CN103471898A

CN103471898A - 一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法

Info

Publication number: CN103471898A
Application number: CN2013104601120A
Authority: CN
Inventors: 胡繁; 葛梦梦; 汪惠丽; 王艳; 刘志华; 徐丽
Original assignee: Hefei University of Technology
Current assignee: Hefei University of Technology
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明公开了一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，特征是先以质量体积比浓度为5%重铬酸钾、5%氯化汞和5%铬酸钾的水溶液按照体积比1∶1∶1的比例配制成高尔基银染溶液，将脑组织浸泡于37℃银染溶液中36-48小时，将浸泡好的脑组织在振动切片机上进行切片，将组织切片置于明胶包被的载玻片上，放置过夜，然后进行常规的氨水显影，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片，显微镜观察。采用本发明方法能够快速准确的对大脑各部分脑区进行染色，且染色结果清晰，细节明显，便于研究人员观察脑组织的神经元结构，为临床病例分析神经系统的病变提供了便捷的手段，对于神经学的基础研究领域同样具有重大的意义。

Description

一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法

技术领域

本发明属于神经病理学组织染色法技术领域，具体涉及基于高尔基银染法的快速神经组织染色的方法。

背景技术

已有的科学研究表明，大脑神经系统有一类专门负责传递和处理神经信号的兴奋性细胞---有棘神经元，主要是由于神经元树突上分布的形态各异的小突起---树突棘而得名。神经元的树突树的精细构筑调控了神经元之间复杂的突触连接，并依此来调节神经信号的传递。树突棘是神经元上突触输入的重要靶点，它与突触可塑性有直接的相关性。因此观察有棘神经元的树突结构的改变对解释大脑复杂的功能基础和神经疾病的病变机理提供了直接证据。

在组织学染色领域，高尔基银染法是目前应用最为广泛的一种观察神经元形态的染色方法，可以用来分析神经元的树突结构和树突棘形态。因其操作方便，耗费小，染色效果好，对显微镜要求低，并且该方法的组织切片在200微米左右可以清晰的显示整个神经元树突的形态。它的传统操作流程是在染色液配置好后，将一定大小的脑组织放置其中，室温避光保存，两天后需要换置新鲜的染色液，14天后取出脑组织进行切片、显影和观察。但是该方法目前还存在一系列问题，比如整个过程费时、切片容易成碎片、染色时容易掉片等等。特别是由于浸染时间需要14天，大大影响了实验进程。目前有很多研究组对该染色方法进行了一些改进来避免上述问题，比如替换显影液，氧化剂等，但是实验时间最短也要5天，也有相关报道将浸染温度改为37℃，但是因为浸染时间的问题，染色效果不如原始方法的好。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，以实现快速观察在体神经元结构，从而能够为临床病例分析神经系统的病变以及神经学的基础研究提供便捷的手段。

本发明基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，其特征在于包括以下步骤：

先以质量体积比浓度为5%重铬酸钾、5%氯化汞和5%铬酸钾的水溶液按照体积比1:1:1的比例配制成高尔基银染溶液；

将待神经元染色的脑组织浸没在上述配制的银染溶液中，在37±2℃环境温度下浸泡36到48小时；

然后利用振动切片机将浸泡好的脑组织进行切片，并置于明胶包被的载玻片上，用保鲜膜包裹整个载玻片，放置过夜；

将上述放置过夜的切片经过氨水显影，梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后用中性树胶封片。

所述将浸泡好的脑组织进行切片的步骤为：取出浸泡好的脑组织，用磷酸缓冲液冲洗，然后将振动切片机的有关参数设定为：振幅0.45毫米，切片前进速度0.55毫米/秒，切片厚度为200微米，采用振动切片机进行切片。

由于本发明采用了在将组织浸泡的温度从传统高尔基染法采用的室温提高至37±2℃的同时将浸泡时间控制在36到48小时之间，从而在保证染色效果与传统效果类似的基础之上，有效地克服了传统高尔基染色耗时14天的长时程操作、大大精简了传统实验步骤，不需要不断更新浸泡液，同时由于浸泡时间短和振动切片机合理使用，有效克服了传统切片操作难、易碎片的缺点。本发明方法为神经元形态观察提供了一种快速有效的新途径，为神经领域的临床分析和科学研究提供了一种有效的检测手段。

附图说明

图1到图6为采用本发明基于高尔基银染法在不同浸染时间分别处理24小时、36小时、48小时、3天、6天和9天后的锥体神经元的示意图。

图7、图8和图9为本实施例中分别对不同脑组织采用本发明基于高尔基银染法在浸染时间为48小时的神经元示意图。

具体实施方式

实施例1：

下面结合附图通过实施例对本发明作进一步具体详细的说明。

本发明基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，具体实施操作步骤包括：

1）配制银染溶液：将质量体积比浓度为5%重铬酸钾（国药）、5%氯化汞（国药）和5%铬酸钾（国药）水溶液按1:1:1的体积比例配制混合好，避光放置。

2）准备样本：大鼠（SD）经过二氧化碳麻醉后，利用蠕动泵进行心脏灌流，灌流液为生理盐水，然后快速断头取脑，将半脑浸没在已配好的银染染色液中。

3）组织样本浸染：按照1:5的体积比将脑组织侵入银染溶液中，避光放置。在37±2℃环境温度下浸泡36到48小时。

4）切片：取出浸泡好的脑组织，用PBS缓冲液冲洗，然后用振动切片机（本实施例中采用的是德国制造的莱卡V1000S振动切片机）进行切片，各有关参数设定为：振幅为0.45毫米，切片前进速度为0.55毫米/秒，切片厚度为200微米，最后组织切片置于明胶包被的载玻片上，用保鲜膜包裹整个载玻片，放置过夜。

5）显影，制片及观察：切片经过氨水显影，梯度酒精脱水，利用100%酒精，二甲苯和丙酮新鲜配置的混合液，透明15分钟，中性树胶封片，最后在普通光学显微镜下观察（本实施例中采用的是日本制造的尼康Eclipse80i光学显微镜）。

图1到图6为采用本发明基于高尔基银染法在不同浸染时间分别处理24小时、36小时、48小时、3天、6天和9天后的锥体神经元的示意图。图中的结果显示：浸泡36小时和48小时的组织染色效果比较好，神经元的树突棘比较清晰，细胞结构比较完整。而24小时的染色结果，虽然树突着色较深，但是树突棘部分很容易成团，不利于观察，到了第三天和第六天的结果树突棘虽然还在，但是很多部位已经开始掉色，也就是背景中出现很多黑色斑点，到了第九天，神经元结构有了明显的皱缩，神经元只剩下主干的结构，并且主干的树突上的树突棘也有明显的皱缩，成团状分布在树突的第一级分支上。

图7、图8和图9为本实施例中分别对不同脑组织采用本发明基于高尔基银染法在浸染时间为48小时的神经元示意图。其中图7为大脑视皮层锥体神经元（A），图8为海马区锥体神经元(B)，图9为海马区颗粒细胞(C)。从图7、图8和图9中可以看出：大脑视皮层的锥体神经元以及海马区的锥体神经元和颗粒细胞整体染色清晰，特别是这三类神经元上的树突棘结构完整，细节清楚，可以充分用于临床的病理分析，该结果说明实施例中的各个条件的设定都是合理可行的，采用本发明基于高尔基银染法在环境温度37℃下浸染48小时的不同脑区的神经元整体结构完整，树突着色深，树突棘的结构清晰，同时缩短了常规的实验流程，操作方便，利于研究人员进行脑组织病理形态的观察分析。

Claims

1.一种基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述基于高尔基银染法的快速神经元染色方法，特征在于所述将浸泡好的脑组织进行切片的步骤为：取出浸泡好的脑组织，用磷酸缓冲液冲洗，然后将振动切片机的有关参数设定为：振幅0.45毫米，切片前进速度0.55毫米/秒，切片厚度为200微米，采用振动切片机进行切片。