CN109946278A - 荧光染料dapi对细胞dna进行染色定量的癌症筛查和诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荧光染料DAPI对细胞DNA进行染色定量的癌症筛查和诊断方法。它以DAPI为染料对细胞涂片或细胞、组织切片中的细胞核染色，在荧光显微镜下拍照，根据各细胞核的荧光强弱对各细胞核中的DNA进行相对定量。DNA含量异常(非整数倍体或倍体数大于4.5以上)的细胞为疑似癌细胞。疑似癌细胞的数量和形态可用用于癌症筛查和诊断。本发明提供的染色方法具有染色时间快，操作简单，定量准确的优点；且用途广泛，能对细胞凃片、组织切片和培养细胞中细胞的DNA进行定量，可用于癌症样本筛查。
Description
技术领域
本发明涉及DNA检测技术领域，具体涉及一种利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行定量测量的方法及以此进行癌症的筛查和诊断。
背景技术
在一般情况下，正常细胞的DNA含量基本相同(二倍体或者四倍体)，而癌症或其他疾病状态下的细胞DNA的含量可能发生改变。用细胞(核)染色图像定量分析各细胞的DNA含量来进行宫颈癌前病变的筛查已有大量报道，在北美及欧洲细胞DNA图像定量分析诊断方法已作为一种常规临床检测方法之一。在国内，许多大城市也开始用全自动DNA定量分析系统进行宫颈癌筛查，如期刊文献《宫颈细胞DNA定量分析在宫颈癌筛查中的应用价值》(期刊名皖南医学院学报，发表日期2016-08-15)文中报道，宫颈细胞DNA定量分析联合液基薄层细胞学检测可进行宫颈癌筛查，但标本的制备中通常采用的方法是：细胞涂片进行巴氏染色后进行TCT检测或细胞涂片经Feulgen(福尔根)染色经细胞DNA定量分析。这些传统的标本制备中染色方法存在以下缺点：时间长，Feulgen染色方法需要2小时左右；染色操作复杂，定量准确度低。
DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),PubChem编号：2954，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，DAPI的最大激发波长.为340nm，最大发射波长为488n，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，可以用与活细胞和固定细胞细胞核内DNA结合而使其染色。细胞核被染色后，在紫外光照射下细胞核会发出蓝色荧光，其强弱与该细胞的DNA含量成正比。用此原理，可对细胞DNA含量进行相对定量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行定量测量的方法，可用于宫颈癌等癌症的早期筛查和诊断。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种荧光染料DAPI通过细胞DNA进行染色定量在癌症筛查和诊断的用途。
本发明采用的另一个技术方案：利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行染色定量的癌症筛查和诊断的方法，以DAPI为染料对细胞涂片或细胞、组织切片中的细胞核染色，根据各细胞核的荧光强弱对各细胞核中的DNA进行相对定量，该方法具体包括以下步骤：
步骤1，细胞样本的获取；
步骤2，取浓度0.05ug/ml-5ug/ml DAPI工作液与细胞样本，充分混合，染色2-5分钟；
步骤3，当样本为悬浮细胞时需要制片。具体过程如下：取细胞沉降仓，加2.5ml细胞分离液，盖滤网，加入染色后的细胞样本，离心沉降制片。
步骤4，取制好样本玻片，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤6，待干，封片；
步骤7，在荧光显微镜下镜检查，通过图片分析软件对细胞DNA进行定量分析。
步骤8，所有DNA含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞被认定为疑似癌症细胞，当疑似癌症细胞的数量多于一定数量，且具备一定的外形特征，则认为该患者可能患有癌症。
步骤1中所述的细胞样本获取包括：取细胞置于固定液中，振荡细胞样本1min，使其悬浮；取细胞沉降仓法制片：取滤网，加2.5ml细胞分离液，盖滤网。
步骤1中所述的细胞样本获取包括：取细胞石蜡切片使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色；干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；
所述的细胞样本获取包括：取冰冻切片室温晾干15min，干燥后的切片置于二甲苯中进行透明化处理，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；
所述工作液的配制具体为：用DAPI粉末配制成50ug/ml的10*工作液，4度避光保存；
本发明提供的利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行定量测量的方法，具有染色时间快，操作简单，定量准确的优点；且用途广泛，能对细胞凃片、组织切片和培养细胞中细胞的DNA进行定量，可用于癌症样本筛查。
附图说明
图1为用DAPI染色的人宫颈癌细胞的荧光照片；
图2为实施例一同一样本在DAPI染色与Feulgen染色方法下定量准确性比较。
具体实施方式
本发明提供的利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行定量测量的方法，首先进行原液的配制：用DAPI粉末配制成50ug/ml的10*工作液，4度避光保存，备用；
利用荧光染料DAPI对细胞DNA进行定量测量的方法进行宫颈癌筛查，
实施例一，实时染色，包括以下步骤：
步骤1：用宫颈刷从女性子宫口刷下一些细胞，把宫颈刷放置于含有酒精和甲醇的固定液中，振荡细胞样本1min，使其悬浮。
步骤2，取细胞沉降仓法制片：取滤网，加2.5ml细胞分离液，盖滤网；
步骤3，取20-100ul DAPI 10*工作液与300ul细胞样本，均匀混合1分钟，染色3min；
步骤4，转移样本到制片仓；
步骤5，离心，3min；
步骤6，取玻片，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤7，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤8，待干，树脂封片；
步骤9，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析。
步骤10，鉴定DNA含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞(疑似癌细胞)的数量和形态作出癌症筛查结论。一般在10000个细胞中发现的疑似癌细胞数量超过3个，则筛查结果为阳性。
实施例一的对照试验例为取同一细胞样本进行常规Feulgen染色(具体实验步骤再次不再赘述)，其结果参见图2，从图2可以看出，同一样本在DAPI染色与Feulgen染色方法下定量准确性比较：柱状图和散点图的横坐标都为细胞DNA的相对含量(DI，DNAindex)，纵坐标为细胞数量(柱状图)和细胞的面积(散点图)。灰色和黑色的峰代表二倍体细胞，这些峰越尖利则代表细胞的定量越准确，我们计算了二倍体细胞DNA含量(DI)的CV值，这个值越小则意味着误差越小、定量越准确。
实施例二，固定染色一体化，包括以下步骤：
步骤1，改进细胞固定液中加入DAPI工作液，使其终浓度达到(0.2-1.0ug/ml)之间。
步骤2，用宫颈刷从女性子宫口刷下一些细胞，把宫颈刷放置于含DAPI的固定液中，振荡细胞样本2min，使其悬浮。
步骤3，在细胞沉降仓中加2.5ml细胞分离液，盖滤网；
步骤4，取300ul细胞样本，转移样本到制片仓；
步骤5，离心，3min；
步骤6，取玻片，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤7，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤8，待干，树脂封片；
步骤9，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析；
步骤10，鉴定DNA含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞(疑似癌细胞)的数量和形态作出癌症筛查结论。一般在10000个细胞中发现的疑似癌细胞数量超过3个，则筛查结果为阳性。
实施例三，石蜡切片，包括以下步骤：
步骤1，一般使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
步骤2，切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化。
步骤3，把切片置于2ug/ml的DAPI染液中的浸泡10分钟。
步骤4，取玻片，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤6，待干，树脂封片；
步骤7，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析；
步骤8，鉴定DNA含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞的数量和形态作出癌症筛查结论。
实施例四，冰冻切片，包括以下步骤：
步骤1，冰冻切片室温晾干15min；
步骤2，干燥后的切片置于二甲苯中进行透明化处理，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化；
步骤3，把切片置于2ug/ml的DAPI染液中的浸泡10分钟；
步骤4，取玻片，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤5，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤6，待干，树脂封片；
步骤7，在荧光显微镜下镜检查，进行定量分析；
步骤8，鉴定DNA含量异常(非整数倍体，或是倍体数大于4.5以上)的细胞，根据异常细胞的数量和形态特征作出癌症筛查结论。
本方法同样适合其他细胞样本(如痰液涂片样本、胸腹水涂片样本、组织切片等)，细胞的前期处理略有区别，但在细胞被固定后，后续的步骤完全一致。
DAPI的工作浓度依据样本类型和细胞的浓度可以改变，允许10倍左右的浮动，都不影响实验结果。一般的最终推荐浓度为0.5ug/ml。
本发明的DAPI染色与传统Feulgen染色之间的比较结果如下表1：
表1
| 特征和指标 | DAPI染色 | Feulgen染色 |
| 需要化学试剂数 | 1 | 6 |
| 预配试剂数 | 1 | 5 |
| 预配试危化试剂数 | 0 | 1 |
| 预配试剂需用时间 | 5分钟 | 2-3天 |
| 染色步骤 | 1 | 7 |
| 染色时间 | 3分钟 | >＝90分钟 |
| DNA定量精度(见图2) | 高 | 中 |
| 检测方法 | 荧光 | 明场 |
相比传统的Feulgen染色方法，本发明染色时间快,实验准备、操作简单，重复性好，定量准确。
Claims (5)
1.一种荧光染料DAPI对细胞DNA进行染色定量在癌症筛查和诊断的用途。
2.一种荧光染料DAPI对细胞DNA进行染色定量在癌症筛查和诊断的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，细胞样本的获取；
步骤2，取浓度0.05ug/ml-5ug/ml DAPI工作液与细胞样本，充分混合，染色2-5min；
步骤3，清水洗涤20s，PBS洗涤30s×3次；
步骤4，95％、100％乙醇脱水各1min；
步骤5，待干，封片；
步骤6，在荧光显微镜下镜检查，通过图片分析软件对细胞DNA进行定量分析；
步骤7，依据DNA定量信息，鉴定DNA含量异常，包括非整数倍体细胞或是倍体数大于4.5以上的细胞，根据异常细胞的数量作出癌症筛查和诊断结论；
所述的步骤2之前或之后还包括制片步骤，当细胞样本为切片时，制片步骤在步骤2之前进行。
3.根据权利要求2所述的定量测量的方法，其特征在于，所述细胞样本获取具体为：取细胞置于固定液中，振荡细胞样本1min，使其悬浮；取细胞沉降仓法制片；取滤网，加2.5ml细胞分离液，盖滤网。
4.根据权利要求2所述的定量测量的方法，其特征在于，所述细胞样本获取包括：取细胞石蜡切片使用恒温水浴锅，温度控制在37-40℃左右，利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60℃恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色；干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化。
5.根据权利要求2所述的定量测量的方法，其特征在于，所述细胞样本获取包括：取冰冻切片室温晾干15min，干燥后的切片置于二甲苯中进行透明化处理，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95％、85％、70％进行水化。
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| CN111863118A (zh) * | 2020-07-20 | 2020-10-30 | 湖南莱博赛医用机器人有限公司 | 基于tct制片进行tct和dna倍体分析的方法 |
| CN112750493A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-05-04 | 深思考人工智能机器人科技（北京）有限公司 | 基于巴氏染色方式的dna倍体定量分析方法及系统 |
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