CN103827654A - 用于制备进行检查的细胞学样品的系统和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备细胞学样品以进行检查的系统或试剂盒，其包含固定剂以固定所述样品中包含的细胞，细胞表面修饰剂以修饰所述样品中包含的细胞表面，具有至少两个面的第一样品支持装置，具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置上的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料(图1)。

Description

用于制备进行检查的细胞学样品的系统和试剂盒
发明领域
本发明涉及细胞学样品的显微镜检查领域。
发明背景
子宫颈癌在全世界的女性中是第二位最常见的癌症，在发展中国家是导致女性因癌症死亡的主要因素。妇女中有大约30%的癌症是子宫颈癌，例如在印度每年诊断超过100,000个新病例。子宫颈癌病例的预计年复合增长率(CAGR)是2.56%，以这个增长速度在2012年将检测到大约175,000例的子宫颈癌新病例。
筛查子宫颈癌的一种推荐工具是在帕帕尼科拉乌测试(Papanicolaoutest)(也称作Pap-涂片、Pap-试验、宫颈涂片或者涂片试验)中检测癌症的细胞学前体，这是用于妇科学中的一种筛查检查，用以检测子宫颈管特别是变性带中的恶化前和恶性病变。
在取Pap涂片时，使用阴道窥器从子宫颈的外口和宫颈内膜取细胞。在显微镜下检查细胞以观察异常情况。该测试目的在于检测由性传播人乳头瘤病毒导致的潜在的癌前改变。该测试仍然是早期检测癌前和子宫颈癌的一种有效的广泛使用的方法。该测试还可检测宫颈内膜和子宫内膜中的感染和异常。
这种方法在发达国家有效地降低了子宫颈癌的发生率。然而，目前的Pap染色是冗长且耗时的。此外，需要的步骤数和方法学使其整个过程非常难以自动化，而且难以在床旁(point of care setting)实施，这意味着样品不能在床旁分析，必须送至实验室分析。
发明概述
根据本发明的第一方面，提供了用于制备进行检查的细胞学样品的系统或者试剂盒。所述系统或者试剂盒包含固定所述样品中包含的细胞的固定剂，修饰所述样品中包含的细胞表面的细胞表面修饰剂，具有至少两个面的第一样品支持装置，及具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或者核染料。
如本文所用，“细胞学样品”被定义为来自生物体、优选哺乳动物的数量足够进行鉴别和/或分析的任何样品。细胞学样品非限制性例子包括细胞样品、皮肤样品、组织样品和粘膜样品。
如本文所用，术语“固定剂”是指一种组合物，其可以是或者不是液体形式，其固定细胞学样品，由此使所述细胞学样品被附着于载玻片足够的时间以鉴别和/或分析该细胞学样品。
如本文所用，术语“细胞表面修饰”是指处理细胞，由此细胞是非折叠的和/或非卷曲的，和/或细胞重叠减少。在样品制备期间细胞折叠和卷曲的减少将增强细胞和形态学细节的观测，用于随后检测样品中的异常细胞，例如在子宫颈癌筛查中。
细胞重叠的减少将改善细胞分散，这特别在细胞悬浮液中是重要问题，在细胞悬浮液中细胞趋于彼此重叠，特别是非常小的并趋于聚集及位于大细胞上的多形性。一般地，这两个目的都可以通过增加细胞的表面电荷实现，使得各个细胞之间排斥增加及因此提供更好的分散。
核染色是当样品沉积在所述第一样品支持装置上或者由所述第一样品支持装置覆盖时对样品中包含的细胞的细胞核染色。细胞质染色是当样品沉积在所述第二样品支持装置上或者由所述第二样品支持装置覆盖时对样品中包含的细胞的细胞质染色。
这种系统或试剂盒提供了制备细胞学样品的选项，由此样品中的细胞以适于通过显微镜观测或者适于通过自动化光学细胞分析装置分析的形式分散。因此，本发明的一个重要特征是可以对指定样品进行现场染色，即即时(Point of Care)分析。此外，不再需要在该位点制备染色溶液，因为染料以合适量预先分布在样品支持装置上。进一步地，不再需要进行复杂的方案和多步骤染色程序，并且在染色期间基本上由于灰尘和杂质所致的污染问题也被消除。再者，由于染料是以最佳染色需要的精确量分布的事实也使得例如过度染色或者染色不足等偏差最小化。
另一优势是pH条件可以容易控制，这是细胞质染色(在一些情况中酸性pH是有利的)及核染色(在一些情况中碱性pH是有利的)必需的。
其上已经沉积有染料的样品支持装置的使用使得可以在密闭环境中进行染色，即在样品筒(cartridge)中，这进一步消除了灰尘和杂质并增加了染色程序的可再现性。
在一个优选的实施方案中，提供了第一和/或第二样品支持装置的仅一个面具有各自的染料。然而，可以有利的是第一和/或第二样品支持装置的两个面均具有染料，在这种情况中，技术人员操作该系统时不需要考虑该支持装置的哪个面面对样品。在这种实施方案中，避免了由于使用第一和/或第二样品支持装置的错误面所致人为假象。
根据本发明的第二方面，提供了一种制备进行检查的细胞学样品的方法，所述方法包括如下步骤：
用固定剂固定所述样品中包含的细胞，
用细胞表面修饰剂修饰所述样品中包含的细胞的表面，
提供具有至少两个面的第一样品支持装置，及
具有至少两个面的第二样品支持装置，其中至少一个支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料，
将细胞沉积在第一或者第二样品支持装置上，及
分别用第二或第一样品支持装置覆盖沉积的细胞。重要的是要理解这个方法的步骤不是必须以上述顺序进行。
因此，本发明包括使用至少一种类型的预制样品支持装置。这些预制的样品支持装置用核染料或者用细胞质染料涂覆。在本发明优选的实施方案中，核染料沉积在第一样品支持装置的至少一个面，细胞质染料沉积在第二样品支持装置的至少一个面。或者，两个样品支持装置的仅一个用染料涂覆(例如核染料)，而另一类型染料/如细胞质染料例如与固定剂和/或细胞表面修饰剂一起加入细胞悬浮液中。
在本发明优选的实施方案中，第一样品支持装置和/或第二样品支持装置是载玻片和/或盖玻片形式。
如本文所用，术语“载玻片(slide)”是指由玻璃或塑料制成的小的透明平板，其上可以沉积样品如细胞以在光学放大装置如显微镜下检查。
如本文所用，术语“盖玻片（cover slip）”是指由玻璃或塑料制成的小的透明平板，其用于覆盖样品如细胞，之后在光学放大装置如显微镜下检查。
根据一般理解，载玻片和盖玻片的大小和厚度不同。在ISO 8255-2标准下，显微镜载玻片的大小为26×76mm，厚度为1mm，而盖玻片通常大小为18×18mm，厚度为100–200μm。然而，在本发明中，术语盖玻片和载玻片可以互换使用。特别地，在涂片制备中，在已经进行涂片之后，显微镜载玻片用于既支持样品又覆盖样品。
根据本发明另一优选实施方案，第一样品支持装置和第二样品支持装置通过铰链（hinge）彼此连接。这个实施方案进一步便于本发明的系统或试剂盒的使用。这种铰链可例如由在带有第一和第二样品支持装置的两个塑料框架之间的裁口接头(rebated joint)组成。提供这种铰链的其它可能性包括使用一片胶带连接第一和第二样品支持装置。技术人员不需要创造性步骤就能发现使用这种铰链的其它技术方案。
根据本发明另一优选的实施方案，固定剂和/或细胞表面修饰剂是以液体形式提供。优选地，固定剂包含选自如下一组的至少一种试剂：
·醇
·异丙醇
·醋酸(优选冰醋酸)
·甲醛，和/或
·戊二醛。
甚至更优选地，所述固定剂包含包括乙醇、异丙醇和醋酸的混合物，优选体积比率为7:2:1。
基于醇的固定剂对于细胞学涂片非常有益，因为其作用快速及提供良好的细胞核细节。优选地，使用乙醇(70%v/v)、异丙醇(70%v/v)和冰醋酸(10%v/v)的混合物。这是一种低pH混合物，可以使用缓冲液或者控制醋酸浓度而维持。
根据另一优选的实施方案，所述固定剂包含戊二醛和磷酸盐缓冲盐水，优选2%-20%w/w的戊二醛于0.05M-1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。优选地，所述固定剂的pH为5-6.5。
根据本发明另一个优选的实施方案，所述细胞表面修饰剂包含选自如下一组的至少一种试剂：
·使细胞表面具有正电荷的试剂，
·使细胞表面具有负电荷的试剂，
·螯合剂，
·抗凝剂，
·去粘液化剂(demucifying agent)，
·支持细胞分散的试剂，和/或
·在细胞表面产生微孔的试剂。
使细胞表面具有正电荷的试剂优选是选自聚-L-盐酸赖氨酸和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的至少一种水溶性化合物。
使细胞表面具有负电荷的试剂优选是选自硫酸葡聚糖、聚4-苯乙烯磺酸钠、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素和/或聚丙烯酸钠的至少一种水溶性化合物。
重要的是要理解在溶液中产生正/负电荷的任何其它分子也可用于本发明中。然而，如果所述分子是水溶性的则是有益的。
所述聚合物可以不同分子量和/或不同浓度使用。高分子量聚合物似乎更好地赋予细胞高电荷。相似地，高浓度(例如5-10mg/ml的PVP于醇固定剂中提供良好作用)示出细胞表面增加的电荷(见图5)。
所述螯合剂和/或抗凝剂优选是选自如下一组的至少一种：乙二胺四乙酸(EDTA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、次氮基三乙酸(nitriolotriacetic acid，NTA)、柠檬酸钠和/或草酸二钠或二甲基草酸二钠，或者其它柠檬酸盐或草酸盐。
所述去粘液化剂优选是选自如下的至少一种：氢氧化钠、N-乙酰基-L-半胱氨酸和/或次氯酸钠。优选地，所述细胞表面修饰剂包含2-5%w/vNaOH和0.25g/50ml N-乙酰基-L-半胱氨酸，或者0.5-6%w/v NaOCl。
支持细胞分散的试剂和/或在细胞表面产生微孔的试剂优选是去污剂，更优选是选自二硫苏糖醇和/或TritonX-100的至少一种。这些试剂的存在在细胞膜产生受控孔，使得染料快速进入细胞质和细胞核。
所述化合物支持细胞样品的适当固定、避免凝集及增强良好分散。其不影响亚甲蓝、伊红天青(EA)和橙黄G对细胞的染色(见图6)，且帮助细胞保持稳定几乎一周时间(见图7)。
特别优选的是提供一种细胞制备混合物，其包含至少固定剂和细胞表面修饰剂。或者，优选在本发明方法中，固定所述样品中包含的细胞及修饰所述样品中包含的细胞的表面的步骤是同时进行的。
在这些实施方案中，所述细胞制备混合物同时固定样品中的细胞及修饰细胞表面。
在另一优选的实施方案中，所述固定剂和/或细胞表面修饰剂可进一步包含染料。
进一步优选的是所述核染料包含选自如下一组的至少一种：
·卡红
·亚甲蓝
·中性红/二苯乙烯红
·苏木精
·番红精
·尼罗蓝。
同样，优选的是所述细胞质染料包含选自如下一组的至少一种：
·伊红
·Alician blue
·二甲苯胺丽春红(Xylidine Ponceau)
·猩红(Biebrich scarlet)
·Tartazine
·范吉逊染剂(Van Gieson's stain)(苦味酸和酸性品红)
·赖特染剂(Wright stain)。
甚至更优选地，可以使用染料组合，例如包含于所谓的Pap染色混合物中，其包含苏木精、橙黄G、伊红Y、微黄淡绿SF(Light Green SF yellowish)及有时包含俾斯麦棕Y(Bismarck Brown Y)的组合。
另一合适的染料组合是用于马森三色(Masson's trichrome)中，其包含Weigert's苏木精、酸性品红、二甲苯胺丽春红、磷钼酸和微黄淡绿SF，或者坚牢绿FCF(Fast Green FCF)、甲基蓝、水蓝或者苯胺蓝。
另一合适的染料组合是用于利里三色(Lillie's trichrome)中，其与马森三色相似，但是使用猩红代替酸性品红和/或二甲苯胺丽春红。
进一步地，也可以使用荧光染料如DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)。
再者，也可以使用可商购的特殊染料组合，如由Invitrogen提供的HCScell maskTM染色试剂盒。
当样品沉积在所述第一样品支持装置上或者由所述第一样品支持装置覆盖时，所述细胞核染料对所述样品中包含的细胞的细胞核染色。当样品沉积在所述第二样品支持装置上或者由所述第二样品支持装置覆盖时，所述细胞质染料对所述样品中包含的细胞的细胞质染色。
在本发明的另一优选的实施方案中，第一和第二样品支持装置构造为由自动化装置接受以染色样品。
本发明的方法可优选进一步包含选自如下一组的至少一个步骤：
a)通过阴道镜检查详细检查子宫颈；
b)在所述生物学样品中或者在具有相应性质的新样品中进行HPVDNA测试；
c)在所述生物学样品中或者在具有相应性质的新样品中进行生物标记测试；和/或
d)由合格的病理学家对所述生物学样品或者具有相应性质的新样品进行肉眼检查。
根据本发明另一方面，本发明的系统、试剂盒或方法用于选自如下的至少一个目的：
·癌症筛查
·癌症诊断
·对指定治疗进行预测
·同时监测指定癌症治疗。
优选地，所述细胞学样品是人样品。优选地，所述细胞学样品是子宫颈样品。然而，由于癌症发生和细胞转化的原理是普遍存在的，因此所述方法也可使用来自其它机体组织的需要进行异常检查的样品，如乳腺样品、前列腺样品、肝脏样品、肺样品、血液样品等等。
优选所述细胞学样品选自如下一组：
·涂片样品
·组织切片
·液体样品，和/或
·其它细胞学样品。
涂片样品例如是与帕帕尼科拉乌试验(也称作Pap-涂片、Pap-试验、宫颈涂片或者涂片试验)中使用的那些样品相似或相同。组织切片例如通过切片机提供。液体样品可优选由细胞-例如通过涂拭获得的细胞的悬浮液组成。
其它合适的样品包括但不限于细针穿吸细胞学(FNAC)样品、擦试法细胞学样品和/或鳞片样脱落样品(exfoliated samples)。
在许多情况中，将样品置于载玻片上使其可进行研究，如组织切片或者涂片。然而，其它装置也可用于承载样品，例如在样品是液体样品的情况中可以使用小杯，或者在样品是擦拭样品的情况中可以使用样品筒(cartridge)。在流程图中使用的术语切片因此不限制本发明的范围。
实施例：具有核染料和细胞质染料的盖玻片和载玻片的旋涂
按照标准洁净室方案清洁载玻片和盖玻片。
1.染料制备
a)伊红Y-Azure(EA)：伊红Y:0.23%w/v，坚牢绿F:0.08%w/v，俾斯麦棕:0.05%w/v，磷钨酸；0.2%w/v，溶解于变性醇中；
b)橙黄G(OG):OG:0.3%w/v，磷钨酸:0.01%w/v，溶解于变性醇中；
c)亚甲蓝(MB)/甲酚紫(CV):MB:80g/l于甲醇中，CV:40g/L于甲醇中；
2.旋涂(Holmarc Spin Coater,India)
a)MB/CV载玻片:1000rpm，20秒(200μl染料)；
b)EA/OG盖玻片:3000rpm，20秒(70μl染料)；
3.涂层浓度及用于涂覆的旋转速度如下：
i)盖玻片
编号 速度(rpm) 时间(s) 体积(μl)
OE1 2000 20 100
OE2 2000 10 100
OE3 1000 20 100
OE4 1000 10 100
OE5 500 10 100
OE6 500 5 100
OE7 500 10 100
OE8 500 5 100
OE9 500 10 100
OE10 500 5 100
ii)载玻片
编号 速度(rpm) 时间(s) 体积(μl)
OE11 1000 10 150
OE12 1000 5 150
OE13 1000 10 200
OE14 1000 5 200
OE15 500 10 200
OE16 500 5 200
OE17 1000 10 200
MB/CV涂覆(1:1)
i)载玻片
编号 速度(rpm) 时间(s) 体积(μl) 稀释度
MC1 1000 10 150 5x
MC2 1000 10 150 5x
MC3 1000 5 150 5x
MC4 1000 5 150 5x
MC5 1000 10 200 5x
MC6 1000 10 200 5x
MC7 1000 5 200 5x
MC8 1000 5 200 5x
附图简述
本发明的这些及其它方面通过参考后文描述的实施方案而显而易见并加以阐述。在图中：
图1示出本发明的系统或试剂盒的举例的实施方案示意图。
图2示出制备本发明的细胞学载玻片的举例的方法。
图3示出在根据现有技术的样品制备方案下出现的各种问题。
图4示出举例的工作流程，加上本发明的每个成分的功能性。
图5示出随着PVP(聚乙烯吡咯烷酮)浓度增加，子宫颈细胞的zeta电位(即细胞膜电位)增加。
图6示出其中细胞核(图6A)或细胞质(图6B)已经根据本发明的方案染色的细胞。
图7示出细胞在碱固定剂中随着时间的逐渐降解。当固定剂的pH接近中性时这种降解改善，染色模式无任何改变。
图8示出举例的子宫颈细胞在载玻片上的染色过程。
图9示出举例的制备染料的工作流程及举例的染色过程。
图10示出包含第一和第二样品支持装置的举例的实施方案。
图11示出预实施的本发明现场染色技术的结果。
实施方案详述
虽然本发明在图表和前文描述中得以详细例证和描述，但是这种例证和描述只是举例说明性的而非限制性的；本发明不限于揭示的实施方案。在实施本发明中对揭示的实施方案进行的其它变化可以由本领域技术人员根据图表、揭示及所附权利要求书而理解并实施。在权利要求书中，单词“包含”不排除其它元件或步骤，不定冠词“一个”不排除多个。在彼此不同的从属权利要求中列举的某些测量的实情不表示这些测量的组合不可用于获益。权利要求书中任何参考符合不应解释为限制本发明范围。
虽然揭示的系统的实施方案及揭示的方法的变化已经参考图表在说明书中详细描述，但是所述描述和图表只是举例而非限制性的，本发明不限于揭示的实施方案。
例如，可以以这样的安排实施本发明，其中细胞制备混合物在一或多个容器中提供，在现场混合，之后将样品分散于其中。不偏离所述揭示内容，可能有利的是将核染料预先分布在载玻片上，并且将细胞质染料分布在盖玻片上。所有这种变化均被认为是本发明揭示内容的变化。进一步的变化和组合将由实践者发现，所有这种变化均被认为在本发明揭示的方法的范围内。
图1示出本发明揭示的系统100的实施方案示意图。容器101含有液体形式的细胞制备混合物。容器101示出具有盖子109，其被配置为当其关闭时是密封的，因此保护容器101中包含的液体107。
液体107用于同时进行多种功能。其可以被认为进行两组主要功能，称作固定细胞和细胞制备。单词“固定”在本文使用的含义是杀死、保存及硬化(组织、细胞等)以进行随后的显微镜检查。细胞制备是由此将细胞准备置于载玻片上的功能。各个程序将在下文详细描述。
载玻片103与在细胞学载玻片中一般使用的矩形玻璃片相似，不同的是其用核染料涂覆。载玻片是指用盖玻片覆盖，所述盖玻片与细胞学载玻片中一般使用盖玻片相似，即矩形玻璃片，不同的是其用细胞质染料涂覆。在介绍了本发明揭示的系统的基本元件之后，关于其的详细内容及使用方法在下文描述。
细胞学样品以常规方式得自对象。例如，样品可以取自女性对象的子宫颈以筛查子宫颈癌。所述样品是通过使用一种木制刮刀或者棉签或者刷子获得。将如此获得的样品浸入细胞制备混合物107中，优选在容器109内，搅拌或摇动以使得样品成分、特别是细胞在所述细胞制备混合物中均匀悬浮。
在一个实施方案中，所述细胞制备混合物基本上含有固定剂，其目的是固定细胞以进一步制备载玻片。所述固定剂的主要成分是乙醇、异丙醇与冰醋酸的混合物，比率基本上分别为7:2:1。尽管可以使用其它比率，但是所述比率具有合适的pH以保护细胞免于随着时间的长度而降解。如果不期望长期保存，感兴趣于所述固定剂的其它功能，则该比率根据一些试验可以变化。其它功能可以是细胞染色的速度，例如在随后的步骤中。
在另一个实施方案中，所述固定剂的主要成分是含有2-4%体积的戊二醛于0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的混合物。所述PBS可以是钠盐或者钾盐。
然而，为了制备良好的载玻片，即在所述载玻片表面上具有无重叠的基本上单层的细胞及均匀分布的载玻片，在所述固定剂中加入其它化合物，这些可以统称为细胞制备。发现如果细胞具有表面电荷，则其不聚在一起。为了使细胞获得表面电荷，在所述固定剂中加入其它成分。当聚-L-盐酸赖氨酸(PLL)或者聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以适量混合时，为细胞提供正电荷，并因此其彼此相斥而便于形成细胞单层。或者，也可以使用提供负电荷的化合物。可以使用的一些化合物是硫酸葡聚糖或者聚4-苯乙烯磺酸钠或者聚甲基丙烯酸或者羧甲基纤维素或者钠盐或者聚丙烯酸。这个列表不是全部的。知道涉及的原理，可以使用各种其它化合物。
此外，要避免样品中血液及其它细胞的凝固。因此，在细胞制备混合物中加入抗凝剂。在所述细胞制备混合物中也加入如下一或多种：乙二胺四乙酸(EDTA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、柠檬酸钠、草酸二钠((Na+)2C2O4 2-)和二甲基草酸盐(CH3)2C2O4。可以使用的这些化合物的各个浓度是：EDTA:1-1.5mg/ml细胞制备混合物；柠檬酸钠：3.8%v/v细胞制备混合物；草酸盐：1%v/v细胞制备混合物等等。使用一些试验也可以发现其它提及的化合物的适当量。
此外，在所述细胞制备混合物中加入去粘液化剂如1%NaOH、2%NaOH+0.25g N-乙酰基-L-半胱氨酸或者3%NaOCl w/v。
进一步地，在所述细胞制备混合物中加入去污剂以使细胞更好地分散在所述细胞制备混合物中并在细胞膜产生有限的孔以帮助细胞染色。合适的去污剂是二硫苏糖醇(DTT)。大约1%w/v细胞制备混合物是去污剂在细胞制备混合物中的合适浓度。使用上述浓度，所述样品可以贮存大约一周时间而不会过多地破坏细胞。如果没有这种需要，可以使用1-2%w/v的去污剂。
因此，这样的一种成分，即细胞制备混合物，单独制备细胞以在现场制备载玻片进行细胞学检查。
载玻片103与一般的细胞学载玻片相似，但是预先涂覆了染料。在一个实施方案中，将细胞质染料预先涂覆在载玻片上。选择的染料是亚甲蓝(MB)或者甲酚紫(CV)或者这两种染料的混合物。具有亲水性的其它等价核染料可以用于此目的。将该载玻片通过使用合适的方案旋涂用染料涂层，从而在载玻片上形成一薄层均匀染料。10nm-10μm的涂层厚度提供了足够量的染料。
然而，当在pH为4.5-6.5的培养基中进行时实现良好的细胞质染色。为此，在一个实施方案中，预先涂覆在载玻片上的细胞质染料具有中性pH，所述细胞制备混合物的pH为4.5-6.5，即所述细胞制备混合物含有醋酸，及所述细胞制备混合物在制备时其pH控制在这个范围内。在另一个实施方案中，其中所述细胞制备混合物含有戊二醛和PBS，预先涂覆在载玻片的染料在其被预先涂覆在载玻片上之前与合适的酸混合。合适的酸是盐酸(HCl)。控制与染料混合的HCl的量，由此当预定量的细胞制备混合物与分散在其中的样品沉积在载玻片上时，将所述pH改变为最佳值，即4.5-6.5。
盖玻片105用核染料预先涂覆。将橙黄G(OG)与伊红天青(EA)混合，并预涂覆在盖玻片105上。所述盖玻片也用核染料组合通过旋涂方式预涂覆，厚度为10nm-10μm。
此外，当培养基是碱性pH7-10时，核染色是最有效的。核染色可以发生在pH7，或者甚至在pH6-7范围内，但是该染色较弱或较慢。因此，核染料与碱如氢氧化钠(NaOH)或者氢氧化铵(NH4OH)一起预涂覆在盖玻片上。因此，当所述细胞制备混合物自身是酸性并且沉积在是中性的载玻片上时或者当细胞制备混合物是中性的(7pH)及其pH在载玻片上被改变为是4.5-6.5以进行细胞质染色时，通过所述碱与预涂覆在盖玻片上的核染料混合而其pH再次被改变为7-10。
尽管上文描述了本发明揭示的系统的几个实施方案，但是根据本发明揭示的系统的原理可以有许多其它实施方案。例如，可以将细胞质染料与细胞制备混合物混合，由此当样品分布于其中时细胞的细胞质被染色。一旦在样品导入细胞制备混合物后已经过去预定时间，则将小量制备的样品沉积在用核染料和碱涂覆的载玻片上，由此制备的样品的pH在现场被改变以及细胞核被染色。在这个实施方案中，盖玻片其上无涂层，因此是细胞学载玻片中一般使用的盖玻片。另一变化可以是首先对细胞核染色，通过使细胞制备混合物的pH高于7并含有核染料，然后用预涂覆了细胞质染料和酸的载玻片在现场改变载玻片的pH为5-6.5。所有这种其它的实施方案均被认为包含在本发明内。
图2示出了制备细胞学载玻片的方法。下文程序中描述的第一个步骤不是本发明揭示的方法中的步骤，但是在获得细胞学样品中正常进行的一个程序。然而，获得细胞学样品的行为如步骤211所示，在虚线和虚线箭头的方框中，表示其实际上不组成本发明揭示的方法的一部分。
然而，当使用刮刀或拭子或者刷子或者通过任何合适方式以已知方式获得样品后，则将样品分散于如上述特别制备的细胞制备混合物中，在分散步骤213中分散于其中。所述细胞制备混合物将样品中的细胞制备为使其排布以制备载玻片。所述分散可以通过使用获得样品的工具如刮刀在细胞制备混合物中搅动样品而获益。或者，用浸入其中的获得样品的工具轻轻摇动含有细胞制备混合物的容器。应理解的是含有样品的工具的一部分浸入所述细胞制备混合物中。样品在细胞制备混合物中的这种分散可需要最低限度的时间。这个时间可根据细胞制备混合物中的确切组成而定。
在沉积步骤215中，将一定量的称作制备的样品的分散于细胞制备混合物中的样品沉积在用细胞质染料预涂覆的载玻片上，使其均匀涂覆。限定沉积在所述载玻片上制备的混合物的数量，因为制备的混合物的pH在这个步骤或者在随后的步骤中在现场被改变，可以在该载玻片上不同位置低几滴或多滴。一旦制备的样品与预涂覆的染料接触及染料溶解于细胞制备混合物中，在制备的样品中的细胞的细胞质开始染色。
在适量时间以染色制备的样品中的细胞的细胞质之后，在覆盖步骤217中使用至少用核染料预涂覆的盖玻片覆盖沉积的制备的样品，由此用核染料预涂覆的盖玻片的表面与沉积于其上的制备的样品接触。在放置盖玻片之前需要的时间可根据前述细胞制备混合物的不同实施方案的确切组成而定。这可以通过试验确定并可以确定为将盖玻片放置在样品上之前需要的最短时间。
当用核染料预涂覆的盖玻片与沉积在载玻片上的制备的样品接触时，所述核染料溶解于细胞制备混合物中并开始染色细胞的细胞核。如在载玻片上沉积制备的样品之后染色所需要的时间的情况中，允许核染料对细胞染色最小限度的时间，之后将制备的载玻片以例如通过加热的加速方式干燥(如果需要的话)。
由此，用于通过显微镜检验或者通过自动化光学细胞分析装置读取的载玻片制备完成。通过上文描述可以看出，细胞学载玻片的制备是朝着用比迄今已知方法使用的步骤数少的步骤对载玻片进行现场制备的方向进行。应理解的是即使在描述中提及的是单个载玻片制备，但是相同的系统也可以用于使用相同制备的样品每次制备一个以上的载玻片，正如可能由正常的实验室标准或指导所要求的那样。细胞制备混合物的体积和得自对象的样品的量可以标准化，由此可以每次制备需要数目的载玻片。
可以设想基于本发明揭示的系统和方法的实际试剂盒可具有预定量的细胞制备混合物以制备由相关实验室实践需要数目的载玻片及也对获得的样品量、获得样品的优选方式、分散样品以获得制备的样品的方法及在所述方法各个步骤需要的最小时间进行标准化，由此可以在现场制备需要数目的良好的载玻片以进一步研究。
大体上，本发明的方法具有三个阶段。第一阶段是将细胞学样品分散于细胞制备混合物中，其中同时进行多项功能，如细胞分散在所述细胞制备混合物中、细胞表面修饰、提供具有电荷的细胞表面以便其均匀分布及不聚集在一起以及制备细胞表面以进行染色。此外，所述细胞制备混合物也可具有对于染色最佳的pH。第二阶段是对细胞的细胞质进行染色。第三阶段是在现场改变制备的样品的pH，并对制备的样品中的细胞的细胞核染色。即使上文描述了本发明揭示的方法的仅这个变化，但是基于此可以有这种方法的许多变化。例如，细胞制备混合物也可以含有细胞质染料，以便除了第一阶段中已经列举的功能之外，在这个时间也可以对细胞质染色。在细胞制备混合物中可以产生合适的改变，由此细胞的核首先被染色，然后是细胞质。所有这种变化均被认为是本发明揭示的方法的变化，因此包含在本发明中。
图3示出根据现有技术的样品制备方案下出现的各种问题。在图3A中，细胞上附加有（superimposed）多形性（polymorph），这将妨碍后期对所述细胞的目测或者在自动化成像分析中产生假象。图3B示出折叠的细胞，这将导致与在图3A中讨论的相似问题。图3C示出细胞部分重叠，同样妨碍后期的目测及在自动化成像分析中产生假象。图3D示出细胞为它们应该表现的形态，允许目测或者自动化成像分析的正常成像分析，即细胞是非折叠的，并且细胞分布合适无重叠。
图4示出举例的流程图，加上本发明的每种成分的功能性。注意这个实例不是限制性的。再要注意的是成分I和II(即固定剂和细胞表面修饰剂)可以组合。
图5示出随着PVP(聚乙烯吡咯烷酮)浓度增加，子宫颈细胞的zeta电位(即细胞膜电位)增加。PVP影响细胞膜正电荷。在样品1中，仅使用基于醇的固定剂。在样品2-4中，使用同样的醇固定剂，其含有2、4或5mg/mlPVP。
图6示出染色的细胞。在图6A中，细胞核已经由亚甲蓝染色，在图6B中，细胞质已经由伊红天青(EA)和橙黄G(OG)染色。重要的是所述染色不受本发明先前步骤的影响，即使用螯合剂和抗凝剂(以避免细胞凝集)如乙二胺四乙酸(EDTA)、羟基乙二胺三乙酸(HEDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、柠檬酸钠、草酸盐，使用去粘液化剂如1%NaOH、2%NaOH+0.25g/50mlN-乙酰基-L-半胱氨酸、3%NaOCl，使用去污剂(以更好地分散细胞及在细胞膜产生有限的孔)如二硫苏糖醇(DTT)、TritonX-100等。
图7示出在基于醇的固定剂中细胞随着时间的逐渐降解。当通过加入碱或各自的缓冲液使固定剂的pH接近中性(如4.5-6.5)时，所述降解减速。
图8示出举例的染料组合去污剂和碱的制备流程图(现场pH改变)。将去污剂(如Triton X-100或DTT)在固定剂(基于醇或戊二醛)中直接混合，然后在其中收集样品。任选地，所述溶液也可以含有染料，如细胞质染料(如伊红天青(EA)和/或橙黄G(OG))。该溶液的pH优选保持在4.5-6.5范围。将另一染料(核染料如苏木精、亚甲蓝等)与任何碱性化合物(如NaOH、NaCl、NH4OH等)一起涂覆在载玻片上。所述碱的浓度应加以选择，由此希望体积的固定剂(酸性的)的pH可以快速改变为碱性(7.5-9.5)。注意核染料也可以加入细胞悬浮液中，细胞质染料可以涂覆在载玻片上。
图9示出举例的染料制备流程图，及举例的染色过程。亚甲蓝(MB)和甲酚紫(CV)的混合物用作核染料。亲水性的其它核染料也可以用于此目的。将染料通过合适方案经旋涂涂覆在载玻片上，以形成一均匀的薄层染料(10nm-10μm)。为了染色细胞质，将橙黄G(OG)与伊红天青(EA)混合在一起形成一种溶剂，然后涂覆在盖玻片上。这样保证了核染色和细胞质染色均预先分布，可以组合成一个单一装置进行染色。所述载玻片和盖玻片(即第一和第二样品支持装置)可以组合，由此其通过如图10所示铰链彼此连接。在表面之间可以提供一个间隔物(2-100μm厚度)，由此当细胞置于两个样品支持装置之间时，所述细胞被保护不受挤压。
图10示出了举例的包含第一样品支持装置(载玻片1001)和第二样品支持装置(盖玻片1002)的实施方案，其中这两个样品支持装置通过铰链1005连接。进一步地，提供厚度为2-100μm的间隔物1003，以避免细胞挤压。间隔物可具有减震和/或自粘附性质。在图10中，细胞质染料已经预涂覆在载玻片上，核染料已经预涂覆在盖玻片上。然而，这种布置可以翻转(即细胞质染料可以在盖玻片上，核染料可以在载玻片上)。进一步地，盖玻片和载玻片可具有相似或者甚至相同大小，或者甚至彼此不同如图10所示.。如上文所揭示，核染料或细胞质染料可以更早地给予细胞悬浮液。
图11示出本发明的预涂覆现场染色技术的结果。载玻片和盖玻片均已经通过旋涂用染料涂覆，如实施例1所述。然后将预涂覆的载玻片用于对子宫颈细胞进行染色实验。为此，将收集在培养基中的子宫颈样品置于底部基材上，之后将盖玻片置于其上。在染色3分钟之后，将载玻片在显微镜下检查，获得图像。图11A示出用橙黄G染色结果。图11B示出用伊红天青染色结果，图11C示出用亚甲蓝(MB)和甲酚紫(CV)染色结果。图11D示出用橙黄G(OG)与伊红天青(EA)的组合对子宫颈细胞染色3分钟后的结果。

Claims (20)

1.制备用于检查的细胞学样品的系统或试剂盒(100)，所述系统或试剂盒包含：
固定剂，用以固定所述样品中包含的细胞，
细胞表面修饰剂，用以修饰所述样品中包含的细胞的表面，
第一样品支持装置(103)，其具有至少两个面，及
第二样品支持装置(105)，其具有至少两个面，
其中至少一个所述支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料。
2.制备用于检查的细胞学样品的方法，所述方法包括如下步骤：
用固定剂固定所述样品中包含的细胞，
用细胞表面修饰剂修饰所述样品中包含的细胞的表面，
提供具有至少两个面的第一样品支持装置(103)，及
具有至少两个面的第二样品支持装置(105)，其中至少一个所述支持装置的至少一个面上沉积有细胞质染料或核染料，
使细胞沉积在第一或第二样品支持装置上，及
分别用第二或第一样品支持装置覆盖沉积的细胞。
3.权利要求1的系统或试剂盒或者权利要求2的方法，其中核染料沉积在所述第一样品支持装置的至少一个面上，并且细胞质染料沉积在所述第二样品支持装置的至少一个面上。
4.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述第一样品支持装置和/或所述第二样品支持装置是载玻片和/或盖玻片形式。
5.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述第一样品支持装置和所述第二样品支持装置通过铰链彼此连接。
6.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂和/或细胞表面修饰剂以液体形式提供。
7.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含选自如下一组的至少一种试剂：
·乙醇
·异丙醇
·醋酸(优选冰醋酸)
·甲醛
·戊二醛。
8.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含包括乙醇、异丙醇和冰醋酸的混合物，优选体积比率为7:2:1。
9.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂包含戊二醛和磷酸盐缓冲盐水，优选2%–20%w/w的戊二醛于0.1M-1M磷酸盐缓冲盐水中。
10.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述固定剂的pH为5-6.5。
11.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中所述细胞表面修饰剂包含选自如下一组的至少一种试剂：
·使得细胞表面具有正电荷的试剂，
·使得细胞表面具有负电荷的试剂，
·螯合剂，
·抗凝剂，
·去粘液化剂；
·支持细胞分散的试剂，和/或
·在细胞表面产生微孔的试剂。
12.前述任何权利要求的系统、试剂盒或方法，其中提供的细胞制备混合物包含至少固定剂和细胞表面修饰剂。
13.前述任何权利要求的方法，在所述方法中固定所述样品中包含的细胞及修饰所述样品中包含的细胞的表面的步骤是同时进行的。
14.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中所述核染料包含选自如下一组的至少一种：
·卡红
·亚甲蓝
·中性红/二苯乙烯红
·苏木精
·番红精
·尼罗蓝。
15.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中所述细胞质染料包含选自如下一组的至少一种：
·伊红
·Alician blue
·二甲苯胺丽春红
·猩红
·Tartazine
·范吉逊染剂
·赖特染剂。
16.前述任何权利要求的系统、试剂盒或者方法，其中第一和第二样品支持装置构造为由自动化装置接受以染色样品。
17.前述任何权利要求的方法，所述方法进一步包括选自如下一组的至少一个步骤：
a)通过阴道镜详细检查子宫颈；
b)在所述生物学样品中或者在具有可比性质的新样品中进行HPVDNA测试；
c)在所述生物学样品中或者在具有可比性质的新样品中进行生物标记测试；和/或
d)由合格的病理学家肉眼检查所述生物学样品或者具有可比性质的新样品。
18.根据选自如下一组的至少一个目的的系统、试剂盒或者方法的应用：
·癌症筛查
·癌症诊断
·预测指定治疗
·同时监测指定的癌症治疗。
19.前述任何权利要求的方法、系统或者试剂盒，其中所述细胞质样品是子宫颈样品。
20.前述任何权利要求的方法、系统或者试剂盒，其中所述细胞学样品选自：
·涂片样品
·组织切片
·液体样品，和/或
·其它细胞学样品。
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