CN111458500A

CN111458500A - 人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111458500A
Application number: CN202010140935.5A
Authority: CN
Inventors: 吴纯; 宋砚明; 刘杨; 刘岩; 孙晓磊; 郭金城; 周勤; 王超
Original assignee: Suzhou Baidao Medical Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Baidao Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明涉及人呼吸道上皮细胞病原检测领域，尤其涉及一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒。本发明的方法，包括以下步骤：S1、样品获取：采集人呼吸道上皮细胞，放入细胞保存液中固定；S2、制片：手动或自动将样本添加至载样介质上；S3、孵育：采用免疫细胞化学染色技术和/或显色原位杂交技术孵育样品；S4、阳性样本判断：人工计数识别阳性细胞并输出诊断报告，或者通过计算机扫描后自动计数并输出辅助诊断报告；其克服了现有诊断手段的不足，比如核酸检测中提取样本过程中核酸的损失，提高病毒的检出率，比目前常规使用的核酸检测和CT以及其他正在开发的血清学检测产品更加敏感，特异和高效。

Description

人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及人呼吸道上皮细胞病原检测领域，尤其涉及一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒。

背景技术

疾病的早期诊断，能够大大增加患者的生存的机会。早发现、早诊断是提高疾病治愈率，降低病死率的关键。体外诊断产品按检测原理或检测方法主要可分为：生化诊断产品、免疫诊断产品、分子诊断产品、微生物诊断产品、尿液诊断产品、凝血类诊断产品、血液学和流式细胞诊断产品、现场快速诊断产品等八大类，其中生化、免疫、分子诊断和现场快速诊断产品为国内诊断产品主要的四大类品种。

以人呼吸道疾病为例，流感病毒A(IA)、流感病毒B(IB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、呼吸道腺病毒(ADV)、副流感病毒等，是引起呼吸道疾病的主要病原体。

现有技术中，对于呼吸道疾病的检测方法，主要包括：核酸检测、CT检测、IgM检测试纸、IgM抗体发光检测、病毒抗原试纸条、病毒抗原发光检测等。核酸诊断主要是用于基因水平进行检测，有聚合酶链反应(PCR)、原位杂交(ISH)和基因芯片(gene chip)三大类产品。IgM检测试纸、IgM抗体发光检测，病毒抗原试纸条、病毒抗原发光检测等是建立在免疫诊断的基础上，利用抗原抗体特异性结合的特性进行检测，在诊断试剂中品种最多，主要有酶联免疫、荧光免疫、化学发光、胶体金等等。CT检测是肺部疾病检测的重要手段，有助于临床医师判断肺炎致病原的大方向。

RT-PCR法检测病毒：主要通过采集痰液，咽拭子等呼吸道标本进行病毒核酸基因检测即可作出病原学诊断，灵敏度高，能及时检查病毒携带者。然而，目前病毒核酸假阴性较高，仪器设备昂贵，实验场地要求高，操作人员要求高，容易污染等。

通过临床症状综合评价诊断：这种方法在疾病的早期，因症状不典型，而无法准确诊断。在疾病晚期虽然可以准确诊断，但延误了对疾病的治疗。

血清免疫检查病毒抗体(间接荧光免疫法或间接ELISA)。IgG抗体产生需要在发病后至少14天，且一般要二次感染才有可能有足够的量被检测到，因此，这种方法不能作早期诊断。IgM抗体在病毒感染5-7天产生，且受血清IgM浓度的限制，导致灵敏度不高，容易出现假阴性的情况。病毒感染到IgM抗体产生的窗口期用血清免疫检查病毒抗体不适用，因此检测血清IgM的方法也有很大的限制。各方法的检测方法和结果对比，如表1所示。

表1呼吸道疾病检测方法及结果对比

中国专利公开号为CN1695057的发明专利，虽然公开了一种基于核酸探针的疾病抗原检测技术，然而，每种疾病的检测手段，应当基于该疾病的特性有所不同，该专利中并未公开基于人呼吸道疾病的上皮细胞的检测方法中抗原抗体的检测方法，核酸探针与抗体相结合的方式检测结果将更加准确。

中国专利公开号为CN103604922的发明专利，虽然公开了一种基于酶免疫分析技术的呼吸道合胞病毒试剂盒，但是其最终结果判断还是以数值为准，与细胞学检测中直接观察到细胞中的病毒差异较大，细胞学观察将更为明确。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒，其克服了现有诊断手段的不足(比如核酸检测中提取样本过程中核酸的损失)，提高病毒的检出率，比目前常规使用的核酸检测和CT以及其他正在开发的血清学检测产品更加敏感，特异和高效。

本发明的一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，包括以下步骤：

S1、样品获取：采集人呼吸道上皮细胞，放入细胞保存液中固定；

S2、制片：手动或自动将样本添加至载样介质上；

S3、孵育：采用免疫细胞化学染色技术(ICC)和/或显色原位杂交技术(CISH)孵育样品；

S4、阳性样本判断：人工计数识别阳性细胞并输出诊断报告，或者通过计算机扫描后自动计数并输出辅助诊断报告。

应当说明的是，本发明中采集人呼吸道上皮细胞的方法，应当包括但不限于现有技术中常规的采集痰液、鼻咽拭子取样、口腔拭子取样等方式；步骤S1其目的，是以合理有效地方式，采集足够数量的呼吸道上皮细胞，并添加至细胞保存液中保存即可，以满足后续免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)检测过程，阳性判断标准中对于最低样本细胞数量的要求，与此同时，采集呼吸道上皮细胞的方法，实际操作过程中也应当采用必要的手段，以满足该最低样本细胞数量的要求，例如，鼻咽拭子取样过程，取样力度、重复次数等，均对该标准有影响；因此，本发明对于该过程不再赘述，凡是能够实现该目的的方法，均应落入本发明的保护范围。

本发明步骤S2中的“手动”及“自动”，是由于当前医院检验相关科室如病理科的检验检疫条件不同，例如部分医院由于购买了批量化制片设备可实现自动化制备样本载玻片，然而该过程对于后续检测结果并没有决定影响，不同点在于检验时间和结果稳定性会有差异，对此，本发明对于该手动或自动制片方式不再赘述，凡是能够实现该目的的方法，均应落入本发明的保护范围。

本发明步骤S2中的“载样介质”，指的是用于承载添加的样品液滴、并将其均匀分布至检测区域的物品，其应当包括但不限于载玻片、微流控芯片等，其目的均为使样品液滴在该载样介质上实现细胞薄层，以保证后续免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)的稳定性和准确性即可。

本发明步骤S3中，免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)均可以得到检测结果，医院检验相关科室如病理科，在实际操作过程中可选择单独做其中一项检测，也可同时做两种检测；不同点在于，由于免疫细胞化学染色技术是针对病原体所表达蛋白质的检测，而显色原位杂交技术是针对病原体核酸的检测，两者目的和方法不同，同时检测可以提供较高的检测准确性。

本发明步骤S4中的计数方式，是由于当前医院检验相关科室如病理科的检验检疫条件不同，而选择人工计数并识别阳性细胞，或者通过计算机扫描后自动计数，该过程对于后续检测结果的影响在于，人工计数的检验时间较长，另外，多次检测样本的阳性判断会因为人与人之间的判断差异以及长时间计数带来的视觉疲劳等因素，导致结果稳定性和准确性比自动计数较低。

进一步的，所述步骤S3中，同时采用免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)孵育样品，而后分别进行步骤S4阳性判断；当免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)样品阳性检测结果不一致时，重复步骤S3和S4。

进一步的，所述步骤S4中，计算机扫描后自动计数的过程，依赖于评估模型的建立，所述评估模型的建立步骤包括：

S41、收集需要判读的图片类型，包括阴性和阳性，不同部分取样的图片，进行细胞标注；

S42、进行模型训练，评估模型精度；对数据标注进行复核，继续训练，优化算法；

S43、当模型精度符合预期，即可进行测试。

进一步的，所述步骤S4中，阳性样本判断的标准为：可计数样本细胞数量大于10000个的前提下，阳性染色细胞的数量大于10个。

进一步的，所述步骤S4中的通过计算机扫描后自动计数，其实现方式为对染色样品进行油镜高速扫描，图片自动上传服务器，然后对服务器中的图片进行自动计数并识别阳性细胞。

具体的，采用本申请人市售仪器ABCARTA-HiTRAI 1000及其后续改进设备对染色样品切片扫描。

具体的，采用本申请人市售仪器ABCARTA-PAI^TM人工智能软件及其后续改进软件对服务器中扫描图片进行智能判读。

本发明的一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测试剂盒，包括至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆或多克隆抗体以及结合标记物的核酸探针、细胞保存液、抗标记物抗体、酶标聚合物二抗、酶封闭液、以及染色液。

具体的，所述标记物为地高辛或生物素，所述染色剂为DAB或AEC染色剂，所述酶封闭液为过氧化物酶封闭液。

进一步的，所述细胞保存液含有0.2-2％质量分数的多聚甲醛、60–95％体积分数的乙醇。

具体的，所述细胞保存液中还包括终浓度为0.01M-0.03M的磷酸盐，并调整pH为7.2-7.6。

进一步的，所述呼吸道病原包括A型流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、冠状病毒SARS、冠状病毒MERS、冠状病毒2019-nCOV。

进一步的，所述单克隆或多克隆抗体包括靶向以下抗原的抗体：

1)A型流感病毒NP蛋白(Nucleoprotein，Uniprot ID P69291)，具体抗原表位为第20-50位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：

QNATEIRASV GKMIDGIGRF YIQMCTELKL S

2)A型流感病毒M2蛋白(Matrix protein M2，Uniprot ID P06821)，具体抗原表位为第1-22位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：

MSLLTEVETP IRNEWGCRCN GS

3)B型流感病毒NP蛋白(Nucleoprotein，Uniprot ID P04665)，具体抗原表位为第51-90位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：

PERTTTSSET DIGRKIQKKQ TPTEIKKSVY KMVVKLGEFY

4)呼吸道合胞病毒G糖蛋白(Major surface glycoprotein G，Uniprot IDP20895)，具体抗原表位为第1-37位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：

MSKNKDQRTA KTLEKTWDTL NHLLFISSGL YKLNLKS

5)腺病毒Hexon蛋白(Hexon protein，Uniprot ID P36849)，具体抗原表位为第801-840位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：5所示，具体为：

VNYTDYKAVT LPYQHNNSGF VGYLAPTMRQ GEPYPANYPY

6)副流感病毒1型HN蛋白(Hemagglutinin-neuraminidase，Uniprot ID P16071)，具体抗原表位为第1-34位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：

MAEKGKTNSS YWSTTRNDNS TVNTYIDTPA GKTH

7)副流感病毒2型L蛋白(RNA-directed RNA polymerase L，Uniprot IDP26676)，具体抗原表位为第1-34位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：

MAASSEILLP EVHLNSPIVK HKLIYYLLLG HFPH

8)副流感病毒3型L蛋白(RNA-directed RNA polymerase L，Uniprot IDP12577)，具体抗原表位为第1-34位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：8所示，具体为：

MDTESNNGTV SDILYPECHL NSPIVKGKIA QLHT

9)冠状病毒SARS N蛋白(Nucleoprotein，Uniprot ID P59595)，具体抗原表位为第301-330位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：9所示，具体为：

HWPQIAQFAP SASAFFGMSR IGMEVTPSGT

10)冠状病毒MERS S蛋白(Spike glycoprotein，Uniprot ID K9N5Q8)，具体抗原表位为第367-606位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：10所示，具体为：

EAKP SGSVVEQAEG VECDFSPLLS GTPPQVYNFK RLVFTNCNYN LTKLLSLFSVNDFTCSQISP AAIASNCYSS LILDYFSYPL SMKSDLSVSS AGPISQFNYK QSFSNPTCLI LATVPHNLTTITKPLKYSYI NKCSRFLSDD RTEVPQLVNA NQYSPCVSIV PSTVWEDGDY YRKQLSPLEG GGWLVASGSTVAMTEQLQMG FGITVQYGTD TNSVCPKLEF ANDTKIASQL GNCVEY

11)冠状病毒2019-nCOV S蛋白(Spike glycoprotein,GenBank:AYV99803.1)，具体抗原表位为第1-34位氨基酸位点，其序列如SEQ ID NO：11所示，具体为：

MFIFLLFLTL TSGSDLDRCT TFDDVQAPNY TQHT

进一步的，所述核酸探针包括结合至人呼吸道病原体的以下核酸探针：

1)A型流感病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 12所示，具体为：

TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG

2)B型流感病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 13所示，具体为：

CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG

3)呼吸道合胞病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 14所示，具体为：

TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT

4)腺病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 15所示，具体为：

CGATGGGGAAGCTACTACGGCGTCACCAGA

5)副流感病毒1型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 16所示，具体为：

ACTAGTTGTTCCATATGTGTCCCGGAGATC

6)副流感病毒2型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 17所示，具体为：

CCGTGAAGGGCGTACTAGAACTGTAAAGAC

7)副流感病毒3型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 18所示，具体为：

GAATCCTTTTATGTGTAAATAGTCTATAGG

8)冠状病毒SARS检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 19所示，具体为：

GGTATCCAGTTGAAACAACAAAAGGAACACCATCTACAAATATTTTTCTTACTAGTGGTCCAAAACTTGT

9)冠状病毒MERS检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 20所示，具体为：

CGAACACTTTTAGGTAAGTACCAATTGGTTAACCG

10)冠状病毒2019-nCOV检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 21所示，具体为：

CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

a、免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)虽然在其它领域有所应用，例如在对女性宫颈脱落细胞进行的宫颈癌早期筛查(TCT)中有一定的应用，但是并未应用于病原体尤其是病毒的检测，更未应用于呼吸道上皮细胞的病原体检测过程；

b、检测过程实现自动化，克服了免疫细胞化学染色技术(ICC)和显色原位杂交技术(CISH)阳性细胞判断过程中计数困难、时间长、稳定性不高的问题，同时节省人力成本；

c、仪器扫描载样介质中的大量细胞，自动计算阳性百分比，结果更加客观准确；

d、更重要的是，相对于核酸诊断无法直接观察结果而言，以镜下观察到绝对量的染色细胞来反映，本发明所述检测方法更为准确。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1是上呼吸道上皮细胞在细胞保存液中的固定效果；

图2是计算机智能判读的流程图；

图3是计算机智能判读阳性细胞的结果图；

图4是ICC检测结果图(左图为阳性样本，右图为阴性对照)；

图5是CISH检测结果图(左图为阳性样本，右图为阴性对照)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一

本实施例提供一种人上呼吸道上皮细胞病原细胞学通用检测方法，包括如下步骤：

S1、标本采集和制备：

收集上呼吸道标本如鼻咽部、口腔中的上皮细胞或痰液，放入采样管中的细胞保存液中固定，然后制备样品载玻片，方法包括但不限于以下两种：

a、细胞手动涂片：收集采样管中的细胞进行细胞涂片及细胞固定；

b、细胞自动涂片：全自动液基薄层细胞制片机制备样品载玻片及细胞固定；

S2、ICC免疫细胞化学染色技术(简称，抗体检测)

方法包括但不限于以下两种，具体如下：

a、仪器检测：

将试剂和制备好的样品放入自动免疫组化仪ABCARTA-FAIP 30型中，打印标签，执行程序。

运行结束后，取出切片脱水封片。

b、手工检测：

水化：切片置于75％酒精浸泡5分钟，蒸馏水冲洗1次，PBS冲洗1次，每次2分钟。

抗原修复：推荐使用pH9.0 EDTA水浴修复法。将水化后的组织切片置于抗原修复盒中，放入提前加热的水浴锅中，95℃水浴20分钟，自然冷却10分钟后，用自来水冲淋使之冷却至室温。PBS冲洗2次，每次3分钟甩掉多余液体，用免疫组化笔将细胞圈住。

内源性过氧化物酶灭活：应用3％H₂O₂溶液对切片进行室温孵育5分钟，PBST冲洗2次，每次3分钟。

一抗及亚型对照抗体孵育：加入1-3滴抗体或对照抗体完全覆盖组织，室温湿盒孵育60分钟。PBST冲洗3次，每次3分钟。

放大剂孵育：加入1-3滴抗放大剂完全覆盖细胞，室温湿盒孵育15分钟，PBST冲洗3次，每次3分钟。

酶标聚合物二抗孵育：加入1-3滴抗酶标聚合物二抗，完全覆盖细胞，室温湿盒孵育15分钟，PBST冲洗3次，每次3分钟。

DAB显色或AEC显色：加入1-3滴DAB或AEC，完全覆盖细胞，依据颜色变化显色1-3分钟，蒸馏水冲洗终止显色。其中，DAB配制方法：加1滴DAB浓缩液到1mL DAB缓冲液中，混匀；配置好的DAB显色液需在6小时内使用，否则会影响显色效果。AEC配置方式：加20μL AEC浓缩液到1mL AEC缓冲液中，混匀；配置好的AEC显色液需在6小时内使用，否则会影响显色效果。

苏木素衬染：苏木素染色30秒，自来水洗去多余苏木素，碳酸锂返蓝10秒。

脱水透明：依次浸泡梯度酒精75％、95％、100％，每次3分钟。二甲苯透明10分钟。

封片：用中性树胶对样品进行封片。

S3、CISH显色原位杂交技术(简称，核酸探针检测)：

水化：切片置于75％酒精浸泡5分钟，蒸馏水浸泡2分钟。

水浴：将切片置于99℃去离子水中水浴25分钟。

消化：胃酶37℃消化5分钟。

漂洗：2*SSC漂洗两次，每次5分钟。

脱水：切片依次放入70％、85％、100％乙醇中各2min，拿出晾干。

加核酸探针：将核酸探针加到样本区域，盖上盖玻片(尽量选用18*18或是20*20的玻片)、使用橡胶水泥封胶。

杂交：将切片放入原位杂交仪中65℃杂交24小时。

洗涤：65℃的0.4*SSC洗一次，2分钟，室温的2*SSC洗1次，2分钟，室温的PBS洗3次每次3分钟。

内源性过氧化物酶灭活：应用3％H2O2溶液对切片进行室温孵育5分钟，PBS冲洗2次，每次3分钟，用免疫组化笔将细胞圈住。

抗地高辛抗体(或抗生物素抗体)孵育：加入1-3滴地高辛抗体或抗生物素抗体，室温湿盒孵育60分钟。PBST冲洗3次，每次3分钟。

封片：用中性树胶对样品进行封片。

S4、切片扫描：采用ABCARTA-HiTRAI 1000对染色样品进行40-100倍油镜高速扫描，图片自动上传服务器。

S5、智能判读：ABCARTA-PAI^TM人工智能软件对服务器中扫描图片进行自动计数并识别阳性细胞，输出辅助诊断报告。

实施例二细胞保存液对固定效果的影响

应当说明的是，不同细胞保存液对样本的固定效果有较大影响，本实施例提供不同细胞保存液对固定效果的影响的对比试验数据，具体如下：

1、细胞保存液对细胞数量的影响

取6x10⁷的293T细胞，去掉上清，加入PBS重悬，平均分为六份，作为样品1、2、3、4，5，6，每份样品至少重复3次，实验结果求平均值。再离心，去掉上清，样品1、2、3、4、5、6分别加入：

样品1：1％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品2：1％质量分数的多聚甲醛，60％体积分数乙醇

样品3：1％质量分数的多聚甲醛，95％体积分数乙醇

样品4：4％质量分数的多聚甲醛(对照)

样品5：0.2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品6：2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

在固定第1、5、15和30天用细胞技术仪测定细胞的数量，对比数据如表2所示。

表2不同细胞保存液下细胞数量变化对比结果

其中，样品1、2、3、4、5、6的细胞数量在30天后的降低程度分别为3.4％、3.69％、4.35％、13.2％、9.6％、4％。

2、细胞保存液对细胞中RNA固定的影响

取6x10⁷的293T细胞，去掉上清，加入PBS重悬，平均分为六份，作为样品7、8、9、10、11、12，每份样品至少重复3次，实验结果求平均值。再离心，去掉上清，分别加入：

样品7：1％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品8：1％质量分数的多聚甲醛，60％体积分数乙醇

样品9：1％质量分数的多聚甲醛，95％体积分数乙醇

样品10：4％质量分数的多聚甲醛(对照)

样品11：0.2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品12：2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

在固定第1、5、15和30天取一份细胞，提取细胞的RNA，用Nanodrop one测定定量，对比数据如表3所示。

表3不同细胞保存液下细胞中RNA固定效果对比

其中，6组样本的RNA浓度在30天后的降低程度分别为13.9％、16.5％、21.4％、41.9％、21.4％、18.6％。

3、细胞保存液对细胞中蛋白固定的影响

取6x10⁷的293T细胞，去掉上清，加入PBS重悬，平均分为六份，作为样品13、14、15、16、17、18，每份样品至少重复3次，实验结果求平均值。再离心，去掉上清，分别加入：

样品13：1％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品14：1％质量分数的多聚甲醛，60％体积分数乙醇

样品15：1％质量分数的多聚甲醛，95％体积分数乙醇

样品16：4％质量分数的多聚甲醛(对照)

样品17：0.2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

样品18：2％质量分数的多聚甲醛，75％体积分数乙醇

在固定第1、5、15和30天取一份细胞，提取细胞蛋白，用Nanodrop one测定定量，对比数据如表4所示。

表4不同细胞保存液下细胞中蛋白固定效果对比

其中，4组样本的蛋白浓度在30天后的降低程度分别为36.4％、37.2％、42.1％、48.6％、38.1％、36.8％。

根据以上结果可知，包含1％质量分数的多聚甲醛、75％体积分数乙醇的细胞固定液，对样本的固定效果最好。收集上呼吸道口腔中的上皮细胞，放入采样管中的细胞保存液中固定，显微镜下可见固定效果如附图1所示。

实施例三计算机自动化判断阳性的步骤与逻辑

本实施例提供一种基于计算机人工智能技术，对服务器中的图片进行自动计数并识别阳性细胞，输出辅助诊断报告的方法，具体如下：

S1、收集需要判读的图片类型，包括阴性和阳性，不同部分取样的图片，进行细胞标注。

S2、进行模型训练，评估模型精度。对数据标注进行复核，继续训练，优化算法。

S3、当模型精度符合预期，即可进行测试。

具体步骤见图2，输出图片结果见图3。由于计算机自动化判断技术并非本发明的重点，在此不做赘述。

实施例四针对多种呼吸道病原体的细胞学检测方法及结果关联性分析

本实施例中，本发明申请人与某医院进行合作，对100例已知感染七项呼吸道病原体(包括A型流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型)中任一项的病人，采用本发明的细胞学检测方法进行检测，并与病毒分离培养结果作对比，以验证检测的准确性，并定义阳性样本的判断标准。

应当说明的是，冠状病毒SARS、冠状病毒MERS、冠状病毒2019-nCOV的检测方法与该七项呼吸道病原体检测方法并没有本质区别，所不同点在于不同的检测核酸探针和抗体对于阳性检测的准确率有影响，由于缺乏足够的患病病人样本，本实施在此不再赘述。

具体检测步骤如下：

1、样本处理用鼻拭子擦拭患者鼻腔部，加入到含有细胞保存液的采集管中。静至15min，低速离心(3000g，10min)，去上清，吸取1-2ul细胞悬液均匀的涂于14张载玻片上，静置3-5分钟。玻片1-7用于后续CISH检测，玻片8-14用于后续ICC检测；

2、浸泡后晾干：95％乙醇浸泡10分钟，晾干；

3、玻片1-7核酸探针孵育：玻片经过消化后脱水，加入多种呼吸道病原体核酸探针加到样本区域，每个核酸探针加入至1张玻片，放入原位杂交仪中65℃杂交24小时；

结合至七项呼吸道病原体的核酸探针序列如下：

a、A型流感病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 12所示，具体为：

TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG

b、B型流感病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 13所示，具体为：

CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG

c、呼吸道合胞病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 14所示，具体为：

TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT

d、腺病毒检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 15所示，具体为：

CGATGGGGAAGCTACTACGGCGTCACCAGA

e、副流感病毒1型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 16所示，具体为：

ACTAGTTGTTCCATATGTGTCCCGGAGATC

f、副流感病毒2型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 17所示，具体为：

CCGTGAAGGGCGTACTAGAACTGTAAAGAC

g、副流感病毒3型检测核酸探针，其序列如SEQ ID NO 18所示，具体为：

GAATCCTTTTATGTGTAAATAGTCTATAGG

4、灭活及抗体孵育：处理好的14张玻片进行内源性过氧化物酶灭活。玻片1-7进行抗地高辛抗体孵育20min；玻片8-14进行分别进行不同呼吸道病原体抗体孵育20min，同时进行质控玻片孵育；

结合至七项呼吸道病原体的抗体的序列如下：

a、A型流感病毒检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 22所示，具体为：

QVQLVESGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPDSGDTGFAQKFQGRVTMTRNTSITTAYMELSSLTSEDTAVYYCATGNADCSGGSCYNWFDPWGQGTLVTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 23所示，具体为：

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDRLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDTSGNYHLVFGGGTKLTVLV

b、B型流感病毒检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 24所示，具体为：

QLQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGLHWVRQAPGKGLDWVAVISYDGTNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLHLQMNSLRAEDTAVYYCAKGRGPYCSSSICYHGMDVWGQGTTVTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 25所示，具体为：

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLSGSINMNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQQYYSTPLTFGGGTKVEIK

c、呼吸道合胞病毒检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 26所示，具体为：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSYDSISNGWGWIRQPPGKGLEWIGRMFRSGYYNPSLKSRVSISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSLCSGGSCYSEWGQGTLVTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 27所示，具体为：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISHLSWYQQQPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGGGSGTDFTFTISSLQPEDFATFYCQQYDDLPFGGRTKVEIKRAAA

d、腺病毒检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 28所示，具体为：

EVQLQESGAELVRPGTSVKMSCKASGFTFDDYAIEWVKQRPGQGLEWIGVISWNSGSINYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYFCARGPSRFSSSSFPFDYWGQGTTLTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 29所示，具体为：

DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSVTSNLNWLLQRPGQSPKRLIYGASKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCQQYDDWPSLTFGGGSTNVEIK

e、副流感病毒1型检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 30所示，具体为：

EVQLQESGGRLVQPEGSLKLSCAASGFTFSSYDMYWIRQAPGKSLEWVARIGTAGDTYYGDSVKDRVTISRDDSQSMLYLQMKNLKTEDTAMYYCARGGHYYGSGSYYKNPIYYMDVWGQGILVTVSA

轻链可变区序列如SEQ ID NO 31所示，具体为：

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSTGAVTNGYYLAWYQQKPGQSPKRLIYSTDKLESGVPDRFTGSRFSGSGFTLKISRLQPEDFATYYCLLYNGDGNWAFGQGGRTKVEIK

f、副流感病毒2型检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 32所示，具体为：

EVQLQESGPELVRPGTSVKLSCTVSGFTFSSYAGWVKQPPGKGLEWIGVISGSGGSTNYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSVTADDTAVYYCAKGYTGGNYYYYMDVWGQGTTLTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 33所示，具体为：

DIVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSTSNIGSNYLNWLLQRPGQSPKRLIYSNNKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCAAWDDSLIRPFGGG

g、副流感病毒3型检测抗体

重链可变区序列如SEQ ID NO 34所示，具体为：

LEVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYTFTSYDIEWVKQRPGHGLEWIGEMNPNSGNTRYNPSLKSRISITRDTSKNQFFLQLNSVTTEDTATYYCARGRYCSSTSCYRQPYNWFDPWGQGTTLTVSS

轻链可变区序列如SEQ ID NO 35所示，具体为：

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKSSQSISNNYLAWYQQKPGQAPKRLLIYDASTRASGVPARFTGSGSGTDFTLKISRVESEDFAVYYCQQYGTSPYTFGQGTNVEIK

5、二抗放大剂孵育及DAB检测；

6、切片扫描：采用ABCARTA-HiTRAI 1000对染色样品进行40-100倍油镜高速扫描，图片自动上传服务器；

7、智能判读：ABCARTA-PAI^TM人工智能软件对服务器中扫描图片进行自动计数并识别阳性细胞，输出辅助诊断报告。

应当说明的是，本次检测样本均为呼吸道病原体多重核酸检测结果为阴性的样本。

阳性样本的判断方法如下：

1)定义阳性判断标准为：样本细胞数量大于10000个的前提下，阳性染色细胞的数量大于n，当大于该数值n时，所有抗体检测与核酸探针检测为阳性的样本，其经病毒分离培养进一步确认为阳性。

2)实验过程中，当抗体检测与核酸探针检测不一致时，需重复检测。

根据检测的100例样本结果，样本细胞数量大于10000个的前提下，寻找抗体检测、核酸探针检测与病毒分离结果阳性一致率和阴性一致率最高的一个数值，发现该数值n为10。

根据检测的100例样本结果，样本细胞数量大于100个的前提下，寻找抗体检测、核酸探针检测与病毒分离结果阳性一致率和阴性一致率最高的一个数值，发现该数值n为10。

3)判断结果必须建立在全玻片扫描的基础上，不能遗漏任何细胞，要求样本细胞数量大于10000个；

4)细胞涂片必须使细胞单层均匀排布，无重叠区域，如有重叠区域，需将重叠区域的细胞数排除，未重叠的细胞数需大于10000个。

5)如检测到1-10个阳性染色细胞，建议利用病毒分离培养重新鉴定。

结果发现，阳性染色细胞大于等于10个时，所有样本与病毒分离培养的阳性一致率为100％。，小于10个阳性细胞的样本只有1例，且经鉴定后判断为阴性，为非特异性染色。

本实施例选取A型流感病毒的一个阳性样本，其ICC和CISH的检测结果分别如图4和图5所示，阳性样本的统计数字如表5所示。

表5七联呼吸道病原体细胞学检测结果

试验结果表明，

1)抗体检测和和核酸探针检测结果与病毒分离培养结果具有99％的一致率；

2)抗体检测和和核酸探针检测同时进行时，对于阳性结果的判断具有更高的辅助诊断准确性和参考意义；

3)检测过程可实现自动化，检测时长较病毒分离培养时间短，结果判读简单，配合人工智能软件可实现自动化出结果；

因此，本检测方法可作为对现有诊断的补充诊断，提高检测的检出率。

本发明细胞学检测方法与现有技术其它检测方法的对比，如表6所示。

表6本发明细胞学检测方法与现有技术对比表

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州百道医疗科技有限公司

<120> 人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法及试剂盒

<130> 2020

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> Influenza A virus

<400> 1

Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met Ile Asp Gly

1 5 10 15

Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser

20 25 30

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Influenza A virus

<400> 2

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

1 5 10 15

Cys Arg Cys Asn Gly Ser

20

<210> 3

<211> 40

<212> PRT

<213> Influenza B virus

<400> 3

Pro Glu Arg Thr Thr Thr Ser Ser Glu Thr Asp Ile Gly Arg Lys Ile

1 5 10 15

Gln Lys Lys Gln Thr Pro Thr Glu Ile Lys Lys Ser Val Tyr Lys Met

20 25 30

Val Val Lys Leu Gly Glu Phe Tyr

35 40

<210> 4

<211> 37

<212> PRT

<213> respiratory syncytial virus

<400> 4

Met Ser Lys Asn Lys Asp Gln Arg Thr Ala Lys Thr Leu Glu Lys Thr

1 5 10 15

Trp Asp Thr Leu Asn His Leu Leu Phe Ile Ser Ser Gly Leu Tyr Lys

20 25 30

Leu Asn Leu Lys Ser

35

<210> 5

<211> 40

<212> PRT

<213> Adenovirus type 37

<400> 5

Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Lys Ala Val Thr Leu Pro Tyr Gln His Asn

1 5 10 15

Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met Arg Gln Gly Glu

20 25 30

Pro Tyr Pro Ala Asn Tyr Pro Tyr

35 40

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> Human parainfluenza virus 1

<400> 6

Met Ala Glu Lys Gly Lys Thr Asn Ser Ser Tyr Trp Ser Thr Thr Arg

1 5 10 15

Asn Asp Asn Ser Thr Val Asn Thr Tyr Ile Asp Thr Pro Ala Gly Lys

20 25 30

Thr His

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> Human parainfluenza virus 2

<400> 7

Met Ala Ala Ser Ser Glu Ile Leu Leu Pro Glu Val His Leu Asn Ser

1 5 10 15

Pro Ile Val Lys His Lys Leu Ile Tyr Tyr Leu Leu Leu Gly His Phe

20 25 30

Pro His

<210> 8

<211> 34

<212> PRT

<213> Human parainfluenza virus 3

<400> 8

Met Asp Thr Glu Ser Asn Asn Gly Thr Val Ser Asp Ile Leu Tyr Pro

1 5 10 15

Glu Cys His Leu Asn Ser Pro Ile Val Lys Gly Lys Ile Ala Gln Leu

20 25 30

His Thr

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> Human coronavirus

<400> 9

His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe

1 5 10 15

Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr

20 25 30

<210> 10

<211> 240

<212> PRT

<213> Human coronavirus

<400> 10

Glu Ala Lys Pro Ser Gly Ser Val Val Glu Gln Ala Glu Gly Val Glu

1 5 10 15

Cys Asp Phe Ser Pro Leu Leu Ser Gly Thr Pro Pro Gln Val Tyr Asn

20 25 30

Phe Lys Arg Leu Val Phe Thr Asn Cys Asn Tyr Asn Leu Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Phe Ser Val Asn Asp Phe Thr Cys Ser Gln Ile Ser Pro

50 55 60

Ala Ala Ile Ala Ser Asn Cys Tyr Ser Ser Leu Ile Leu Asp Tyr Phe

65 70 75 80

Ser Tyr Pro Leu Ser Met Lys Ser Asp Leu Ser Val Ser Ser Ala Gly

85 90 95

Pro Ile Ser Gln Phe Asn Tyr Lys Gln Ser Phe Ser Asn Pro Thr Cys

100 105 110

Leu Ile Leu Ala Thr Val Pro His Asn Leu Thr Thr Ile Thr Lys Pro

115 120 125

Leu Lys Tyr Ser Tyr Ile Asn Lys Cys Ser Arg Phe Leu Ser Asp Asp

130 135 140

Arg Thr Glu Val Pro Gln Leu Val Asn Ala Asn Gln Tyr Ser Pro Cys

145 150 155 160

Val Ser Ile Val Pro Ser Thr Val Trp Glu Asp Gly Asp Tyr Tyr Arg

165 170 175

Lys Gln Leu Ser Pro Leu Glu Gly Gly Gly Trp Leu Val Ala Ser Gly

180 185 190

Ser Thr Val Ala Met Thr Glu Gln Leu Gln Met Gly Phe Gly Ile Thr

195 200 205

Val Gln Tyr Gly Thr Asp Thr Asn Ser Val Cys Pro Lys Leu Glu Phe

210 215 220

Ala Asn Asp Thr Lys Ile Ala Ser Gln Leu Gly Asn Cys Val Glu Tyr

225 230 235 240

<210> 11

<211> 34

<212> PRT

<213> Human coronavirus

<400> 11

Met Phe Ile Phe Leu Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ser Gly Ser Asp Leu

1 5 10 15

Asp Arg Cys Thr Thr Phe Asp Asp Val Gln Ala Pro Asn Tyr Thr Gln

20 25 30

His Thr

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Probe

<400> 12

tgcagtcctc gctcactggg cacg 24

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Probe

<400> 13

ccaattcgag cagctgaaac tgcggtg 27

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Probe

<400> 14

ttagcaaagt caagttgaat gat 23

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Probe

<400> 15

cgatggggaa gctactacgg cgtcaccaga 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Probe

<400> 16

actagttgtt ccatatgtgt cccggagatc 30

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> Probe

<400> 17

ccgtgaaggg cgtactagaa ctgtaaagac 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> Probe

<400> 18

gaatcctttt atgtgtaaat agtctatagg 30

<210> 19

<211> 70

<212> DNA

<213> Probe

<400> 19

ggtatccagt tgaaacaaca aaaggaacac catctacaaa tatttttctt actagtggtc 60

caaaacttgt 70

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> Probe

<400> 20

cgaacacttt taggtaagta ccaattggtt aaccg 35

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Probe

<400> 21

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28

<210> 22

<211> 125

<212> PRT

<213> antibody

<400> 22

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Met Asn Pro Asp Ser Gly Asp Thr Gly Phe Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asn Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Gly Asn Ala Asp Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Asn Trp Phe

100 105 110

Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 23

<211> 110

<212> PRT

<213> antibody

<400> 23

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Arg Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Thr Ser Gly Asn Tyr

85 90 95

His Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Val

100 105 110

<210> 24

<211> 126

<212> PRT

<213> antibody

<400> 24

Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Arg Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Ser Ile Cys Tyr His Gly

100 105 110

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 25

<211> 113

<212> PRT

<213> antibody

<400> 25

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Ser Gly

20 25 30

Ser Ile Asn Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Val Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 26

<211> 116

<212> PRT

<213> antibody

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Tyr Asp Ser Ile Ser Asn Gly

20 25 30

Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Arg Met Phe Arg Ser Gly Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val

50 55 60

Ser Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser

65 70 75 80

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu

85 90 95

Cys Ser Gly Gly Ser Cys Tyr Ser Glu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 108

<212> PRT

<213> antibody

<400> 27

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser His Leu

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Leu Pro Phe Gly

85 90 95

Gly Arg Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala

100 105

<210> 28

<211> 123

<212> PRT

<213> antibody

<400> 28

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Pro Ser Arg Phe Ser Ser Ser Ser Phe Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 29

<211> 109

<212> PRT

<213> antibody

<400> 29

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Ser

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Ser Thr Asn Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 128

<212> PRT

<213> antibody

<400> 30

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Glu Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys

50 55 60

Asp Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Lys Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Gly His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Lys Asn Pro Ile

100 105 110

Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120 125

<210> 31

<211> 114

<212> PRT

<213> antibody

<400> 31

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Asn

20 25 30

Gly Tyr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys

35 40 45

Arg Leu Ile Tyr Ser Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg

50 55 60

Phe Thr Gly Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Asn

85 90 95

Gly Asp Gly Asn Trp Ala Phe Gly Gln Gly Gly Arg Thr Lys Val Glu

100 105 110

Ile Lys

<210> 32

<211> 121

<212> PRT

<213> antibody

<400> 32

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Gly Trp Val Lys Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Gln Leu Ser Ser Val Thr Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Tyr Thr Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 104

<212> PRT

<213> antibody

<400> 33

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ser

20 25 30

Asn Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg

35 40 45

Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser

85 90 95

Leu Ile Arg Pro Phe Gly Gly Gly

100

<210> 34

<211> 129

<212> PRT

<213> antibody

<400> 34

Leu Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser

1 5 10 15

Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser

20 25 30

Tyr Asp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Glu Met Asn Pro Asn Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Arg Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Arg Gln Pro

100 105 110

Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 35

<211> 109

<212> PRT

<213> antibody

<400> 35

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val

65 70 75 80

Glu Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.一种人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

S2、制片：手动或自动将样本添加至载样介质上；

S3、孵育：采用免疫细胞化学染色技术和/或显色原位杂交技术孵育样品；

2.根据权利要求1所述的人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，其特征在于：所述步骤S3中，同时采用免疫细胞化学染色技术和显色原位杂交技术孵育样品，而后分别进行步骤S4阳性判断；当免疫细胞化学染色技术和显色原位杂交技术样品阳性检测结果不一致时，重复步骤S3和S4。

3.根据权利要求1所述的人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，其特征在于：所述步骤S4中，计算机扫描后自动计数的过程，依赖于评估模型的建立，所述评估模型的建立步骤包括：

S43、当模型精度符合预期，即可进行测试。

4.根据权利要求1所述的人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，其特征在于：所述步骤S4中，阳性样本判断的标准为：可计数样本细胞数量大于10000个的前提下，阳性染色细胞的数量大于10个。

5.根据权利要求1所述的人呼吸道上皮细胞病原细胞学检测方法，其特征在于：所述步骤S4中的通过计算机扫描后自动计数，其实现方式为对染色样品进行油镜高速扫描，图片自动上传服务器，然后对服务器中的图片进行自动计数并识别阳性细胞。

6.根据权利要求1所述的人呼吸道上皮细胞病毒细胞学检测方法中所采用的试剂盒，其特征在于：至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆或多克隆抗体以及结合标记物的核酸探针、细胞保存液、抗标记物抗体、酶标聚合物二抗、酶封闭液、以及染色液。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述标记物为地高辛或生物素，所述染色剂为DAB或AEC染色剂，所述酶封闭液为过氧化物酶封闭液。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞保存液含有0.2-2％质量分数的多聚甲醛、60–95％体积分数的乙醇。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞保存液中还包括终浓度为0.01M-0.03M的磷酸盐，并调整pH为7.2-7.6。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述呼吸道病原包括A型流感病毒、B型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型、冠状病毒SARS、冠状病毒MERS、冠状病毒2019-nCOV。