CN107941587A - 一种改进的Golgi‑Cox染色制备脑组织石蜡切片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改进的Golgi‑Cox染色制备脑组织石蜡切片的方法，该方法包括以下步骤：混合等体积的5％重铬酸钾水溶液、5％氯化汞水溶液、5％铬酸钾水溶液，避光静置1‑2天，分层后取上清作为工作液；将脑组织浸泡在工作液中，37℃恒温避光浸染2天；将染色后的脑组织转移至高尔基保护液中，4℃放置4‑7天，每天更换保护液；然后进行石蜡切片的制片。本发明对Golgi‑Cox染色液的配方进行了改进，将染色时间从14天缩短为2天；并且不需重复更换染色液，减少了染色液的耗费量和对环境的污染。同时，染色的效果显著优于传统染色。本发明方法利用高尔基保护液对浸泡过染色液的脑组织进行修复，降低了脑组织的脆弱性。
Description
技术领域
本发明属于神经组织染色、制片领域，具体涉及一种改进的Golgi-Cox染色制备脑组织石蜡切片的方法，其特点是简易和高效。
背景技术
高尔基染色法作为神经组织学的一种经典染色方法，可以清晰揭露神经元精细的形态结构，如胞体、轴突、树突及树突棘等，是定性定量分析神经元形态的重要手段。
目前，Golgi-Cox染色法、Golgi-Kopsch法及快速高尔基染色法是三种被广泛应用的神经元染色方法。其中，Golgi-Cox法由于染色结果稳定、背景颜色干扰小等优点而应用最广泛。
但传统的Golgi-Cox法有以下缺点：
(1)操作流程繁琐、耗时。整个过程包括Golgi-Cox溶液的配制(2天)、脑组织样品浸染(14天)、脑组织脱水及切片制样(3天)、切片晾干(1-3天)、切片显影、脱水、透明及封片处理。整个实验过程耗时长达约一个月，大大影响了实验进度，限制了Golgi-Cox法的应用；
(2)脑组织样品在Golgi-Cox溶液中浸染14天后变得很脆弱，无论是使用振动切片还是冰冻切片技术，均产生严重的碎片、裂片问题，导致脑片不完整，从而影响后续神经元的形态分析；
(3)Golgi-Cox溶液含有大量重金属成分，脑组织样品在Golgi-Cox溶液浸染期间，隔6小时或者一到两天后需要更换新鲜Golgi-Cox溶液，不仅耗量大、操作繁琐，而且废液处理过程中容易造成二次环境污染问题；
(4)由于传统制作方法中脑片的厚度较大，在显影过程中，掉片问题严重。这也是让实验者头疼的一个问题。
详细的Golgi-Cox染色操作流程于1981年公开发表，随后在1986年科学家开始应用冷冻切片制样法获得脑组织切片，1998年发展成振动切片制样法。目前，冰冻切片制样法及振动切片制样法是Golgi-Cox染色制得脑组织切片的两种应用最广泛的手段。
当前很多市售的高尔基染色试剂盒是基于传统的Golgi-Cox染色法发展而来的，比如国外生产的“HITO GOLGI-COX OPTIMSTAINTM PREKIT”和“FD快速高尔基染色试剂盒”，除了价格高、染色时间较长(2周)外，后期还局限于冰冻切片机及振动切片机制样。因此这两种制样法均有很大的局限性：冰冻切片机制作高尔基染色的脑组织切片时特别容易产生碎片、裂片问题，即使是熟手操作也难以避免；振动切片机则价格高昂，一般实验室难以负担。并且由于振动切片机一般更多用于制作活性切片，因此如将振动切片机同时应用于高尔基染色切片制样，过程中产生的交叉污染问题会影响对脑片活性要求较高的实验结果，因此限制了高尔基染色实验的顺利进行和普及。
而常规的石蜡切片技术因其繁琐的前处理步骤及后期难控的切片透明操作，使得切片的完整性难以保证，神经元损伤严重，从而影响其形态学分析，因此，高尔基染色的常规石蜡切片制样法没有得到广大科研人员的广泛采用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有Golgi-Cox染色法存在的缺点与不足，提供一种改进的Golgi-Cox染色制备脑组织石蜡切片的方法，其中的染色方法可以清晰显示神经元的形态特征，具有快速、经济、高质量的特点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种制备脑组织石蜡切片的方法，包括以下步骤：
(1)配制Golgi-Cox快速染色工作液并进行脑组织快速染色
等体积混合A液、B液和C液，避光静置1-2天，分层后取上清作为工作液；将脑组织浸泡在工作液中，37℃恒温避光浸染2天；
所述的A液是5％(W/V)重铬酸钾水溶液，B液是5％(W/V)氯化汞水溶液，C液是5％(W/V)铬酸钾水溶液；
Golgi-Cox的染色机理至今还不是很确切，当前大家公认的可能机理是：汞在铬酸盐的帮助下与蛋白质结合，白色的汞和硫代硫酸钠发生反应产生黑色的硫化汞从而可视。
传统染色方法耗时长、切片制作不完整，现有的改进方法也不能既保持切片的完整性，同时又能保持优良的神经元染色效果；并且Golgi-Cox染色具有随机性，若按照传统的Golgi-Cox染色法，温度不可控，染色稳定性较差，树突棘等细节染色效果不佳。但本专利的染色方法却既能够保持切片的完整性，又染色清晰，神经元和胶质细胞，尤其是树突棘的形态细节极为灵敏可靠。本专利研究发现，提高铬酸钾的比例，控制温度为37℃，只需2天染色时间，即可达到最佳成像效果，保证神经元分支及树突棘等细节被成功染色。这可能是由于铬酸钾加快了中间产物的形成，白色的汞更早与神经元蛋白结合，加快了染色进程，但具体的染色机理仍需科学家们进一步的探索证明。
(2)配制高尔基保护液及脑组织的浸泡保护
取300g蔗糖、10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、300mL乙二醇与500mL 0.1M的PBS缓冲液混合，加水定容至1000mL，为高尔基保护液；将染色后的脑组织转移至高尔基保护液中，4℃放置4-7天，每天更换保护液；
高尔基保护液实际上是一种冻存保护液，其主要作用是降低染色背景，并软化脑组织。泡完高尔基工作液的脑子又硬又脆，直接进行切片组织切片易碎且易裂。而本发明利用高尔基保护液对脑组织进行浸泡，高尔基保护液中的乙二醇成分能够渗入细胞内，起了软化脑组织的作用，配合简易的石蜡包埋，使得切片顺利进行，改善了组织间出现的裂痕问题，保持了神经元的完整性。
(3)脑组织的石蜡浸蜡、包埋和切片
脑组织从高尔基保护液取出后置于石蜡自动包埋仪中，浸蜡4h以上，然后包埋，冷却后置于-20℃过夜保存，第二天进行切片；
所述的切片可采用现有技术的振动切片，也可采用以下的石蜡切片制样：
使用全自动轮转式切片机，切片厚度调至150-250μm，利用毛笔刷将切片移至3％明胶溶液包埋的载玻片上，阴凉无尘处避光放置1-3天；
正是因为采用了步骤(1)和(2)的染色方法和保护措施，脑组织在保证染色效果的同时，其切片完整性也得到了保证；因此，本发明的切片方法不再用局限于冰冻切片和振动切片，而是能够自由地采用石蜡切片这种简易的切片方法，使改进后Golgi-Cox染色法的适用性得到极大地提高。
(4)石蜡切片的显色、脱水、透明和封片处理
将石蜡切片用双蒸水洗涤1-2min，接着用14％氨水浸泡30min；双蒸水洗涤2-3次，每次30s-2min；5％硫代硫酸钠处理10min；双蒸水洗涤1-2次，每次30s-2min；将切片分别置于50％、75％、95％的乙醇溶液中，脱水各4min，再于100％乙醇中浸泡2次，每次4min；将切片转移于等体积的100％乙醇、二甲苯、丙酮或氯仿混合液中，透明15min；最后用中性树胶封片。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明对Golgi-Cox染色液的配方进行了改进，将染色时间从14天缩短为2天；并且不需重复更换染色液，减少了染色液的耗费量和对环境的污染。同时，染色的效果显著优于传统染色。
2、浸染过染色液的脑组织样品比较脆弱，现有方法直接用30％蔗糖溶液脱水；但无论是使用振动切片及冰冻切片技术，均会出现脑片碎片、裂片的问题。而本发明方法利用高尔基保护液对浸泡过染色液的脑组织进行修复，降低了脑组织的脆弱性，切片时可以保持切片的完整性，有效克服了脑片碎片、裂片的问题。
3、本发明还提供了一种简单、易行的石蜡切片制样法，不仅实验操作简单，而且廉价，容易被广大常规实验室采用。
附图说明
图1是冰冻切片制样法结合传统Golgi-Cox法染色的大脑冠状切片图。
图2是实施例方法制得的大脑半脑冠状切片图。
图3和图4是实施例方法制得的大脑两层切片图。
图5和图6是放大50倍的海马CA1、CA3及DG区神经元的染色效果图。
图7和图8是放大100倍的海马CA1椎体细胞和DG颗粒细胞的形状图。
图9是放大200倍的海马CA1神经元形状图。
图10是放大200倍的海马DG颗粒细胞形状图。
图11是放大1000倍的海马CA1神经元形状图。
图12是放大1000倍的海马DG颗粒细胞树突棘形状图。
图13是放大400倍的皮层神经元形状图。
图14是放大1000倍的皮层神经元树突棘形状图。
图15是放大200倍的星型胶质细胞形状图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一种制备脑组织石蜡切片的方法，包括以下步骤：
(1)Golgi-Cox快速染色工作液的配制
分别配制5％重铬酸钾、5％氯化汞和5％铬酸钾储备液(储备液可以在室温下保存好几个月)，然后等体积混合A液(5％重铬酸钾)、B液(5％氯化汞)和C液(5％铬酸钾)。避光静置1-2天，充分反应后吸取上清过滤得到工作液。
(2)脑组织的快速Golgi-Cox染色
对出生21日龄的SD大鼠脱臼处死、取脑，0.9％生理盐水冲洗表面血丝，滤纸吸干水分后，将脑组织浸没在10mL的工作液中，37℃下，置于40rpm的摇床恒温箱中避光浸染2天。
(3)脑组织的保护
染色结束后，将染色液倒进废液缸，用配制好的高尔基保护液浸泡脑组织，4℃下放置4-7天，每天更换保护液。
高尔基保护液的配制如下：
(a)配制0.1M PBS：1.59g磷酸二氢钠+5.47g磷酸氢二钠+9g氯化钠+双蒸水，调pH值至7.2，定容至500mL；
(b)300g蔗糖+10g PVP+300mL乙二醇+500mL 0.1M PBS，定容至1000mL，4℃下可保存数月。
(4)脑组织的浸蜡及包埋
将脑组织从保护液取出，修成一定大小的脑块，置于石蜡自动包埋仪中，60℃下，浸蜡4-6h，然后包埋，冷却后置于-20℃过夜保存，第二天即可进行切片。
(5)石蜡切片
为避免切片的显影过程出现掉片的问题，切片前需对载玻片进行明胶包埋处理。事先配制3％明胶溶液，加热至56℃完全溶解后过滤使用。然后将载玻片置于3％明胶溶液中进行包埋，15min后将载玻片取出，无尘处晾干后转移至4℃冰箱保存，直至切片。
使用全自动轮转式切片机切片，切片厚度为150μm，用小号毛笔刷将切片移至3％明胶溶液包埋的载玻片上。阴凉无尘处避光放置1-3天后进行下一步的显色处理。
(6)切片的显色、脱水、透明及封片处理
(a)双蒸水洗涤1min，1次；
(b)14％氨水处理30min；
(c)双蒸水洗涤3次，每次30s；
(d)5％硫代硫酸钠处理10min；
(e)双蒸水洗涤2次，每次30s；
(f)将切片置于50％、75％、95％的乙醇溶液中分别脱水4min，再置于100％乙醇中浸泡2次，每次4min；
(g)将切片转移至等体积比的100％乙醇、二甲苯和丙酮(氯仿)的混合液中透明15min；
(h)中性树胶封片，片子晾干后，利用光学显微镜拍照观察。本发明使用莱卡正置荧光显微镜进行明场拍摄。
图1为冰冻切片制样法结合传统Golgi-Cox法染色的大脑冠状切片示意图，图2、图3和图4则是实施例方法制得的大脑冠状切片示意图。对比的结果显示：
(1)利用本发明方法获得的脑组织切片更完整，避免了切片裂片、碎片的问题；
(2)大脑半脑的快速Golgi-Cox染色效果优于全脑。
图5和图6是放大倍数为50倍的海马区Golgi-Cox染色效果示意图。图中结果显示：海马CA1及DG区着色神经元较多，排列整齐，CA3区着色神经元较少。
图7、图8、图9、图10、图11和图12是不同放大倍数下海马CA1区神经元和DG区颗粒细胞的示意图。图中结果显示：海马区神经元和颗粒细胞结构完整，树突着色清晰，树突棘明显，染色效果达到了树突分支及树突棘密度分析的要求，甚至可以对树突棘形态进行统计分析。
图13是放大倍数为400倍的皮层椎体神经元示意图，图14是放大倍数为1000倍的皮层神经元树突棘示意图。结果显示：皮层神经元的快速Golgi-Cox染色效果优良，神经元着色完整，结构清晰，树突棘细节明显。
以上染色结果说明了本方法是可行的。利用石蜡切片制样法结合快速的Golgi-Cox染色法显色大脑神经元，操作简单、易行，耗费经济，大脑海马区及皮层的神经元着色完整，树突及树突棘形态清楚明显，实现了快速、廉价、高质量染色脑组织神经元的目的，有利于研究人员对脑组织神经元形态进行观察分析。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种制备脑组织石蜡切片的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)等体积混合A液、B液和C液，避光静置1-2天，分层后取上清作为工作液；将脑组织浸泡在工作液中，37℃恒温避光浸染2天；
所述的A液是5％(W/V)重铬酸钾水溶液，B液是5％(W/V)氯化汞水溶液，C液是5％(W/V)铬酸钾水溶液；
(2)取300g蔗糖、10g聚乙烯吡咯烷酮、300mL乙二醇与500mL 0.1M的PBS缓冲液混合，加水定容至1000mL，为高尔基保护液；将染色后的脑组织转移至高尔基保护液中，4℃放置4-7天，每天更换保护液；
(3)脑组织的石蜡浸蜡、包埋和切片；
(4)石蜡切片的显色、脱水、透明和封片处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的石蜡浸蜡、包埋，是将脑组织置于石蜡自动包埋仪中，浸蜡4h以上，然后包埋，冷却后置于-20℃过夜保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的切片包括以下步骤：
使用全自动轮转式切片机，切片厚度调至150-250μm，利用毛笔刷将切片移至3％明胶溶液包埋的载玻片上，阴凉无尘处避光放置1-3天。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤(4)是将石蜡切片用双蒸水洗涤1-2min，接着用14％氨水浸泡30min；双蒸水洗涤2-3次，每次30s-2min；5％硫代硫酸钠处理10min；双蒸水洗涤1-2次，每次30s-2min；将切片分别置于50％、75％、95％的乙醇溶液中，脱水各4min，再于100％乙醇中浸泡2次，每次4min；将切片转移于等体积的100％乙醇、二甲苯、丙酮或氯仿混合液中，透明15min；最后用中性树胶封片。
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|---|---|---|---|---|
| CN110132690A (zh) * | 2019-06-05 | 2019-08-16 | 河南城建学院 | 一种大脑组织冰冻切片的甲苯胺蓝快速染色方法 |
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2017
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