CN101458182A - 一种小动物全脑标本的制备方法 - Google Patents

一种小动物全脑标本的制备方法 Download PDF

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骆清铭
张斌
李安安
龚辉
王冰然
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Abstract

本发明公开一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤：a.取小动物脑样本，将其固定浸染；b.将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为pH值大于10的碱液，黑化时间为1～24小时；c.将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；d.将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；e.将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；f.将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～96小时。本发明的小动物全脑标本的制备方法可以染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色，能够在亚微米尺度观察全脑神经元三维形态结构。

Description

一种小动物全脑标本的制备方法
技术领域
本发明涉及一种标本的制备方法，特别是涉及一种小动物全脑标本的制备方法。
背景技术
制作脑部神经元染色标本，观察神经元形态，在临床诊断和科学研究中都应用广泛。它主要涉及两种技术：神经元染色和标本包埋技术。其中神经元染色技术主要包括两类：Golgi-Cox染色，普通染料(如苏木精，亚甲基蓝)染色。包埋技术按包埋剂的不同主要分为石蜡包埋、火棉胶包埋和树脂包埋等。
根据染色技术和包埋技术的不同组合，目前常用的神经元染色标本制备方法主要有以下几类：
石蜡切片标本：临床病理分析通常制作石蜡标本。其主要步骤是：标本整体石蜡包埋，再切片，然后使用普通染料对切片染色，最后装裱切片。
火棉胶全脑标本：其主要步骤是：标本先整体Golgi-Cox染色，再整体火棉胶包埋。
树脂切片标本：其主要步骤是：标本整体树脂包埋，再半薄切片，然后使用美蓝-品红等染料对切片进行染色，最后装裱切片。
以上各方法的主要性能参数如表1所示：
表1
标本                制作流程           染色方法        包埋剂       切片厚度(微米)
石蜡切片标本    整体包埋，切片后染     染料染色        石蜡           4-20
                        色
火棉胶全脑标本  整体染色，再包埋      Golgi-Cox法      火棉胶         5-200
树脂切片标本   整体包埋，切片后染色   染料染色     树脂    0.5-2
以上方法能满足很多需要，但有以下不足：无法在三个方向以相同的亚微米级分辨率观察全脑神经元三维形态。石蜡标本和火棉胶标本的切片较厚，观察神经元三维形态时，纵向分辨率(5微米)远低于横向分辨率(亚微米)。树脂切片标本虽然能获得亚微米切片，但是制作的标本不是全脑标本，且染色方法仅仅只染神经元胞体而不染神经元的树突和轴突，因此无法观察全脑神经元的完整形态。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种小动物全脑标本的制备方法，可以染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色，能够在亚微米尺度观察全脑神经元三维形态结构。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤：
a取小动物脑样本，将小动物深度麻醉，断头处死，取脑，脑样本可以为取自大鼠、小鼠、青蛙、兔、猫等的全脑，也可以为脑的一部分，将其固定浸染；
b将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为PH值大于10的碱液；
c将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；
d将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；
e将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；
f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～4天。
上述制备方法，其中，所述步骤b和c之间还包括步骤bI将黑化后的脑样本用流水冲洗，冲洗时间为0.5～24小时。
上述制备方法，其中，固定液可以为Golgi-Cox法固定液，也可采用钨酸盐改良Cox法固定液，所述固定液的组成为：
升汞         0.1％～10％重量
重铬酸钾     0.1％～10％重量
铬酸钾       0.1％～10％重量
钨酸钠或钨酸钾： 0％～10％重量
蒸馏水        余量。
上述制备方法，其中，所述步骤a中固定浸染在1～2天后换固定液一次，之后每隔20～30天换固定液一次，至少换液3次，固定浸染的温度为0～100℃。
上述制备方法，其中，所述步骤b中，所述黑化液为氢氧化锂、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾。
上述制备方法，其中，所述步骤c中所用脱水剂为酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖或它们的组合。
上述制备方法，其中，所述步骤c中脱水为采用不同浓度的脱水剂进行梯度脱水，之后采用100％重量脱水剂脱水，各浓度脱水剂的脱水时间为0.5～12小时，采用梯度脱水可以有效防止标本的变形，采用越密集的梯度越有利于防止变形，如果不关心变形，可以不采用梯度脱水，直接进行100％重量脱水。
上述制备方法，其中，所述步骤d或e中所用包埋剂为SPURR环氧树脂包埋剂，也可以采用环氧树脂618和环氧树脂812包埋剂，这几种包埋剂均为市场上可以买到的包埋剂。
上述制备方法，其中，所述步骤d中采用不同浓度的包埋剂进行梯度包埋剂浸胶，之后采用100％重量包埋剂浸胶，浸胶温度为室温，各浓度包埋剂的浸胶时间为0.5～12小时，采用梯度包埋剂浸胶可以有效防止标本的变形，采用越密集的梯度越有利于防止变形，如果不关心变形问题，可以不采用梯度包埋剂浸胶，直接进行100％重量包埋剂浸胶。
上述制备方法，其中，在所述步骤a固定浸染之后和所述步骤c的100％重量脱水剂脱水前，采用普通染料对脑样本进行复染，即可以在固定染色后黑化前进行复染，可以在流水冲洗前或后复染，可以在梯度脱水过程中进行，例如在进行90％重量脱水剂脱水后100％重量脱水剂脱水前进行复染，或者，在所述步骤f之后将制得的标本进行切片，再对切片进行普通染料染色；所述的普通染料为亚甲基蓝、Nissl染色液、苏木精、伊红、苯胺蓝或中性红。
本发明的小动物全脑标本的制备方法，能染较多神经元，能同时染神经元胞体、树突和轴突，对比度高，不易褪色；制得的标本适合50纳米到100微米各种不同厚度的切片；宏观上进行全脑整体染色，微观上可实现连续亚微米切片，因此就能横向、纵向都以相同的亚微米级分辨率观察全脑标本显微结构(如神经元)的三维形态；该方法能制作大量染色的连续切片，以用于需要批量切片的场合。
附图说明
图1为本发明实施例2～5的小动物全脑标本的制备流程图；
图2为实施例2的横向分辨率为0.3微米*0.3微米，厚度为0.3微米的鼠脑切片局部图像。
具体实施方式
下面结合附图及实施例详细描述本发明。
实施例1
1、取材：取成年小鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、固定、染色：新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为0℃，染色90天，定期换新液，固定1天后换液一次，以后每隔20天换液一次，至少换液3次，固定液配方为：
升汞：     7％重量
重铬酸钾： 7％重量
铬酸钾：   5％重量
蒸馏水：   81％重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、黑化：把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氢氧化锂中24小时，脑样本变为墨绿色；
4、梯度脱水：脑样本依次经50％(重量)酒精，70％(重量)酒精，85％(重量)酒精，95％(重量)酒精，100％(重量)酒精，100％酒精丙酮(重量比1:1)，100％重量丙酮脱水各2小时，然后在100％重量丙酮中脱水12小时；
5、浸胶：标本依次经50％重量包埋剂，75％重量包埋剂，和连续两次100％重量包埋剂室温下浸胶各8小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方：
ERL-4221：  10重量份
DER-736：   7.6重量份
NSA：       26重量份
DMAE：      0.2重量份；
6、包埋：把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100％重量包埋剂，浸没脑样本；
7、聚合：把浸没脑样本的包埋盒置于60℃烘箱中加热36小时，聚合完毕把标本放到干燥器中静置待其冷却。
实施例2
1、取材：取成年小鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、固定、染色：新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为25℃，染色120天，定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔25天换液一次，至少换液3次，固定液配方为：
升汞：       10％重量
重铬酸钾：   10％重量
铬酸钾：     10％重量
钨酸钠：     5％重量
蒸馏水：     65％重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、黑化：把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氢氧化钠中12小时，脑样本变为墨绿色；
4、流水冲洗：将脑样本用流水冲洗24小时；
5、梯度脱水：脑样本依次经20％(重量)酒精，30％(重量)酒精，50％(重量)酒精，70％(重量)酒精，100％(重量)酒精，脱水各0.5小时，之后再用100％(重量)酒精脱水10小时；
6、浸胶：标本依次经30％重量包埋剂，50％重量包埋剂，70％重量包埋剂，和100％重量包埋剂室温下浸胶各0.5小时，之后再在100％重量包埋剂中室温下浸胶12小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方：
ERL-4221：     10重量份
DER-736：      6重量份
NSA：          26重量份
DMAE：         0.2重量份；
7、包埋：把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100％重量包埋剂，浸没脑样本；
8、聚合：把浸没脑样本的包埋盒置于80℃烘箱中加热6小时，聚合完毕把标本放到干燥器中静置待其冷却。
图2为本实施例的横向分辨率为0.3微米*0.3微米，厚度为0.3微米的鼠脑切片局部图像。
实施例3
1、取材：取青蛙，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、固定、染色：新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为50℃，染色120天，定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔30天换液一次，至少换液3次，固定液配方为：
升汞：    0.1％重量
重铬酸钾：1.5％重量
铬酸钾：  1％重量
钨酸钾：  0.1％重量
蒸馏水：  97.3％重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、黑化：把染色后的全脑样本浸入PH值大于10的氨水中1小时，脑样本变为墨绿色；
4、流水冲洗：将脑样本用流水冲洗0.5小时；
5、梯度脱水：脑样本依次经10％(重量)正丁醇，30％(重量)正丁醇，50％(重量)正丁醇，70％(重量)正丁醇，100％(重量)正丁醇，脱水各5小时，之后再用100％(重量)正丁醇脱水12小时；
6、浸胶：脑样本依次经20％重量包埋剂，40％重量包埋剂，60％重量包埋剂，80％重量包埋剂和100％重量包埋剂室温下浸胶各2小时，之后再在100％重量包埋剂中室温下浸胶10小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方：
ERL-4221：    10重量份
DER-736：     10重量份
NSA：         26重量份
DMAE：        0.2重量份；
7、包埋：把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100％重量包埋剂，浸没脑样本；
8、聚合：把浸没脑样本的包埋盒置于35℃烘箱中加热96小时，聚合完毕把标本放到干燥器中静置待其冷却；
9、将得到的标本切片，用普通染料亚甲基篮溶液对标本进行复染。
实施例4
1、取材：取成年大鼠，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、固定、染色：新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为100℃，染色100天，定期换新液，固定1天后换液一次，以后每隔30天换液一次，至少换液3次，固定液配方为。
升汞：     2％重量
重铬酸钾： 0.1％重量
铬酸钾：   0.1％重量
钨酸钾：   0.8％重量
蒸馏水：   97％重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、复染：用普通染料苏木精对上述脑样本进行复染；
4、黑化：把复染后的脑样本浸入PH值大于10的氢氧化钾中15小时，脑样本变为墨绿色；
5、流水冲洗：将脑样本用流水冲洗2小时；
6、脱水：脑样本经连续两次100％(重量)叔丁醇脱水12小时；
7、浸胶：脑样本经连续两次100％重量包埋剂室温下浸胶12小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方：
ERL-4221：     10重量份
DER-736：      8.5重量份
NSA：          26重量份
DMAE：         0.2重量份；
8、包埋：把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100％重量包埋剂，浸没脑样本；
9、聚合：把浸没脑样本的包埋盒置于50℃烘箱中加热80小时，聚合完毕把标本放到干燥器中静置待其冷却。
实施例5
1、取材：取成年兔，深度麻醉后，断头，解剖取出全脑；
2、固定、染色：新鲜全脑立刻放入固定液中固定染色，浸染温度为25℃，染色90天，定期换新液，固定2天后换液一次，以后每隔20天换液一次，至少换液3次，固定液配方为：
升汞：    10％重量
重铬酸钾：   5％重量
铬酸钾：     8％重量
钨酸钾：     10％重量
蒸馏水：     67％重量
固定液必须现配，且必须最后加入铬酸钾溶液，固定液须用棕色瓶装，并锡纸包瓶置暗处，以减少光照的影响，且要经常摇动试剂瓶；
3、黑化：把复染后的脑样本浸入PH值大于10的氢氧化锂中20小时，脑样本变为墨绿色；
4、流水冲洗：将脑样本用流水冲洗24小时；
5、梯度脱水：脑样本依次经10％(重量)丙酮，30％(重量)丙酮，50％(重量)丙酮，70％(重量)丙酮，脱水各2小时，之后用普通染料苯胺蓝对脑样本进行复染，之后再经连续两次100％(重量)正丁醇脱水12小时；
6、浸胶：脑样本依次经40％重量包埋剂，55％重量包埋剂，70％重量包埋剂，85％重量包埋剂和100％重量包埋剂室温下浸胶各4小时，之后再在100％包埋剂中室温下浸胶12小时，包埋剂采用spurr环氧树脂包埋剂(市售)，溶剂为丙酮，包埋剂配方：
ERL-4221：   10重量份
DER-736：    7.1重量份
NSA：        26重量份
DMAE：       0.2重量份；
7、包埋：把脑样本放到合适大小的包埋盒中，再慢慢添加100％重量包埋剂，浸没脑样本；
8、聚合：把浸没脑样本的包埋盒置于60℃烘箱中加热45小时，聚合完毕把标本放到干燥器中静置待其冷却。

Claims (10)

  1. 【权利要求1】一种小动物全脑标本的制备方法，其包括如下步骤：
    a取小动物脑样本，将其固定浸染；
    b将固定染色后的脑样本黑化，所用黑化液为PH值大于10的碱液，黑化时间为1～24小时；
    c将上述得到的脑样本进行脱水，包括100％重量脱水剂脱水；
    d将黑化后的脑样本采用包埋剂进行浸胶，包括连续两次100％重量的包埋剂浸胶；
    e将经包埋剂浸胶后的脑样本放入包埋盒中，加入100％重量包埋剂浸没脑样本；
    f将浸没脑样本的包埋盒加热，使包埋剂聚合，聚合温度为35～80℃，聚合时间为6小时～96小时。
  2. 【权利要求2】如权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤b和c之间还包括步骤bI将黑化后的脑样本用流水冲洗，冲洗时间为0.5～24小时。
  3. 【权利要求3】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤a中固定浸染的固定液的组成为：
    升汞        0.1％～10％重量
    重铬酸钾    0.1％～10％重量
    铬酸钾      0.1％～10％重量
    钨酸钠或钨酸钾：0％～10％重量
    蒸馏水        余量。
  4. 【权利要求4】如权利要求1或2所述的方法，其中，所述步骤a中固定浸染在1～2天后换固定液一次，之后每隔20～30天换固定液一次，至少换液3次，固定浸染的温度为0～100℃。
  5. 【权利要求5】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤b中，所述黑化液为氢氧化锂、氨水、氢氧化钠或氢氧化钾。
  6. 【权利要求6】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤c中所用脱水剂为酒精、丙酮、正丁醇、叔丁醇、蔗糖或它们的组合。
  7. 【权利要求7】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤c中脱水为采用不同浓度的脱水剂进行梯度脱水，之后采用100％重量脱水剂脱水，各浓度脱水剂的脱水时间为0.5～12小时。
  8. 【权利要求8】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤d或e中所用包埋剂为SPURR环氧树脂包埋剂。
  9. 【权利要求9】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤d中采用不同浓度的包埋剂进行梯度包埋剂浸胶，之后采用100％重量包埋剂浸胶，各浓度包埋剂的浸胶时间为0.5～12小时。
  10. 【权利要求10】如权利要求1或2所述的制备方法，其中，在所述步骤a固定浸染之后和所述步骤c的100％重量脱水剂脱水前，采用普通染料对脑样本进行复染，或者，在所述步骤f之后将制得的标本进行切片，再对切片进行普通染料染色；所述的普通染料为亚甲基蓝、Nissl染色液、苏木精、伊红、苯胺蓝或中性红。
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