘细胞，以10枚假定受精卵/100µl微滴将假定受精卵随机平等的移入平衡至少2h的微滴中进行体外培养，从体外受精开始算起，第48h对各组卵裂率进行观察与记录，第7-9d对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液，胚胎培养液为CR1aa。
改进的囊胚双重染色
我们对传统的囊胚双重染色方法进行了改进，最重要的改进就是在保证染色效果的前提下，缩短相应步骤的操作时间，具体方法如下：将培养至7~9d的牛囊胚用0.5%Pronase (链霉蛋白酶) 处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液) 中洗2~3遍，在100µg/ml PI（碘化丙啶） (1%TritonX-100 （聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS) 中染色20s，于PBS中洗2~3遍后移入45µg/ml Hoechst33342（双苯酰亚胺）中染色50s，用PBS洗2~3遍后进行压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层(TE)细胞细胞核呈红色。
与Hochest 33342单染色的比较
对体外培养的7~9天的囊胚，用Hochest 33342进行单染色，计算囊胚细胞总数，并与改进的囊胚双重染色获得的细胞数进行比较。
2. 结果与分析
经过改进的囊胚双重染色方法，45µg/mlHoechst33342中染色30-50s，在100µg/mlPI (1%TritonX-100/PBS)中染色20s，染色结果见图1，ICM细胞染为蓝色，TE细胞染为红色，界限较为明显。对染色后数据进行统计见表1。囊胚细胞总数比Hoechst33342单染色略高，但差异不显著(P>0.05)，表明改进的囊胚双重染色方法用于确定囊胚细胞总数的结果是可靠的。
表1. 改进的囊胚双重染色方法与单染色法的比较
注：经卡方检验，囊胚细胞总数之间没有显著差异(P>0.05)。
实施例2
1．材料与方法
1.1 卵母细胞的采集
牛卵巢取自屠宰场，卵巢置于37℃加有青霉素、链霉素的生理盐水中，2~3h运回实验室，除尽周围脂肪组织，然后用加有青霉素、链霉素的生理盐水冲洗5~6次，用采卵液抽吸法吸取直径2～8mm的卵泡，根据实验不同的需求挑选裸卵、半裸卵及具有三层及其以上卵丘的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes，COCs)用于试验；
采卵液：TCM-199(组织培养基) +5% FBS(胎牛血清)+30µg/ml Heparin(肝素钠)+4.766g/l Hepes (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)
1.2 体外成熟培养
将收集的卵母细胞用成熟液洗3遍，然后每40-60个移入平衡至少2h的1ml成熟液中（四孔板），于5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度的CO2培养箱中培养23~24h；若卵丘细胞共培养则用微滴法（100µl），以排出第一极体为卵母细胞成熟的标志；
成熟液：TCM-199+10% FBS+10µg/ml FSH(促卵泡激素)+20µg/ml LH(促黄体素)+1µg/ml E2（雌二醇）；
1.3 体外受精
受精液为IVF-100 (Research Institute for the Functional Peptides ,Yamagata, Japan，用直接离心法对精子进行洗涤，即用6ml受精液稀释解冻的精液并于2000r/min下离心7分钟，弃去上清液，重复一次后用受精液稀释精子，密度为1×106~6×106个/ml，然后放入CO2培养箱中备用，IVF-100受精时间为6h；
1.4胚胎的体外培养
将经体外受精的假定受精卵用胚胎培养液洗3遍，并用1ml移液管部分或全部去除周围的卵丘细胞，以10枚假定受精卵/100µl微滴将假定受精卵随机平等的移入平衡至少2h的微滴中进行体外培养，从体外受精开始算起，第48h对各组卵裂率进行观察与记录，第7-9d对各组囊胚率进行观察与记录，中途不进行换液，胚胎培养液为CR1aa。
改进的囊胚双重染色
我们对传统的囊胚双重染色方法进行了改进，最重要的改进就是在保证染色效果的前提下，缩短相应步骤的操作时间，具体方法如下：将培养至7~9d的牛囊胚用0.5%Pronase (链霉蛋白酶) 处理囊胚55s，后于PBS (磷酸缓冲液) 中洗2~3遍，在100µg/ml PI（碘化丙啶） (1%TritonX-100 （聚乙二醇辛基苯基醚）/PBS) 中染色20s，于PBS中洗2~3遍后移入45µg/ml Hoechst33342（双苯酰亚胺）中染色50s，用PBS洗2~3遍后进行压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层(TE)细胞细胞核呈红色。
与传统的双重染色方法的比较
用改进的囊胚双重染色法对体外培养的7~9天的囊胚进行染色，并与文献中报道的三种传统染色方法各个步骤所需时间，及囊胚内细胞团细胞数占囊胚细胞总数的比例进行比较。
结果与分析
经过改进的囊胚双重染色方法，在链酶蛋白酶处理55s，45µg/mlHoechst33342中染色30-50s，在100µg/ml PI (1%TritonX-100/PBS)中染色20s，整个染色程序仅用了3分钟，而传统的三种牛囊胚双重染色方法分别用了＞47min、＞1h 16min、＞12h，说明我们改进的囊胚双重染色方法极大地缩短了染色时间（结果见表2），提高了染色效率，达到了快速评价囊胚质量的目的。
表2. 改进的囊胚双重染色方法与传统方法所需时间比较
注：经卡方检验，囊胚细胞总数之间没有显著差异(P>0.05)。
改进的囊胚双重染色结果见图1，ICM细胞染为蓝色，TE细胞染为红色，界限较为明显。经统计囊胚细胞总数为93.00±10.50，内细胞团细胞数为31.00±5.94，内细胞
团细胞占囊胚细胞总数的比例为33.56±7.39%，与传统染色方法的方法一、方法二的31%、33+14.8% 接近（表3），说明改进的囊胚双重染色方法在检测内细胞细胞所占囊胚细胞比例是准确的，达到了评价囊胚质量的目的。
表3. 改进的囊胚双重染色方法与传统方法内细胞团细胞所占比例比较
3.讨论
本试验结果表明，我们改进的囊胚双重染色方法染色时间仅3min，而以前的报道中最少需要47min，因此大大降低了染色时间，达到了快速双重染色的目的。囊胚细胞总数略高于Hoechst33342单染色，但差异不显著。 ICM与囊胚细胞总数的比值为33.56%，与其它种染色方法得到的33%、31% 接近。
低浓度的TritonX-100(C34H62O11)对囊胚进行短时处理能够在不破坏ICM细胞膜的情况下增加TE细胞的通透性，使得分子量较大的红色荧光染料PI可以通过TE细胞膜对其进行染色，从而达到囊胚双重染色的效果。对于Hoechst33342着色的细胞，当细胞膜通透性增大时，PI很容易对其进行复染，并显示为红色；而对于PI着色的细胞，低浓度的Hoechst33342则需要较长的时间进行复染，并且细胞颜色由红色逐渐变化为蓝色。这表明不管是先用Hoechst33342进行染色还是先用PI进行染色，膜通透性大的细胞都将显示为红色，最终两者染色的效果都是一样的，通过本试验改进方案中ICM/囊胚细胞总数的对比(33.82VS33.56)也证实了这一点。
随着囊胚的不断发育细胞数量也在不断的增加，所需TritonX-100处理的时间也相应的增加。李瑞岐的方法是用于第8天牛扩囊或孵化囊胚，而我们试验中所染色的胚胎为标准囊胚，在细胞数上要少于扩囊与孵化囊胚很多，因而TritonX-100处理60~69s已不再适用。通过试验我们发现，在牛标准囊胚上运用李瑞岐等囊胚双重染色方法时TritonX-100的处理时间在30s是可行的。同时建议0.5%链蛋白酶处理时间调整为1min， 因为牛囊胚在0.5%链蛋白酶中处理1min左右透明带就基本上被去除了，如果处理时间过长不仅会影响到ICM细胞膜的通透性还会使细胞间的连接变的太松散，在接下来的处理过程中会增强TritonX-100对ICM细胞膜通透性的改变，而且胚胎还容易散裂。
在我们改进的囊胚双重染色方案中显示，Hoechst33342室温短时处理也能达到牛囊胚双重染色的目的，而且这种方法大大缩短了染色时间，提高了评估囊胚质量的效率。
结论
运用我们改进的方法能够将单个牛囊胚双重染色时间由传统的最少47min降到3min，大大降低了染色时间；囊胚细胞总数与Hoechst33342单染色相比略高，但差异不显著(P>0.05)，表明改进的囊胚双重染色方法用于确定囊胚细胞总数的结果是可靠的；内细胞团细胞占囊胚细胞总数比例与其它二种传统染色方法接近，说明改进的囊胚双重染色方法在检测内细胞细胞所占囊胚细胞比例是准确的，达到了评价囊胚质量的目的。
因此，改进的囊胚双重染色方法可以作为一种快速、可靠的牛囊胚质量评价方法。
Claims (1)
1.一种牛体外受精囊胚双重染色的方法，包括（1）卵母细胞的采集；（2）体外成熟培养；（3） 体外受精；（4） 胚胎的体外培养；（5）囊胚双重染色五个步骤，其特征在于步骤（5）囊胚双重染色是将培养至7-9d的牛囊胚用0.5%w/w链霉蛋白酶处理囊胚55s，后于PBS中洗2-3遍，在100µg/ml碘化丙啶，1%w/w 聚乙二醇辛基苯基醚 /PBS 中染色20s，于PBS中洗2-3遍后移入45µg/ml双苯酰亚胺中染色50s，用PBS洗2-3遍后进行压片，压片后置于倒置荧光显微镜紫外光下观察照相，囊胚内细胞团(ICM)细胞核呈蓝色，滋养层细胞(TE)细胞核呈红色。
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| 以囊胚双重染色方法检验果糖对牛胚胎早期发育效果的影响;李瑞岐等;《繁殖生理》;20101231;第46卷(第9期);23-25 * |
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| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
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Granted publication date: 20171003 Termination date: 20211118 |
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