CN110068559B - 一种生物组织透明化成像方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种生物组织透明化成像技术的改进及其应用,所述方法为CUBIC(Clear,Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational Analysis)技术的改进,主要改进了CUBIC光透明技术的透明化效率以及GFP荧光的保持;该方法命名为f‑CUBIC(fast fluorescent‑CUBIC)。处理方法是向光透明试剂CUBIC‑L中加入胰脂酶lipase,以增加CUBIC‑L的脱脂能力,提高透明化的效率,另外,用NaOH调节折射率匹配试剂CUBIC‑R的pH值,提高透明化组织对GFP荧光信号的保持。本专利技术的试剂易于购买,价格便宜,操作简便,特别适合于对透明化困难的高脂含量组织的处理,如肝脏、脾脏等,且透明化时间短,荧光保持效果好,适用于多色光透明化荧光成像,提升了样本的荧光成像质量,扩大了样本的适用范围。
Description
技术领域
本发明属于生物样本处理和光学成像技术领域,尤其涉及一种生物组织透明化成像方法。
背景技术
近年来,生物组织光透明技术在生物成像中的应用越来越热门,并被广泛应用于完整组织的大体积成像。对于高精度生物组织的光学成像,之前的研究主要集中在薄层样本的小区域二维成像,对三维成像数据的获取还主要依赖于样本的逐层切削成像。生物组织光透明技术的发展结合先进的光学成像技术,在大组织样本的三维成像研究中发挥了重要作用,它能够对不透明的样本进行透明化处理,减少光在组织样本中的散射与吸收,极大地提高样本的成像深度,在不破坏样本结构的基础上,为我们提供深层样本单细胞分辨率下的结构信息,使得光学成像观察大组织甚至完整个体的三维立体微观结构成为可能。
根据光透明技术的具体处理方案,目前将光透明技术分为四类。第一类为简单浸泡型,代表性的方法为2013年Takeshi Imai实验室发明的SeeDB方法(Ke M T,Fujimoto S,Imai T.Nature Neuroscience.(2013)16:1154-1161)。第二类为有机溶剂型,代表性的方法为DISCO系列,如2012年Ali Ertürk等人发明了3DISCO的光透明技术(Ertürk,Ali,Becker K,et al.Nature Protocols(2012)7(11):1983-1995.);2014年Tessier-Lavigne课题组在3DISCO的基础上引入免疫荧光标记,命名为iDISCO(Renier N,Wu Z,Simon D J,et al.Cell(2014)159(4):896-910.);以及2016年,进一步改进3DISCO光透明技术后的uDISCO(Pan C,Cai R,Quacquarelli F P,et al.Nature Methods(2016)13:859–867.)等。第三类为基于水凝胶技术的透明方法,最具代表性的为2013年Karl Deisseroth课题组发明的Clarity光透明技术(Chung K,Wallace J,Kim S Y,et al.Nature(2013)497(7449):332-337.)。第四类为水化作用型,代表性技术为2014年Hiroki R.Ueda实验室发明的CUBIC技术,通过水溶性的化学试剂对样本进行脱脂以及折射率匹配对小鼠大脑的光透明成像,发现氨基醇类物质的脱脂作用对富含脂质成分的大脑具有较好的透明效果(Susaki,E.A.et al.Cell(2014)157,726–739);2014年下半年该实验室又发现氨基醇类还能够对血红素成分进行提取,具有很好的脱色效果,从而实现了对脑以外的其他器官甚至整个小鼠进行过透明(Tainaka K,Kubota S I,Suyama T Q,et al.Cell,2014,159(4):911-924.);到了2017年,他们实验室依据光透明试剂折射率对组织透明度的影响,对光透明试剂进行了优化,实现了对大器官肿瘤转移过程的研究(Kubota S I,Takahashi K,Nishida J,etal.Cell Reports(2017)20(1):236.);2018年,又进一步筛选能够使组织膨胀的光透明试剂,实现了对小鼠全脑亚细胞水平的脑细胞图谱成(Murakami T C,Mano T,Saikawa S,etal.Nature Neuroscience(2018)21,625–637)。
综合以上技术,与简单浸泡型SeeDB方法相比,CUBIC技术的透明度会明显高一些;相比于水凝胶型Clarity技术复杂的操作以及重复性差的特点,CUBIC技术的操作更为简单易于重复;另外,相比于Clarity以及有机溶剂型的DISCO系列高毒性的特点,CUBIC技术的另一个显著性优势是毒性较小,实验过程中几乎不需要特殊防护(王培新,张丹,尚爱加,etal.神经解剖学杂志(2016)32(1):124-128.)。
CUBIC技术是通过脱脂的方式来实现透明化的,该技术的操作时间上相对较长,不对组织进行染色的情况下,对于肝脏这种高脂肪含量的样本也需要至少9天的时间来实现透明化,严重影响了实验获取数据的效率,并且透明化时间越长越不利于荧光蛋白的保持,丢失样本成像细节(如神经元轴突、小胶质细胞触角等)的可能性越大。且CUBIC的折射率匹配试剂会对GFP荧光产生一定影响。并且,肝脏这种特殊的组织样本,脂肪含量高,且结构组成致密,目前现存的透明化技术还很难实现对肝脏样本较好的透明化。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了一种生物组织透明化成像方法,所述方法是光透明方法CUBIC的改进,既可以提高高脂肪含量样本的透明化效率,又可以保证对GFP荧光强度的保持增加。该方法通过胰脂酶lipase的作用以及折射率匹配试剂pH值的调节,使得CUBIC技术透明效率更快,GFP荧光保持更好,从而实现其对肝脏等脂肪含量较高的样本更好的进行透明化,实现其在大组织器官成像研究中的诸多应用,不仅可以实现对局部更深层次样本的光学成像,而且能够对完整样本进行大体积成像数据的获取,结合荧光标记,还可以对病理状态如肿瘤微环境的大尺度多色成像,对于研究单细胞分辨率下组织结构的分布以及肿瘤与免疫细胞、脉管之间的作用关系均有重要作用。
一种生物组织透明化成像方法,步骤包括:
S1、称取100-500U/mg的胰脂酶粉末溶解到CUBIC-L试剂中,使胰脂酶含量为4-100U/mL,得到CUBIC-L试剂A;
S2、将离体组织在PFA溶液内浸泡,固定完成后清洗;
S3、将步骤S1所得试剂稀释一倍得到CUBIC-L试剂B;
S4、先采用CUBIC-L试剂B对步骤S2所得离体组织进行摇床孵育,再采用CUBIC-L试剂A对离体组织进行摇床孵育,定期换液直到离体组织透明;
S5、清洗步骤S4所得透明组织,用稀释后的CUBIC-R试剂对透明组织进行摇床孵育,孵育好的组织用CUBIC-R试剂进行折射率匹配。
上述方法通过在CUBIC脱脂阶段的CUBIC-L试剂中加入胰脂酶lipase增强脱脂试剂的脱脂能力,显著提高了CUBIC技术对高脂肪含量样本的透明化效率,进而缩短获取光透明样本成像数据的时间。该方法适用于高脂肪含量组织的处理,例如肝脏、脾脏等,能够实现转基因荧光小鼠高脂肪含量的肝脏样本的透明化,并联合光学成像,用于观察肝脏深层样本的结构组成。
优选的,步骤S2中,先对动物样本进行灌流,然后获取所述离体组织样本;依次采用1×PBS、PFA溶液和含胰脂酶的PBS饱和试剂进行所述灌流;所述含胰脂酶的PBS饱和试剂的配制步骤包括:向1×PBS中加入100-500U/mg的胰脂酶粉末,溶解混匀,过滤去除不溶解的部分;其中,每100mL的1×PBS中加入0.15-0.25g胰脂酶粉末。具体的,所述动物样本可以是小鼠,所述灌流可以在已死亡的动物样本上进行。
更加优选的,采用200或400目纱布进行上述过滤操作,滤液于4℃下保存备用。
更加优选的,采用所述1×PBS灌流8-12min;采用PFA溶液灌流8-12min;采用含胰脂酶的PBS饱和试剂灌流50-70min。
进一步优选的,所述PFA溶液为4%PFA;具体的,灌流1×PBS、4%PFA后再慢速灌流含lipase的饱和PBS。
优选的,步骤S2中,所述浸泡时长为23-25h,所述清洗为采用1×PBS对固定后的组织在室温下进行摇床清洗2-4次,每次清洗时长不少于2小时。具体的,所述PFA溶液采用4%PFA。
优选的,步骤S4中,采用CUBIC-L试剂B在36-38℃下对组织进行摇床孵育5-7h;采用CUBIC-L试剂A在36-38℃下对组织进行摇床孵育,孵育期间每23-25h换液一次直至组织变透明。
优选的,步骤S5中,所述清洗方法为:用1×PBS在室温下摇床清洗2-4次,每次清洗时长不少于2小时。
优选的,步骤S5中,所述稀释的倍数为一倍,且采用碱性试剂调节CUBIC-R试剂的pH至9~9.5。通过pH值的测量,我们发现,CUBIC方法中折射率匹配试剂的pH值只有6.1-6.5之间,对于GFP这种耐碱不耐酸的荧光蛋白来讲,CUBIC的折射率匹配试剂会对GFP荧光产生一定影响,因此采用碱性试剂将CUBIC技术的折射率匹配试剂的pH值提高到GFP保持效果最好的9.5左右,实现了对GFP荧光更亮更持久的保存。
更加优选的,步骤S5中,所述碱性试剂采用浓度1mol/L的NaOH。
更加优选的,步骤S3和步骤S5中,采用ddH2O进行所述稀释。
优选的,步骤S5中,采用稀释后的CUBIC-R试剂室温下对透明组织进行摇床孵育5-7h。
优选的,步骤S5中,对孵育好的样本用CUBIC-R进行24小时折射率匹配,所述折射率匹配时间为23-25h。
上述改进之后的光透明方案能够应用于病理状态下肝脏样本的透明化,采用荧光蛋白标记免疫细胞的转基因小鼠,经脾肝转移表达荧光蛋白的肿瘤细胞,并通过免疫荧光抗体标记肝脏血管,可以对肿瘤微环境进行多色标记,配合显微光学成像,可以实现对肿瘤微环境中的肿瘤细胞与免疫细胞以及血管之间的空间分布以及相互作用关系。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明针对CUBIC光透明技术存在透明时间长的缺陷,通过胰脂酶试剂显著提高了CUBIC透明化效率,能够对肝脏等脂肪含量较高的样本实现更快速的透明化,显著缩短了透明化所需时间。
(2)本发明针对CUBIC光透明技术对GFP荧光保持存在潜在影响的缺陷,通过调节光透明折射率匹配试剂pH值的方式有效增强了对GFP荧光的保持。
(3)本发明提供的CUBIC的改进方案,能够应用在难以透明化肝脏样本光透明成像方面,即可通过光透明结合显微光学成像的方式获取肝脏样本深层结构的成像。同时,本发明与标记免疫细胞和脉管的转基因小鼠、外源性荧光蛋白标记肿瘤细胞,以及抗体标记的肝脏血管相结合,并通过显微光学成像来实现在大体积甚至完整器官水平下,对多色标记肝脏肿瘤微环境中的免疫细胞、肿瘤和血管空间信息的获取。
附图说明
图1为改进CUBIC透明化方案在肝脏多色成像模型以及肝脏肿瘤模型中的应用技术路线图。
图2为lipase的分子结构。
图3为不同处理条件下(包括改进的方法与原CUBIC对照的方法),8周大CX3CR1-GFP纯和小鼠与mTmG-tdtomato小鼠杂交获得的转基因小鼠(CX3CR1-mTmG)肝叶透明化的效果图。
图4为不同处理条件下,CUBIC透明化8周龄小鼠肝脏样本的时间轴。
图5为对不同处理条件下8周龄CX3CR1-mTmG小鼠肝叶的共聚焦成像,获得的Z轴方向2.6mm厚样本的RFP以及GFP荧光图展示。
图6为对图5中的样本进行最大值投影后分析中间相同层面2mm厚样本的RFP以及GFP的荧光表达情况。
图7为图5中的样本最深层2mm样本,每500μm为一层,最大值投影后获得的不同层面样本RFP以及GFP的荧光表达情况。
图8为对折射率匹配试剂调节pH值前(pH=6.5)后(pH=9.5)的荧光成像结果对比图。
图9为图8两幅图最大值投影后的荧光表达情况的量化分析。
具体实施方式
本发明主要提供了一种生物组织透明化成像方法,成功克服了CUBIC光透明技术对高脂肪含量样本透明化效果不佳、透明化效率低、耗时长、GFP荧光保持不佳的缺陷。
为了克服上述缺陷,本发明提供的生物组织透明化成像方法包括如下步骤:
(1)配制1×PBS:PBS粉末配制1L 1×PBS,用1mol NaOH溶液调节pH值到7.4,之后用滤膜对配制好的PBS过滤处理后放4℃备用。
(2)配制4%PFA:用配好的1×PBS配制4%PFA,调节pH值到7.4,放4℃保存。
(3)配制含lipase的PBS饱和试剂:向200mL 1×PBS中加入0.4g100-500U/mg的lipase粉末,溶解混匀,并用200/400目纱布过滤,去除不溶解的部分,4℃保存。
(4)配制CUBIC-L试剂:10%质量体积比的TritonX-100与10%质量体积比的N-丁基乙二胺,例如40g TritonX-100与40g N-丁基乙二胺共同定容溶解到400mL ddH2O中。用千分天平称量100-500U/mg的lipase粉末溶解到配制好的CUBIC-L中,使lipase得含量达到4-100U/mL,得到CUBIC-L试剂A。
(5)配制CUBIC-R试剂:45%质量体积比的安替比林与30%质量体积比的烟酰胺,例如180g安替比林和120g烟酰胺共同定容溶解到400mL ddH2O中,配制好试剂后用1M NaOH调节pH值到9.5左右。
(6)对动物样本进行灌流,采用常规方法灌流或者依次灌流10分钟的1×PBS以及10分钟的4%PFA,最后再慢速灌流1小时含饱和lipase的PBS。
(7)将离体组织样本浸泡4%PFA 24h,再用1×PBS对固定好的样本进行室温下摇床清洗3次,每次不少于2小时。
(8)对样本清洗完成后,用游标卡尺测量样本的长宽高尺寸信息,用于作为样本的初始尺寸。
(9)将含有lipase的CUBIC-L试剂A用ddH2O稀释一倍后得到CUBIC-L试剂B,采用CUBIC-L试剂B对样本进行37℃摇床孵育6小时。
(10)将含CUBIC-L试剂B换成CUBIC-L试剂A后,于37℃摇床孵育,每24小时换液一次直到样本变得透明。
(11)对透明后的样本用1×PBS室温下摇床清洗3次,每次不少于2小时。
(12)样本清洗好之后,用通过1M NaOH溶液调节pH值到9~9.5的50%CUBIC-R试剂室温下摇床孵育6小时。所述50%CUBIC-R试剂为CUBIC-R试剂稀释一倍。
(13)对孵育好的样本用CUBIC-R进行24小时折射率匹配。
为了更好的理解上述技术方案,下面通过具体实施例对本申请技术方案做详细的说明,应当理解本申请实施例以及实施例中的具体特征是对本申请技术方案的详细的说明,而不是对本申请技术方案的限定。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。例如,本发明所述室温指温度10~30℃。
本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。例如,本发明用到的1×PBS、4%PFA、CUBIC-L试剂、CUBIC-R试剂可按上述方法配制后使用,也可在市场上购买后直接使用。
实施例1
本实施例提供了一种生物组织透明化成像方法,该方法是对CUBIC光透明方案的改进。
对于CUBIC光透明技术在高脂肪含量肝脏样本中的光学成像应用,我们首先对CUBIC光透明技术的方案进行了优化,采用的样本为8周大CX3CR1-mTmG小鼠肝叶,步骤包括:
(1)配制1×PBS:PBS粉末配制1L 1×PBS,用1mol NaOH溶液调节pH值到7.4,之后用滤膜对配制好的PBS过滤处理后放4℃备用。
(2)配制4%PFA:用配好的1×PBS配制4%PFA,调节PH值到7.4,放4℃保存。
(3)配制CUBIC-L试剂:10%质量体积比的TritonX-100与10%质量体积比的N-丁基乙二胺,例如40g TritonX-100与40g N-丁基乙二胺共同定容溶解到400mL ddH2O中。用千分天平称量100-500U/mg的lipase粉末溶解到配制好的CUBIC-L中,使lipase得含量达到10-50U/mL,得到CUBIC-L试剂A。
(4)配制CUBIC-R试剂:45%质量体积比的安替比林与30%质量体积比的烟酰胺,例如180g安替比林和120g烟酰胺共同定容溶解到400mL ddH2O中,配制好试剂后用1M NaOH调节pH值到9.5左右。
(5)对已经死亡的小鼠进行灌流,依次灌流10分钟的1×PBS以及10分钟的4%PFA。
(6)对样本灌流完成后浸泡4%PFA 24h,再用1×PBS对固定好的样本进行室温下摇床清洗3次,每次2小时。
(7)对样本清洗完成后,用游标卡尺测量样本的长宽高尺寸信息,用于作为样本的初始尺寸。
(8)将含有lipase的CUBIC-L试剂A用ddH2O稀释一倍后得到CUBIC-L试剂B,采用CUBIC-L试剂B对样本进行37℃摇床孵育6小时。
(9)将含CUBIC-L试剂B换成CUBIC-L试剂A后,于37℃摇床孵育,每24小时换液一次直到样本变得透明。
(10)对透明后的样本用1×PBS室温下摇床清洗3次,每次2小时。
(11)样本清洗好之后,用50%CUBIC-R试剂室温下摇床孵育6小时。所述50%CUBIC-R试剂为CUBIC-R试剂稀释一倍。
(12)对孵育好的样本用CUBIC-R进行24小时折射率匹配。
实施例2-4
实施例2-4分别提供了一种生物组织透明化成像方法,各方法的步骤均与实施例1基本一致,区别如下:
实施例2中,CUBIC-L试剂A的配制方法为:用千分天平称量100-500U/mg的lipase粉末溶解到配制好的CUBIC-L中,使lipase得含量达到4-20U/mL。其余步骤与实施例1一致。
实施例3中,对死亡小鼠进行正常灌流后,慢速灌流含饱和lipase的PBS试剂1小时。配制含lipase的PBS饱和试剂方法为:向200mL 1×PBS中加入0.4g 100-500U/mg的lipase粉末,溶解混匀,并用200/400目纱布过滤,去除不溶解的部分,4℃保存。CUBIC-L试剂A与CUBIC-L试剂B中均不含有lipase,即按与实施例1相同方法配制好的CUBIC-L试剂直接作为CUBIC-L试剂A,将CUBIC-L试剂A稀释一倍后得到CUBIC-L试剂B。其余步骤与实施例1一致。
实施例4中,CUBIC-L试剂A与CUBIC-L试剂B中均未添加lipase,即该方法各步骤中均未添加lipase,其余步骤与实施例1一致。
实施例1-4中在不同处理条件下8周龄CX3CR1-mTmG小鼠肝叶透明化之后的透明效果图如附图3所示,从图3很明显的可以看出,各组的透明化程度均比较高,能够清楚的看到背景网格。图4展示了实施例1-4各组样本处理的时间,从时间上来看,与实施例4采用中标准的原CUBIC透明化所需时间相比,其他几个lipase处理组的时间均有明显的减少,透明化的效率更高。
实施例5
本实施例提供了通过加lipase改进后CUBIC方案处理下样本的光学成像效果。
为了检测不同改进条件下CUBIC方案对荧光保持的影响,我们对实施例1和实施例2中透明化之后的CX3CR1-mTmG小鼠的肝叶进行了共聚焦显微光学成像:
我们采用LSM 780NLO共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)的10倍水镜进行成像,激发光为488nm与633nm,在同一成像条件下对不同组的样本进行了荧光成像,从图5中可以看出各组在RFP荧光的保持上相对都比较好,成像深度都可达到2.6mm以上,但从样本RFP荧光保持的均一性上来讲,4-20U/mL组效果最好;对于GFP荧光的保持,可以很明显的看出与高浓度lipase组以及原CUBIC组相比,4-20U/mL组以及饱和lipase灌流组的GFP荧光保持要强很多。图6是截取了图5中相同层面2mm厚样本在ImageJ软件上进行最大值投影后分析的RFP以及GFP荧光的保持,从图中可以看出,在RFP的荧光保持上,各组之间没有明显的差异,而GFP的荧光表达在4-20U/mL组效果要明显较好。图7是2.6mm样本最深层2mm的成像数据每500um为一层,在ImageJ软件上进行最大值投影后分析的不同层面上RFP荧光和GFP荧光的保持情况,从图中可以看出,在深层样本荧光的保持效果上4-20U/mL组的效果更好。
其中,RFP荧光的表达在整个样本中较为均一化,分析荧光表达水平时只在获得最大投影之后,各组均圈出相同大小的矩形区域进行分析比较。而GFP荧光表达于免疫细胞,在整个肝脏中的分布不具均一性,我们在获得最大值投影后,会手动圈出近100个细胞的轮廓,再进行细胞轮廓内的荧光表达量分析。
实施例6
本实施例提供了调节PH值后的CUBIC方案处理下样本的光学成像效果。
本实施例分别对实施例1-4中步骤(12)进行了如下调整:样本清洗好之后,用通过1M NaOH溶液调节pH值到9~9.5的50%CUBIC-R试剂室温下摇床孵育6小时。其余步骤保持不变。
为检测调节pH值到GFP荧光保持最佳值9~9.5后,GFP荧光的表达情况,我们对透明化后的CX3CR1-GFP小鼠肝叶进行了共聚焦显微成像:
我们采用1M的NaOH试剂来调节折射率匹配阶段的pH值,并用LSM 780 NLO共聚焦显微镜(Zeiss,Germany)的10倍水镜进行成像,GFP通道的激发光为488nm,如图8所示,在同一成像条件下,调节折射率匹配阶段试剂的pH值到9.5后,样本的背景荧光明显要小很多,之后,通过与图6中GFP荧光表达相同的分析过程,我们发现,如图9所示,在调节pH值到9.5之后样本的GFP荧光表达更亮。
尽管已描述了本发明的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种生物组织透明化成像方法,步骤包括:
S1、称取100-500U/mg的胰脂酶粉末溶解到CUBIC-L试剂中,使胰脂酶含量为4-100U/mL,得到CUBIC-L试剂A;
S2、将离体组织在PFA溶液内浸泡,固定完成后清洗;
S3、将步骤S1所得试剂稀释一倍得到CUBIC-L试剂B;
S4、先采用CUBIC-L试剂B对步骤S2所得离体组织进行摇床孵育,再采用CUBIC-L试剂A对离体组织进行摇床孵育,定期换液直到离体组织透明;
S5、清洗步骤S4所得透明组织,用稀释后的CUBIC-R试剂对透明组织进行摇床孵育,孵育好的组织用CUBIC-R试剂进行折射率匹配。
2.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S2中,先对动物样本进行灌流,然后获取所述离体组织样本;依次采用1×PBS、PFA溶液和含胰脂酶的PBS饱和试剂进行所述灌流;所述含胰脂酶的PBS饱和试剂的配制步骤包括:向1×PBS中加入100-500U/mg的胰脂酶粉末,溶解混匀,过滤去除不溶解的部分;其中,每100mL的1×PBS中加入0.15-0.25g胰脂酶粉末。
3.根据权利要求2所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:采用所述1×PBS灌流8-12min;采用PFA溶液灌流8-12min;采用含胰脂酶的PBS饱和试剂灌流50-70min。
4.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S2中,所述浸泡时长为23-25h,所述清洗为采用1×PBS对固定后的组织在室温下进行摇床清洗2-4次,每次清洗时长不少于2小时。
5.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S4中,采用CUBIC-L试剂B在36-38℃下对组织进行摇床孵育5-7h;采用CUBIC-L试剂A在36-38℃下对组织进行摇床孵育,孵育期间每23-25h换液一次直至组织变透明。
6.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S5中,所述稀释的倍数为一倍,且采用碱性试剂调节CUBIC-R试剂的pH至9~9.5。
7.根据权利要求1或6所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S3和步骤S5中,采用ddH2O进行所述稀释。
8.根据权利要求6所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S5中,所述碱性试剂为浓度1mol/L的NaOH。
9.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S5中,采用稀释后的CUBIC-R试剂室温下对透明组织进行摇床孵育5-7h。
10.根据权利要求1所述的生物组织透明化成像方法,其特征在于:步骤S5中,所述折射率匹配时间为23-25h。
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