CN111829859A

CN111829859A - 一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法

Info

Publication number: CN111829859A
Application number: CN202010072998.1A
Authority: CN
Inventors: 林金星; 张曦; 胡子健
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: CN111829859B

Abstract

本发明公开了一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，该方法包括以下步骤：S1：溶液的配制；S2：植物种子的固定；S3：植物种子脂质的去除；S4：植物种子中蛋白的去除；S5：透明种子胚的染色；S6：样品包埋与成像；S7：数据分析。该方法实施简单方便，成本低廉；使用此发明方法后，种子透明度显著提升，染色效果理想，提升了激发光穿透样品的能力的同时，均匀染色后的样品被完整激发，不仅大幅提高了扫描效率，且成像结果十分清晰。此方法的开发十分利于大体积植物种子三维成像及其结构的重构，也为植物种子内部参数计算提供可靠数据。

Description

一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一种能够快速实现对杨树种子透明染色及其三维成像方法的领域。

技术背景

生命体的物质与能量代谢等生命活动和器官内部形态发生与结构变化之间存在互相依赖的关系。细胞在行使不同功能过程中并不全是细胞自主性行为，而是通过细胞关联和协同作用的结果。因此，多细胞器官通过不同种类细胞间相互作用赋予系统更高阶的功能。此外，细胞与细胞、细胞与组织乃至组织与组织之间的相互交流和互做逐渐成为目前分子细胞生物学的研究热点，在植物生长发育和优良品种改良方面发挥指导作用。种子内部不同组织状态以及各组织内部细胞的排布结构及动态变化与其休眠、萌发和逆境发育等多种生命活动息息相关。近年来，越来越多的研究热点集中于种子内部结构与其相关功能的关联分析。作为植物生长过程的最初阶段，种子在形态结构上表现出十分稳定的遗传特性，为进一步探索不同种子在品种、发育阶段或遗传改造之间的细微差异提供了研究基础。然而，应用现有成像技术(譬如光学、荧光、共聚焦显微镜以及常规切片技术) 对于种子体内组织结构和细胞形态分布分析具有很大的局限性，无法快速简便地获取整体种子形态与内部组成的高分辨、高质量和三维尺度等信息。因此，寻找合适的透明技术和成像方法，对种子内部细胞大小、排布与形态等参数进行深入解析，对了解植物种子的生理学特征和发育过程具有重要的指导意义。

光片层荧光显微镜(Light Sheet Fluorescence Microscopy,LSFM)是一种利用片层荧光对样品进行光学切片并实现亚细胞水平成像的技术。与传统共聚焦显微镜(LaserScanning Confocal Microscopy,LSCM)相比，其含有多个激发光光源以及多个成像物镜，具有多视角、成像快速和低光毒性等优点，成为大尺寸活体样本研究的有效工具之一。由于LSFM技术需要片层激发光穿过样品进行成像，因此待测样品需要具有较高的透明度。植物本身及其内部由不同光学性质的各种物质组成。当激发光穿过植物组织时，光的分布和强度分别因为光散射和光吸收而出现不同程度的变宽和衰减，导致成像图案模糊和弱化，尤其是在组织中深层区域。因此，样品组织的透明度的高低决定着LSFM成像质量。组织透明化可使光散射和吸收最小化，从而改善成像深度和对比度，从而提升成像质量。植物样品透明化后的染色是LSFM成像的关键步骤之一，染色不足导致信噪比低，而染色过度则可能阻碍激发光的路径导致部分信号丢失。因此，不同植物样品染色条件的建立决定着最终成像的质量。然而，已报道的透明及染色技术无法满足 LSFM对植物种子高质量成像的需求，因此开发一种适用于植物种子的透明染色及其成像方法对于种子结构、功能及其发育研究提供技术支持，也为植物不同组织、器官甚至整体三维成像的应用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的是为了克服种子透明度不高以及染色条件不足的问题，开发一种基于LSFM成像技术对植物种子透明、染色及多尺度细胞水平成像的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种纯化原核表达融合His标签蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：溶液的配制：(1)标准固定液(FAA)的配制：取37-40％(m/v)的福尔马林(甲醛)、冰醋酸、65％-70％(v/v)酒精和甘油(丙三醇)按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液。(2)1mg/mL PI(碘化丙啶, Propidium Iodide)溶液的配制：称取5mg PI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存。(3)4％(w/v)NaOH溶液的配制：称取4g NaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液。(4)饱和水合氯醛溶液的配制：称取水合氯醛50g，分别加入15mL和10mL的双蒸水和甘油使其溶解，获得饱和的水合氯醛试液。(5)1％过碘酸溶液的配制：称取过碘酸0.5g，加50mL蒸馏水使其溶解，获得1％过碘酸溶液。(6)NaHSO₃-HCl混合溶液的配制，称取1g亚硫酸氢钠NaHSO₃溶于10mL 1mol/L盐酸中，获得NaHSO₃-HCl 混合溶液。(7)1％低熔点琼脂糖凝胶溶液的配制，称取1g低熔点琼脂糖，加入蒸馏水100mL并加热至沸腾使其溶解，然后分装至1.5mL离心管中，获得1％琼脂糖凝胶。

S2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有1mL标准固定液的1.5 mL离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中在18-20kpa的压力下固定2h，正常大气压力下于4℃储存1d后，再经过70％至100％(v/v) 酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本。

S3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有 1mL石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌48h。弃去石油醚后，加入1 mL丙酮浸泡6h。弃去丙酮后，加入1mL氯仿浸泡6h，得到去脂质的植物种子。

S4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理。按照95％-70％-50％(v/v)酒精的顺序依次漂洗，每步20分钟，最后储存于蒸馏水中。在体视镜下将种皮去除并转移至4％(m/v)的NaOH中于60℃萃取 72h，每12h更换一次溶液。随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗三次，每次30分钟，然后于60℃下在饱和水合氯醛水溶液中浸泡48h。弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗30min，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚。

S5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入1mL过碘酸溶液醛化1h 后，蒸馏水清洗3次，每次1分钟。加入1mL NaHSO₃-HCl溶液和1mL PI溶液共染3h后，弃去染液。最后用蒸馏水清洗样品1h，得到颜色呈粉红色的染色样品。

S6：样品包埋与成像：本步骤使用卡尔蔡司Lightsheet Z.1Microscope System对待测样品进行成像。首先打开Lightsheet Z.1显微镜、激光开关、计算机及其控制软件ZENblue edition。根据样品尺寸和实验目的更换相应参数的成像物镜。加热1％低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中后，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及1％低熔点琼脂糖。此时为获得更好的成像视角，尽量保证样品在毛细管中垂直分布。待1％低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门。然后按下“Locate Capillary”并打开照明灯，通过“Overview Camera”窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置。最后进行扫描成像，在“Set Exposure”选项卡中设置相应激发光及发射光波段，点击“Continuous”按钮进行样品实时荧光预览，调节激光强度、片层光入射角度、曝光时间和分辨率并设置成像区域、Z轴间距、光片层厚度等，然后点击“Snap”成像。待扫描结束后，打开ZEN blue edition软件，选择“Process”模块，导入检测结果原始图片并利用其“Dual Fusion”功能进行图像的双侧荧光最大化融合。使用“Imaris File Converter”拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，最终得到大量、清晰的二维荧光图像。

S7：数据分析：利用ImageJ 1.52p(Wayne Rasband)对单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果进行统计分析。利用Imaris 9.0(BITPLANE)软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

LSFM成像技术能够实现对大体积样品快速三维成像，但是对样品的透明度具有较高的要求。本发明通过改进植物种子透明及其染色方法，将两者结合并用于植物种子处理，获得十分适合LSFM技术成像样品，能够克服现有技术中由于植物种子内部组成成分复杂多样且具有不同的光学性质，使得由棱镜产生的片层光无法正常穿过植物样品，因此无法得到大量清晰的二维荧光图像的问题。特别是，在步骤S4中，样品在蛋白去除过程中基于NaOH可以使种子内蛋白变性的原理，本方法利用NaOH中于60℃对样品萃取72h，最终可获得高度蛋白去除的种子样品，为促进高度种子透明化奠定了基础。此外，在步骤S5中，本方法使用1％过碘酸对种子样品处理，过碘酸的强氧化性特征可使种子细胞壁中的多糖进行氧化并暴露更多醛基。同时，利用亚硫酸氢钠与HCl对PI与多糖结合的促进作用，使种子染色更加牢固与均匀，为后续成像和三维重构分析提供基础。

本方法处理实施简单方便，成本低廉。使用此发明方法后，种子透明度显著提升，染色效果理想，提升了激发光穿透样品的能力的同时，均匀染色后的样品被完整激发，不仅大幅提高了扫描效率，且成像结果十分清晰。此方法的开发十分利于大体积植物种子三维成像及其结构的重构，也为植物种子内部参数计算提供可靠数据。

附图说明

图1是本方法关于利用LSFM对成熟青杨种子三维成像技术路线；

图2是利用体视镜观察的成熟干燥青杨种子原始图像；

图3是利用体视镜观察的FAA固定后的青杨种子原始图像；

图4是利用体视镜观察的脂质去除和种皮去除后的青杨种子图像；

图5是利用体视镜观察的完全透明后的青杨种子图像；

图6是本方法利用LSFM对透明染色后的青杨种子扫描的明场视图；

图7是本发明利用Imaris和ImageJ软件对青杨种子荧光图像三维重构及其细胞参数的分析结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，该方法的具体步骤如下：

一、材料的准备：成熟的青杨种子，从北京林业大学国家理科生物学研究与教学人才培养基地获得。

二、溶液的配制：(1)标准固定液的配制(FAA)：取37-40％(m/v)的福尔马林(甲醛)、冰醋酸、65％-70％(v/v)酒精(本发明中提及的酒精含量均为乙醇与水的体积比)和甘油(丙三醇)按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液。(2)1mg/mL PI(碘化丙啶,Propidium Iodide)溶液的配制：称取5mg PI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存。(3)4％(w/v)NaOH溶液的配制：称取4g NaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液。(4)饱和水合氯醛溶液的配制：称取水合氯醛50g，分别加入15mL和10mL的双蒸水和甘油使其溶解，获得饱和的水合氯醛试液。(5)1％过碘酸溶液的配制：称取过碘酸0.5g，加50mL蒸馏水使其溶解，获得1％过碘酸溶液。(6)NaHSO3-HCl混合溶液的配制，称取1g亚硫酸氢钠NaHSO3溶于10mL 1mol/L盐酸中，获得NaHSO3-HCl混合溶液。(7)1％低熔点琼脂糖凝胶溶液的配制，称取1g低熔点琼脂糖，加入蒸馏水100mL并加热至沸腾使其溶解，然后分装至1.5mL离心管中，获得1％琼脂糖凝胶。

三、青杨种子处理：以青杨种子为例进行此方法的实施(如图1所示)。用镊子将青杨蒴果中的种子与絮毛分离，在体视镜下观察(图2)，然后进行以下操作：

1)将成熟的青杨种子置于装有1mL标准固定液的1.5mL离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中固定2h(18-20kpa)，正常大气压力下于4℃储存1d后，再经过70％至100％酒精逐级脱水，得到固定脱水后的青杨种子种子样本。(图3)。

2)青杨种子脂质的去除：将步骤1)中处理好的植物种子取出并置于装有1 mL石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌48h。弃去石油醚后，加入1mL 丙酮浸泡6h。弃去丙酮后，加入1mL氯仿浸泡6h，得到去脂质的青杨种子。

3)青杨种子蛋白的去除：首先将步骤2)中去脂质后的样品经再水化处理。按照95％-70％-50％(v/v)酒精的顺序依次漂洗，每步20分钟，最后储存于蒸馏水中。在体视镜下将种皮去除并转移至4％(m/v)的NaOH中于60℃萃取72h，每12h更换一次溶液。随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗三次，每次30 分钟，然后于60℃下在饱和水合氯醛水溶液中浸泡48h。弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗30min，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的青杨种子胚 (如图5所示)。

4)透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入1mL过碘酸溶液醛化1h后，蒸馏水清洗3次，每次1分钟。加入1mL NaHSO3-HCl溶液和1mL PI溶液共染 3h后，弃去染液。最后用蒸馏水清洗样品1h，得到颜色呈粉红色的染色样品。

5)样品包埋与成像：本步骤使用卡尔蔡司Lightsheet Z.1Microscope System对待测样品进行成像。首先打开Lightsheet Z.1显微镜、激光开关、计算机及其控制软件ZENblue edition。根据青杨种子胚的体积，试验中更换10 倍成像物镜及两个5倍照明镜头。加热1％低熔点琼脂糖至其完全溶解，将透明染色后的青杨胚浸于其中后，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及1％低熔点琼脂糖。此时为获得更好的成像视角，尽量保证样品在毛细管中垂直分布。待1％低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门。然后按下“Locate Capillary”并打开照明灯，通过“Overview Camera”窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置(如图6所示)。最后进行扫描成像，在“Set Exposure”选项卡中设置相应激发光及发射光波段，点击“Continuous”按钮进行样品实时荧光预览，调节激光强度、片层光入射角度、曝光时间和分辨率并设置成像区域、Z轴间距、光片层厚度等，然后点击“Snap”成像。待扫描结束后，打开ZEN blue edition软件，选择“Process”模块，导入检测结果原始图片并利用其“Dual Fusion”功能进行图像的双侧荧光最大化融合。使用“Imaris File Converter”拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，最终得到大量、清晰的二维荧光图像。

6)数据分析：利用ImageJ 1.52p(Wayne Rasband)对青杨单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果进行统计分析。利用Imaris 9.0(BITPLANE) 软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型(如图7所示)。

对具体实施例1处理得到的青杨种子进行重构图像分析与结构分析：通过分别对比图2、图3、图4和图5，可以发现干瘪的种子因吸水变得饱满，符合新鲜种子的形态特征；在透明过程中，种子的透明度逐渐发生了改变。透明种子在保证形态结构完整的前提下，其透明度具有极大的提升，甚至可在高倍体视镜下观察到表皮细胞轮廓。从图6中能够进一步证明，光线穿过透明样品的效果很好，表明透明后种子的透明度具有极大的改进，且部分细胞轮廓清晰可辨。

利用Imaris软件对扫描得到的大二维荧光图进行重构并分析，如图7中的 A-F所示，能够发现从不同截面来看都能观察到透明后的种子其形态结构完整，细胞轮廓清晰，实现了细胞水平的三维可视化。图7H为一张青杨种子中部纵切面二维荧光图片，图像清晰地显示出了所有的细胞轮廓，其中包括不同组织中多中细胞类型，有助于下一步的识别与分析，利于后续工作展开。利用ImageJ软件对图7H进行细胞参数分析，可获得大量细胞参数。首先利用ImageJ软件对图 7H进行颜色翻转，将细胞内部变为黑色信号。然后调整荧光强度及对比度，使细胞内信号清晰且易于分析。使用Analyze particles功能对细胞轮廓进行识别和统计，导出结果。使用Prism或Origin软件对上述细胞面积、周长及Feret直径进行频率分布分析(如图7中J-L所示)。如图7J所示，细胞面积频率分布出现明显四个峰值，表明青阳种子纵切面中含有至少四种面的细胞类型，较小面积细胞很可能为较小的维管组织细胞。同理，细胞周长与Feret直径均出现明显的差异性频率分布，表明了不同类型细胞的异质性，为揭示不同细胞类型与功能提供了理论基础。

综上所述，本发明提供了实现对植物种子透明、染色及细胞成像的方法。

应当理解的是，本发明的上述具体实施方式和实施例仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。

Claims

1.一种高效杨树种子透明染色及其三维成像的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

S1：溶液的配制：配制标准固定液、PI溶液、NaOH溶液、饱和水合氯醛溶液、过碘酸溶液、NaHSO3-HCl混合溶液、低熔点琼脂糖凝胶溶液；

S2：植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有标准固定液的离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中固定，再经过酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本；

S3：植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌，弃去石油醚后，加入丙酮浸泡，弃去丙酮后，加入氯仿浸泡，得到去脂质的植物种子；

S4：植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理；在体视镜下将种皮去除并转移至NaOH溶液中萃取；随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗；然后在饱和水合氯醛水溶液中浸泡；弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚；

S5：透明种子胚的染色：将透明后的种子胚加入过碘酸溶液醛化后，采用蒸馏水清洗；加入NaHSO3-HCl溶液和PI溶液共染后，弃去染液；最后用蒸馏水清洗样品；得到颜色呈粉红色的染色样品；

S6：样品包埋与成像：本步骤使用光片层荧光显微镜对待测样品进行成像；首先打开所述显微镜、激光开关、计算机及其控制软件；将加热低熔点琼脂糖至其完全溶解，将待检测样品浸于其中，使用合适直径的玻璃毛细管吸入待测样品及低熔点琼脂糖；待低熔点琼脂糖凝固后，然后打开样品室，将样品垂直固定于样品槽中并关闭舱门；然后调整所述显微镜使得窗口确保样品清晰且位于镜头中央位置；最后进行扫描成像，待扫描结束后，通过拼接软件进行不同扫描区域原始图像的拼接，得到二维荧光图像；

S7：数据分析：利用ImageJ软件对单张二维图像进行细胞参数测量，并利用测量结果对细胞参数进行统计分析；利用Imaris软件对成像后植物胚结构的荧光二维图像进行三维重构及数据，最终得到一套完整的包含原始种子所有三维信息的立体模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准固定液的配制：取37-40％(m/v)的福尔马林、冰醋酸、65％-70％(v/v)乙醇和甘油按5：5：90：5的体积比例倒入容器内，混合均匀，得到标准固定液；所述PI溶液的配制：称取5mg PI粉末，溶于5ml蒸馏水中，利用锡纸包好并-20℃储存；所述NaOH溶液的配制：称取4g NaOH固体颗粒，溶于100mL蒸馏水中，得到4％(w/v)NaOH溶液；所述饱和水合氯醛溶液的配制：称取水合氯醛50g，分别加入15mL和10mL的双蒸水和甘油使其溶解，获得饱和的水合氯醛试液；所述过碘酸溶液的配制：称取过碘酸0.5g，加50mL蒸馏水使其溶解，获得1％过碘酸溶液；所述NaHSO3-HCl混合溶液的配制：称取1g亚硫酸氢钠NaHSO3溶于10mL 1mol/L盐酸中，获得NaHSO3-HCl混合溶液；所述低熔点琼脂糖凝胶溶液的配制，称取1g低熔点琼脂糖，加入蒸馏水100mL并加热至沸腾使其溶解，然后分装至1.5mL离心管中，获得1％琼脂糖凝胶。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S2中，植物种子的固定：将成熟的植物种子置于装有1mL标准固定液的1.5mL离心管中，将含有标准固定液和种子的离心管放至真空泵中在18-20kpa的压力下固定2h，正常大气压力下于4℃储存1d后，再经过70％至100％(v/v)酒精逐级脱水，得到固定脱水后的植物种子样本。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中，植物种子脂质的去除：将步骤S2中处理好的植物种子取出并置于装有1mL石油醚的离心管中，于室温条件下轻轻搅拌48h；弃去石油醚后，加入1mL丙酮浸泡6h；弃去丙酮后，加入1mL氯仿浸泡6h，得到去脂质的植物种子。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S4中，植物种子中蛋白的去除：首先将步骤S3中去脂质后的样品经再水化处理，按照95％-70％-50％(v/v)酒精的顺序依次漂洗，每步20分钟，最后储存于蒸馏水中；在体视镜下将种皮去除并转移至4％(m/v)的NaOH中于60℃萃取72h，每12h更换一次溶液；随后将去除种皮种子的胚在蒸馏水中漂洗三次，每次30分钟，然后于60℃下在饱和水合氯醛水溶液中浸泡48h；弃去水合氯醛溶液，用蒸馏水冲洗30min，以去除残留的透明剂，最终得到透明完全的种子胚。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S5中，将步骤S4中透明后的种子胚加入1mL过碘酸溶液醛化1h后，蒸馏水清洗3次，每次1分钟；加入1mL NaHSO3-HCl溶液和1mL PI溶液共染3h后，弃去染液,最后用蒸馏水清洗样品1h，得到颜色呈粉红色的染色样品。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S6中，为获得更好的成像视角，尽量保证样品在毛细管中垂直分布。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S6中，所述显微镜为卡尔蔡司Lightsheet Z.1Microscope System。