WO2019082293A1 - 生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法 - Google Patents

生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法

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隆仁 橋本
英子 中澤
雅彦 安島
上村　健
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Definitions

  • the present invention relates to a method of preparing a biological tissue sample and a method of observing a biological tissue sample.
  • iPS cells are used to make mini organs that are the origin of organs.
  • Mini organs are also used for research and development screening in drug discovery. There is a growing need to further cut such mini-organs into several pieces and three-dimensionally grasp the fine structures of organs and tissues.
  • the resolution is limited to about several hundreds of nm due to the restriction by the wavelength of light, and the maximum magnification is up to about 1000 times. Since the resolution of the naked eye is about 0.1 mm, it is difficult to observe details of the biological tissue with a light microscope. In addition, with a normal light microscope, it is difficult to collectively observe several tens of ⁇ m thick biological tissue because the depth of focus is insufficient.
  • the sample side opening angle is set to about several hundreds of mrad in order to suppress the reduction in resolution due to light diffraction. For example, when the sample side opening angle is set to 500 mrad, the focal depth is about 4 ⁇ m in order to suppress the minimum circle of confusion on the sample to about 1 ⁇ m.
  • the thickness of the sample must also be suppressed to 4 ⁇ m or less. Therefore, in observation of a biological tissue with a light microscope, the biological tissue must be sliced to a thickness of 5 ⁇ m or less for observation, and sufficient resolution can not be obtained.
  • a method has been developed in which biological tissue is made transparent and observed three-dimensionally using a confocal laser microscope or a sheet illumination microscope, but it takes 3 to 4 days for the sample to be transparent and it is necessary to observe There is a problem that it takes a long time.
  • TEM transmission electron microscope
  • the transmission electron microscope (TEM) has a resolution of about 0.2 nm, and can be observed at a magnification of about 500,000 times at the maximum.
  • the TEM observation method has a sufficiently high resolution, but has the limitation of the sample thickness due to the transmission power.
  • a relatively parallel electron beam of about 1 mrad is irradiated to observe the sample, but the thickness of the sample is determined by the need to transmit the electron beam that generates a very strong interaction with the sample. It is necessary to control to less than 1 ⁇ m.
  • TEM is suitable for structural analysis inside cells, but not suitable for structural analysis of tissue.
  • scanning electron microscopy has the ability to analyze at the tissue level in three dimensions and with high resolution.
  • the diameter of the electron beam is converged to 2-3 nm or less for image observation, and the diameter of the electron beam is at the limit of resolution, so that the object can be observed at a magnification of at most 100,000 times.
  • it is necessary to use a freeze fracture method for observation of three-dimensional structure In this case, a dedicated device for freezing the sample is required, and there is a problem that it is difficult to target and cut the site to be observed.
  • the freeze fracture method the sample surface needs to be coated with a metal, and only the surface morphology can be observed.
  • a cutting block surface observation method (SBF-SEM method) is also known, for example, from Patent Document 1.
  • This method incorporates a specially designed microtome into an SEM, and repeatedly performs cross-sectional observation of a biological tissue piece by SEM and surface layer cutting to synthesize several hundred to several thousand continuous cross-sectional images to form a three-dimensional image. It is a method of acquiring an image.
  • a specially designed stage with a microtome has been commercialized as a unit that can be retrofitted to commercially available SEMs, and is in widespread use.
  • it is necessary to repeat cutting a sample to several tens of nm several hundreds of times and several thousand times, so that it takes time for measurement and the sample is not cut off. It is.
  • Patent Document 3 discloses a technique of observing a paraffin-embedded sample with a thickness of 1 to 100 ⁇ m for SEM observation of the skin sample.
  • the observation technique introduced here is to digest cells from the sample obtained from skin tissue with formic acid etc, leave only collagen fibers between cells, and observe by immunostaining, and there are originally few collagen fibers. It is the securing of the thickness to leave, and the thickness of the object to be finally observed is decreasing. It is not a method to observe the structure and morphology of tissues composed of cells and intercellular matter.
  • Patent No. 5905910 Patent No. 4676339 JP, 2009-80108, A
  • the present invention makes it possible to perform three-dimensional observation of biological tissue simply and quickly without destroying biological tissue pieces, and a method of preparing biological tissue samples, and observation of biological tissue pieces It provides a method.
  • the observation method of a biological tissue sample according to the present invention is an observation method of a biological tissue sample for observing a three-dimensional form of the biological tissue sample, wherein the sample cut out from the biological tissue is fixed, dehydrated and embedded in paraffin. A sample with a thickness of 15 to 50 ⁇ m is cut out from the obtained sample block, the sample is reprinted on a surface-treated slide glass, the sample is stretched on the slide glass, deparaffinized, and then heavy metal based The sample is stained with a staining agent, and the stained sample is observed with a scanning electron microscope.
  • the method for preparing a biological tissue sample for observation with a scanning electron microscope has a thickness of 15 to 50 ⁇ m from a sample block obtained by fixing, dehydrating, or embedding in paraffin a sample cut from biological tissue.
  • the sample is cut out, the sample is transferred to a surface-treated slide glass, the sample is stretched on the slide glass, deparaffinized, and then the sample is stained with a heavy metal stain. I assume.
  • three-dimensional observation of biological tissue can be performed easily and quickly without destroying biological tissue fragments.
  • the observation image of the sample piece S for SEM observation cut out to a thickness of 30 ⁇ m is compared with the observation image of the optical microscope of a section cut out to a thickness of 4 to 5 ⁇ m.
  • FIG. 10 shows a first example of an observation image of rat lung tissue prepared at a thickness of 20 ⁇ m according to the first embodiment.
  • FIG. 10 shows a second example of an observation image of rat lung tissue prepared at a thickness of 30 ⁇ m according to the first embodiment.
  • It is a schematic diagram of a common SEM. It is a flowchart of a 2nd embodiment. It is a figure explaining the structure of SEM used in a 3rd embodiment. It is a contrast table which compared the embodiment of the present invention, general SEM observation, TEM observation, and observation of an optical microscope.
  • a sample for example, a tissue fragment such as an organ, a mini-organ produced from iPS cells, or a cell mass
  • a single-edge razor so as to be approximately a rectangular solid of several mm square
  • step S1 If the original size is about 1 mm square, as in the case of a mini organ, trimming is omitted, and the process directly proceeds to the next step S2. Thereafter, the trimmed sample is fixed with formalin solution or the like (step S2).
  • dehydration and replacement are performed on the fixed sample (step S3).
  • the dehydration treatment is performed, for example, by impregnating the sample fixed with formalin solution in an ethanol solution. Ethanol plays a role in preventing the penetration of the below-mentioned paraffin into biological tissue.
  • the substitution treatment is performed using a drug such as xylene or chloroform.
  • paraffin-embedded biological tissue can be stored semipermanently at room temperature. After paraffin is solidified, the top and bottom surfaces of the paraffin-embedded sample pieces are trimmed to about 1 mm and the side surfaces to about 3 mm with paraffin to make a sample block, and then the sample block is further sliced using a microtome MT. The sample piece for SEM observation is produced (step S5, FIG. 2 (a)).
  • the thickness of the sample piece for SEM observation is set to 15 to 50 ⁇ m (30 ⁇ m as a preferable example) corresponding to 3 to 10 times as large as 4 to 5 ⁇ m usually used in optical microscope observation.
  • SBF-SEM method or FIB-SEM method which is the same observation method by SEM, it is necessary to continuously cut out a section with a thickness of several tens of nm and to synthesize a plurality of images later.
  • observation of biological tissue is possible in one section of 15 to 50 ⁇ m in thickness. For this reason, as compared with the conventional observation method, preparation of the sample is improved in simplicity, rapidity and versatility.
  • a microtome replacement blade with a blade angle of 35 ° is usually used.
  • a microtome spare blade having a blade angle of 22 ° eg, a microtome spare blade manufactured by Feather Safety Razor Co., Ltd.
  • the sample piece S for SEM observation cut out to a thickness of 15 to 50 ⁇ m is attached (reprinted) to a slide glass SG which has been subjected to a predetermined surface treatment (step S6, FIG. 2 (b)). Thereafter, the slide glass SG is heated until the temperature of the sample piece S for SEM observation becomes 45 ° C. to 55 ° C., preferably 50 ° C., and the sample piece S for SEM observation is stretched on the slide glass SG under that temperature. (Step S7, FIG. 2 (c)).
  • the heating temperature of the slide glass SG of 45 ° C. to 55 ° C. is a temperature higher than 40 ° C. which is conventionally used. Also in this embodiment, it is possible to heat at 40 ° C.
  • the thickness of the sample piece S for SEM observation of the present embodiment is as large as 15 to 50 ⁇ m, preferably 30 ⁇ m, and it may be difficult to extend on the slide glass SG.
  • a hot plate (not shown) heated to about 45 ° C. to 55 ° C., preferably about 50 ° C., at a temperature higher than about 40 ° C., which is frequently used for sections of 4 to 5 ⁇ m thickness Stretching is effective. Sections with a thickness of 30 ⁇ m are likely to be peeled off (susceptible if the sample is thick) in the process of staining with ordinary slide glass SG.
  • slide glass specially coated with NEW Silane II made by Muto Kagaku etc. should be used Can solve the problem of peeling.
  • the sample piece S for SEM observation extended on the slide glass SG is deparaffinized to remove paraffin attached to the sample piece S (step S8).
  • the deparaffinization treatment is performed, for example, by immersing the sample piece S placed on the slide glass SG in xylene for a predetermined time, and then immersing it in a solvent such as ethanol whose concentration is gradually reduced. Finally, washing with water is performed, and the deparaffinization treatment is completed.
  • step S9 electron staining is performed on the sample piece S for SEM observation (step S9).
  • electron staining is performed by dropping 1.0% uranium acetate solvent onto the specimen S for SEM observation and waiting for 5 minutes, as shown in FIG. 2 (e), The washing process is carried out over several stages. After that, deparaffinization is performed again.
  • FIG. 2 (f) a Reynold's lead solution as an electron staining agent is dropped, and after waiting for 3 minutes, water washing is performed again as shown in FIG. 2 (g), and drying is performed. Do. The dried slide glass SG is placed on the stage of the SEM for observation.
  • stains such as osmium tetraoxide, platinum blue and lutetium triacetate can be used.
  • the combination of stains may be any combination suitable for the properties of the observation site.
  • the observation of a biological tissue sample with a light microscope is performed by hematoxylin-eosin staining (HE staining) after water washing of the sample, but in the first embodiment as described above, the staining containing heavy metal as in the TEM observation
  • the inside of the sample piece is stained with a solution and subjected to SEM observation. This process can increase the contrast of the reflected electron image.
  • a metal is coated on the sample by sputtering or vacuum evaporation in order to prevent electrification of the biological tissue sample, but in the present embodiment, the inside of the sample is observed. No metal coating is done to do this.
  • the low vacuum SEM observation avoids the problem of charging.
  • the addition of the ionic liquid avoids the problem of charging.
  • FIG. 9 is a schematic view of a general SEM.
  • the electron beam emitted from the electron source of the electron gun 101 is converged by the irradiation lens system 102 to reduce the diameter of the electron beam and finally mounted on the stage 113 as an electron beam with a diameter of about several nanometers by the objective lens 104 It irradiates on the sample piece S of the slide glass SG.
  • the electron beam scans a range of length l on the sample piece S by the scanning coil 103 by the XY scanning power source 109 in the display device 110.
  • Secondary electrons and reflected electron (backscattered electron) signals generated from the sample piece S are detected by the detectors 107 and 106 suitable for the respective signals, and converted into image density information by the image processing unit 108.
  • the information of the image density is arranged on the display device of the width L in synchronization with the XY scanning to form the SEM image.
  • the ratio of the width L of the display device 110 to the swing width l on the sample piece S is the magnification of the image. When the magnification is increased, the swing width l is decreased.
  • the observation magnification of the SEM can be set to several hundreds of thousands at the maximum, but in the case of this embodiment, the observation magnification may be about several hundred times to several thousand times and partially overlaps the observation magnification of the optical microscope It is a magnification of a degree.
  • the incident angle (tilt angle) of the electron beam is changed to, for example, about + 3 ° and -3 ° within the same field of view (difference), and the respective tilt angles
  • the backscattered electrons (or secondary electrons) are detected in step S12, and two images are photographed (steps S11 and S12), and this is stereo-observed with a stereoscope (not shown) or the like (step S13).
  • a stereoscope not shown
  • one of the two images can be changed to red and the other to blue, and stereoscopic observation can be performed with anaglyph glasses. If the three-dimensional structure of the sample can be sufficiently understood with only one image, only one image can be taken.
  • FIG. 3 is an example of an image obtained by observing a paraffin-embedded section with a thickness of 15 ⁇ m of rat kidney tissue prepared by the method of the present embodiment.
  • FIG. 3 (a) is an image when the observation magnification of the SEM is set to 300 times, similarly, FIG. 3 (b) is an image at 1000 times and (c) is an image at 4000 times.
  • FIG. 3 (a) the luminal structure of the renal corpuscle and the tubule can be observed, and in FIG. 3 (b), the clear luminal structure of the kidney glomerulus can be observed, FIG. 3 (c) In the above, podocyte protrusion structures are observed.
  • FIG. 4 compares an observation image according to the present embodiment with an observation image according to a conventional optical microscope image.
  • FIG. 4 (a) is the same image as FIG. 3 (b)
  • FIG. 4 (b) is an image at approximately the same magnification of the kidney glomerulus taken by hematoxylin-eosin staining (HE staining) and taken with a light microscope.
  • HE staining hematoxylin-eosin staining
  • FIG. 5 is a comparison of an observation image of the sample piece S for SEM observation cut out to a thickness of 30 ⁇ m and an observation image of an optical microscope of a section cut out to a thickness of 4 to 5 ⁇ m according to the present embodiment. is there.
  • Fig. 5 (a) is an observation example of a rat alveolar vesicle sample prepared at a thickness of 30 ⁇ m
  • Fig. 5 (b) is a thickness of 4 to 5 ⁇ m suitable for observation of the same sample by an optical microscope. It is an observation image of the optical microscope at the time of cutting out to.
  • the optical microscope image of FIG. 5 (b) having no thickness in the sample shows a mere form of one cross section. It has stopped, and it is impossible to grasp the three-dimensional structure of rat alveolar sample.
  • FIG. 6 shows a first example of an observation image of rat lung tissue produced at a thickness of 20 ⁇ m according to the present embodiment.
  • FIG. 6 (a) is an observation image when the observation magnification of the SEM is set to 600, and FIG. 6 (b) is 1200 and FIG. 6 (c) is 3000.
  • FIGS. 6 (a) and 6 (b) the structure of the alveoli can be observed, and in FIG. 6 (c), bronchial ciliated epithelium and round mucous cells are observed.
  • FIG. 7 is a second example of the observation image of rat lung tissue produced at a thickness of 30 ⁇ m according to the present embodiment, and the ciliated epithelium of each cell is visible.
  • the thickness and length of the pilus Surface shape and size of pilus cells and secretory granules, distribution density, etc. can be visually grasped.
  • FIG. 8 is an example of an observation image of a sample of rat blood vessel tissue prepared at a thickness of 30 ⁇ m according to the present embodiment.
  • the surface is not metal-coated and the sample is electron beam-stained, so by using the reflected electron signal, the internal structure of the tissue can be seen through (see symbol A in FIG. 8).
  • Structures and nuclei of endothelial cells (symbol B in FIG. 8) and the like have obtained new findings that can not be seen by the freeze-cut coated ordinary SEM sample preparation and observation method.
  • a sample cut out of a biological tissue is fixed, dehydrated and paraffin-embedded, preferably with a microtome replacement blade having an edge angle of 22 °, and a thickness of 15 to 50 ⁇ m.
  • the sample piece S is cut out. Thereafter, the sample piece S is transferred to the slide glass SG, and the sample piece S is stretched on the slide glass SG to carry out a deparaffinization treatment. Thereafter, the sample piece S is stained with a heavy metal stain for observation by SEM. Then, the stained sample piece S is observed with a scanning electron microscope.
  • the paraffin-embedded biological tissue can be stored semipermanently at room temperature, this method is applied to samples that were embedded several decades ago and high resolution analysis was not possible at that time. New knowledge can be expected. In the case of a pathological tissue, the resolution is insufficient with light microscopy and it is difficult to obtain knowledge, and in some cases the degree of disease progression can not be determined. However, accurate diagnosis is possible by obtaining detailed knowledge with SEM. It can do. And even a piece of tissue having a thickness of 15 ⁇ m or more, which is thicker than a section provided by an optical microscope, can be collectively observed in real time. Since the sample does not disappear as in the SBF-SEM method or the FIB-SEM method, the observation sample can be stored semipermanently. In addition to the quick acquisition of information from such characteristics, it is also possible to test the results by retesting and other means.
  • the ionic liquid to the surface of the sample piece S, accumulation of charge (charge up) on the sample piece S can be suppressed, which makes it easy to observe an image based on secondary electrons.
  • the observation of the sample piece S is mainly the surface.
  • the image below the surface is imaged, which allows stereoscopic observation of the sample.
  • observation using reflected electrons is also possible.
  • a method of observing a biological tissue sample and a method of producing a biological tissue sample according to the third embodiment will be described with reference to FIG.
  • a plurality of, for example, four divided backscattered electron detectors 106A to 106D are used as the detector 106.
  • the four backscattered electron detectors 106A to 106D have detection surfaces in the direction coincident with the azimuth angle of the backscattered electrons. That is, the backscattered electron detectors 106A to 106D are divided into a plurality of pieces by the azimuth angle of the backscattered electrons, and are configured to be able to form an image independently for each azimuth angle. This makes it possible to make the image based on the backscattered electrons clearer.
  • the embodiment of the present invention and general SEM observation, TEM observation, and observation of an optical microscope are compared with reference to the comparison table of FIG.
  • the sample is fixed / dehydrated, etc., then subjected to paraffin embedding treatment, and cut out to a thickness of 15 to 50 ⁇ m, thereby facilitating the three-dimensional structure of the biological tissue. It becomes possible to observe.
  • the thickness of cutting out of the sample is 5 ⁇ m or less because of the above-mentioned reason, and observation of a three-dimensional structure can not be performed with this.
  • the sample with the sample fixed, dehydrated and paraffin-embedded is cut out to 15 to 50 ⁇ m, and such processing is not performed under any observation of SEM, TEM, or optical microscope. It is The present invention makes it possible, for the first time, to simply carry out the three-dimensional structure of a biological tissue sample without destroying the tissue by processing such a sample.
  • observation equipment such as biology, histology, and pathology
  • teaching materials can be used in research and development of diagnostics, regenerative medicine, medicines, cosmetics, and food.

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Abstract

生物組織の立体的な観察を、簡易に且つ迅速に、生物組織片を破壊することなく実行可能にする生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法を提供する。本発明に係る生物組織試料の観察方法は、生物組織試料の立体的な形態を観察する方法であって、生物組織から切り出した試料を固定、脱水、及びパラフィン包埋して得られた試料ブロックから１５～５０μｍの厚さの試料を切り出し、前記試料を表面処理したスライドガラスに転載し、前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色し、染色した前記試料を走査型電子顕微鏡で観察する。

Description

生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法
　本発明は、生物組織試料の作成方法、及び生物組織試料の観察方法に関する。
　医学生物学分野、再生医療、創薬分野の生物組織の調査研究において、生物組織の形態を立体的に観察することが求められている。例えば、再生医療においては、ｉＰＳ細胞から臓器の元となるミニ臓器を作る。ミニ臓器はまた、創薬における研究開発のスクリーニングにも用いられている。このようなミニ臓器を更にいくつかに切って、臓器や組織の微細構造を立体的に把握しようとするニーズが非常に高まっている。
　しかし、生物組織の立体的観察は、観察に用いる顕微鏡の能力（倍率、焦点深度、解像度）などの理由から、必ずしも容易ではなく、様々な課題を有している。臓器などの生物組織を構成する細胞は、平均で１５μｍ程度の大きさを深さ方向にも有するので、複数の細胞で構成される生物組織の構造を立体的に捉えるためには、深さ方向に数十μｍの単位で一括して観察することが求められる。
　光学顕微鏡では、光の波長による制約から、数百ｎｍ程度が分解能の限界であり、最大倍率は千倍程度までとなる。肉眼の分解能は０．１ｍｍ程度とされていることから、光学顕微鏡により生物組織の詳細を観察することは困難である。また、通常の光学顕微鏡では、焦点深度が不足しており、数十μｍの厚さの生物組織を一括して観察することは困難である。光学顕微鏡では、例えば、光の回折による分解能の低下を抑えるために試料側開口角を数百ｍｒａｄ程度に設定する。例えば試料側開口角を５００ｍｒａｄに設定すると、試料上での最小錯乱円を１μｍ程度に抑えるためには、焦点深度は４μｍ程度になる。従って、試料の厚さも４μｍ以下に抑えなければならない。従って、光学顕微鏡での生物組織の観察は、５μｍ以下の厚さに生物組織をスライスして観察を行わざるを得ず、しかも十分な解像度が得られない。
　また、生物組織を透明化して、共焦点レーザー顕微鏡やシート照明顕微鏡を用いて三次元的に観察する方法も開発されているが、試料が透明化されるのに３から４日かかり、観察に要する時間が長いという問題がある。
　一方、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による三次元再構成による生物組織の観察方法も提案されている。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は分解能が約０．２ｎｍであり、最大で五十万倍程度の倍率での観察が可能である。このように、ＴＥＭによる観察方法は、分解能は十分に高いが、透過能による試料厚さの制約がある。具体的には、ＴＥＭでは１ｍｒａｄ程度の比較的平行な電子線を照射して試料を観察するが、試料と非常に強い相互作用が発生する電子線を透過させる必要性から、試料の厚さを１μｍ未満に抑える必要がある。このように、ＴＥＭは細胞内部の構造解析には向くが、組織の立体構造解析には適さない。
　一方、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）は、組織レベルでの解析が立体的かつ高分解能で可能な能力を持っている。ＳＥＭでは電子ビームの直径を２～３ｎｍ以下に収束させて像観察し、電子ビームの直径が分解能の限界となるので、最大で十万倍以上の倍率で対象物を観察することができる。
　しかし、ＳＥＭでの生物組織の観察では、立体的な構造の観察のためには凍結割断法を用いる必要がある。この場合、試料を凍結するための専用装置が必要で、観察したい部位を狙って割断することが困難であるという問題がある。また、凍結割断法では試料表面を金属でコーティングする必要があり、表面の形態のみしか観察することができない。
　また、ＳＥＭを用いた生物組織片の観察方法として、切削ブロック面観察法（ＳＢＦ－ＳＥＭ法）も、例えば特許文献１により知られている。この方法は、専用設計されたミクロトームをＳＥＭ内に組み込み、ＳＥＭによる生物組織片の断面観察と表層切削を反復して行うことにより、数百枚から数千枚の連続断面画像を合成して立体画像を取得する方法である。専用設計されたミクロトーム付きのステージが市販のＳＥＭに後付けできるユニットとして製品化され、普及が進んでいる。ただし、このＳＢＦ－ＳＥＭ法では、試料を数十ｎｍに切削することを数百回、数千回にわたり繰り返す必要があり、測定に時間を要すること、試料は切削されてなくなってしまうことが問題である。
　生物組織片を立体的に解析する別の手法として、例えば特許文献２に記載のＦＩＢ－ＳＥＭ法も知られている。ＳＢＦ－ＳＥＭ法と同様、本手法でも、試料を数十ｎｍに切削することを数百回、数千回にわたり繰り返す必要があり、測定に時間を要すること、試料は切削されてなくなってしまうことが問題である。
　なお、皮膚サンプルの評価方法として、皮膚サンプルのＳＥＭ観察のためにパラフィン包埋した１～１００μｍの厚さの試料で観察する技術が特許文献３により知られている。しかし、ここで紹介される観察技術は、皮膚組織から採った当該試料から細胞を蟻酸などで消化し、細胞間の膠原線維のみ残し、免疫染色して観察するものであり、もともと少ない膠原線維を残すための厚さの確保であり、最終的に観察する対象の厚さは減少している。細胞及び細胞間物質から構成される組織の構造、形態を観察する手法ではない。
　このように、ＳＥＭを用いた生物組織片の観察方法は複数提案されているが、いずれも生物組織片の立体構造を簡易に且つ迅速に行うことができるものではない。
　以上説明したように、生物組織の立体的な観察を、簡易に且つ迅速に、且つ生物組織片を破壊することなく実行することが求められていたが、従来の方法ではそれが困難であった。
特許第５９０５９１０号公報 特許第４６７６３３９号公報 特開第２００９－８０１０８号公報
　本発明は、この問題に鑑み、生物組織の立体的な観察を、簡易に且つ迅速に、生物組織片を破壊することなく実行可能にする生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法を提供するものである。
　本発明に係る生物組織試料の観察方法は、生物組織試料の立体的な形態を観察する生物組織試料の観察方法であって、生物組織から切り出した試料を固定、脱水、及びパラフィン包埋して得られた試料ブロックから１５～５０μｍの厚さの試料を切り出し、前記試料を表面処理したスライドガラスに転載し、前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色し、染色した前記試料を走査型電子顕微鏡で観察することを特徴とする。
　また、本発明に係る走査型電子顕微鏡で観察するための生物組織試料作成方法は、生物組織から切り出した試料を固定、脱水、パラフィン包埋して得られた試料ブロックから１５～５０μｍの厚さの試料を切り出し、前記試料を表面処理したスライドガラスに転載し、前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色することを特徴とする。
　本発明の生物組織試料の観察方法、及び試料作成方法によると、生物組織の立体的な観察を、簡易に且つ迅速に、生物組織片を破壊することなく実行可能にすることが可能になる。
第１の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法の手順を示すフローチャートである。 第１の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法の手順を示す概略図である。 第１の実施の形態の方法により作成した、ラットの腎臓組織の、厚さ１５μｍのパラフィン包理切片を観察した画像の一例である。 第１の実施の形態による観察画像と、従来の光学顕微鏡像による観察画像とを比較したものである。 第１の実施の形態に従い、３０μｍの厚さに切り出したＳＥＭ観察用試料片Ｓの観察画像と、４～５μｍの厚さに切り出した切片の光学顕微鏡の観察画像とを比較したものである。 第１の実施の形態に従い、２０μｍの厚さにて作製されたラット肺組織の観察画像の第１の例を示す。 第１の実施の形態に従い、３０μｍの厚さにて作製されたラット肺組織の観察画像の第２の例を示す。 第１の実施の形態に従い、３０μｍの厚さにて作製されたラット血管組織の試料の観察画像の一例である。 一般的なＳＥＭの模式図である。 第２の実施の形態のフローチャートである。 第３の実施の形態で使用されるＳＥＭの構造を説明する図である。 本発明の実施形態、一般的なＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察、及び光学顕微鏡の観察を比較した対比表である。
　次に、本発明の実施の形態を、図面を参照して説明する。
［第１の実施の形態］
　まず、第１の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図１のフローチャート、及び図２の概略図を参照して説明する。
　まず、試料（例えば、臓器、ｉＰＳ細胞から製造したミニ臓器などの組織片や細胞塊）を、片刃カミソリで数ｍｍ角の概ね直方体になるよう整形（トリミング）する（ステップＳ１）。ミニ臓器のように、もともとの大きさが１ｍｍ角程度である場合には、トリミングは省略され、そのまま次のステップＳ２に進む。
　その後、トリミング等された試料を、ホルマリン液などで固定する（ステップＳ２）。
　次に、固定された試料に対し、脱水処理及び置換処理を施す(ステップＳ３)。脱水処理は、例えばホルマリン液で固定後の試料をエタノール溶液に含浸させて行う。エタノールは、後述するパラフィンが生物組織に浸透することを防止する役割を有する。また、置換処理は、キシレンやクロロホルムなどの薬剤を用いて行われる。
　なお、上記のようなホルマリン液による固定に代えて、イソペンタン・プロパン凍結による固定処理を行った後、凍結置換を行うことも可能である。
　次に、脱水・置換後の試料に対し溶解させたパラフィンを浸透させて、パラフィン包理を行う（ステップＳ４）。パラフィンに包埋された生物組織は室温で半永久的に保存することができる。
　パラフィンが凝固したら、パラフィンで包理された試料片の上下面を１ｍｍ程度、側面は３ｍｍ程度にパラフィンごとトリミングして試料ブロックとした後、ミクロトームＭＴを使用して、更に試料ブロックを薄切りにしてＳＥＭ観察用試料片を作製する（ステップＳ５、図２（ａ））。このＳＥＭ観察用試料片の厚さは、光学顕微鏡観察で常用される４～５μｍに比して３～１０倍に相当する１５～５０μｍ（好適な例としては３０μｍ）とする。また、同じＳＥＭによる観察方法であるＳＢＦ－ＳＥＭ法やＦＩＢ－ＳＥＭ法では、数十ｎｍの厚さで切片を連続して切り出し、後に複数の画像を合成する必要があるが、本実施の形態の方法では、厚さ１５～５０μｍの１つの切片にて、生物組織の観察が可能である。このため、従来の観察法に比べ、試料の作製は簡便性・迅速性・汎用性が改善される。
　なお、光学顕微鏡での観察のために４～５μｍの厚さで試料を薄切りする際は、一般的に刃先角３５°のミクロトーム替刃が常用される。しかし、本実施の形態のように、１５～５０μｍ、好適には３０μｍの厚さで試料を薄切する場合には、刃先角２２°のミクロトーム替刃（例えば、フェザー安全剃刀社製ミクロトーム替刃品番Ａ２２などを使用することで、厚く切り出される切片の割れを抑えることができる。
　この１５～５０μｍの厚さに切り出されたＳＥＭ観察用試料片Ｓを、所定の表面処理を施したスライドガラスＳＧに貼付（転載）する（ステップＳ６、図２（ｂ））。その後、スライドガラスＳＧを、ＳＥＭ観察用試料片Ｓの温度が４５℃～５５℃、好ましくは５０℃になるまで加熱し、その温度下においてＳＥＭ観察用試料片ＳをスライドガラスＳＧ上で伸展させる（ステップＳ７、図２（ｃ））。
　この４５℃～５５℃、というスライドガラスＳＧの加熱温度は、従来において一般的な４０℃よりも高い温度である。本実施の形態でも、このような一般的な温度である４０℃で加熱することも可能である。
　ただし、本実施の形態のＳＥＭ観察用試料片Ｓの厚さは、１５～５０μｍ、好適には３０μｍと大きく、スライドガラスＳＧ上で伸展しにくい場合がある。そのような場合には、４～５μｍの厚さの切片で頻用される４０℃前後より高温の、４５℃～５５℃、好適には約５０℃に熱したホットプレート（図示せず）上で伸展することが効果的である。３０μｍ厚の切片は、通常のスライドガラスＳＧでは染色の過程で剥離（サンプルが厚いと剥離しやすい）しやすいが、例えば、武藤化学製のNEWシランIIにより特殊コーティングされたスライドガラスなどを用いることによって剥離の問題は解決される。
　その後、スライドガラスＳＧ上で伸展されたＳＥＭ観察用試料片Ｓに対し、脱パラフィン処理を行い、試料片Ｓに付着したパラフィンを除去する（ステップＳ８）。脱パラフィン処理は、例えば、スライドガラスＳＧに載置した試料片Ｓをキシレンに所定時間浸した後、濃度を段階的に薄めていったエタノールなどの溶媒に浸して行う。最後に水洗を行って、脱パラフィン処理は終了する。
　パラフィンが除去されたら、ＳＥＭ観察用試料片Ｓに対し、電子染色を行う（ステップＳ９）。電子染色は、例えば、図２（ｄ）に示すように、１．０％酢酸ウラン溶剤をＳＥＭ観察用試料片Ｓに滴下して５分間待機した後、図２（ｅ）に示すように、水洗処理を数段階に亘り実行する。その後、再度脱パラフィン処理を行う。次に、図２（ｆ）に示すように、電子染色剤としてのレイノルド鉛溶液を滴下し３分間待機した後、更に図２（ｇ）に示すように水洗処理を再度実行し、乾燥処理を行う。この乾燥させたスライドガラスＳＧをＳＥＭのステージに載置して、観察に供する。なお、上述した鉛/ウラン染色剤のいずれかに代えて、四酸化オスミウム、白金ブルー、三酢酸ルテチウムなどの染色剤を用いることができる。染色剤の組み合わせは、観察部位の特性に適した任意の組み合わせであり得る。
　光学顕微鏡での生物組織試料の観察は、試料の水洗後にヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）して観察するが、上記のように第１の実施の形態では、ＴＥＭ観察と同様に重金属を含む染色液で試料片の内部を染色し、ＳＥＭ観察をおこなう。この処理により反射電子像のコントラストを増加させることができる。なお、一般に、生物組織試料をＳＥＭ観察するためには、生物組織試料への帯電の防止のため、試料に金属をスパッタリングや真空蒸着によってコーティングするが、本実施の形態では、試料内部の観察を行うため、金属コーティングは行わない。第１の実施の形態では、低真空のＳＥＭ観察を行うことにより、帯電の問題を回避する。また、第２の実施の形態では、後述するように、イオン液体の付加により、帯電の問題を回避する。
　図９は、一般的なＳＥＭの模式図である。電子銃１０１の電子源から放出された電子ビームを照射レンズ系１０２によって収束させて電子ビームの直径を縮小し、対物レンズ１０４によって最終的に直径数ｎｍ程度の電子ビームとしてステージ１１３上に載置されたスライドガラスＳＧの試料片Ｓ上に照射する。該電子ビームは走査コイル１０３によって試料片Ｓ上の長さｌの範囲を、表示装置１１０内のＸＹ走査電源１０９によって走査する。
　試料片Ｓから発生した二次電子や反射電子(後方散乱電子)信号は、それぞれの信号に適した検出器１０７や１０６で検出され、画像処理部１０８により画像濃度の情報に変換される。ＸＹ走査に同期して画像濃度の情報を幅Ｌの表示装置に並べてＳＥＭ像を形成している。表示装置の１１０の幅Ｌと試料片Ｓ上での振り幅ｌとの比率が画像の倍率となる。倍率を大きくする時は振り幅ｌを小さくする。
　ＳＥＭを用いての試料の観察では、低真空走査電子顕微鏡（低真空ＳＥＭ）を用いることで、試料の帯電を抑制することができる。ＳＥＭにおいては、反射電子に基づく画像信号と、二次電子に基づく画像信号とが得られる。反射電子に基づく画像信号のみを利用することもできるし、二次電子に基づく画像のみを利用することもできる。また、反射電子に基づく画像信号と二次電子に基づく画像信号とを加算した画像信号を得ることも可能である。低真空ＳＥＭにおいては反射電子信号を利用する場合が多い。
ＳＥＭの観察倍率は、最大で数十万倍に設定することができるが、本実施の形態の場合、観察倍率は数百倍～数千倍程度でよく、光学顕微鏡の観察倍率の一部重なる程度の倍率である。
　本実施の形態では、立体画像を得るため、ＳＥＭにおいて、同一視野内で電子ビームの入射角度（傾斜角）を、例えば＋３°と－３°程度に変化させ（異ならせ）、それぞれの傾斜角で反射電子（又は二次電子）を検出し、二枚の画像を撮影し（ステップＳ１１、Ｓ１２）、これをステレオスコープ（図示せず）などにおいてステレオ観察する（ステップＳ１３）。
　なお、電子ビームの入射角度を変更する代わりに、ステージ１１３の傾斜角度を２通りに変化させて二枚の画像を撮影することもできる。また、２枚の画像の一方を赤、他方を青に変更して、アナグリフめがねで立体観察することもできる。なお、１枚の画像のみで試料の立体構造が十分に理解できる場合には、１枚の画像の撮影のみを行うこともできる。
　図３は、本実施の形態の方法により作成した、ラットの腎臓組織の、厚さ１５μｍのパラフィン包理切片を観察した画像の一例である。図３（ａ）はＳＥＭの観察倍率を３００倍に設定した場合の画像であり、同様に図３（ｂ）は１０００倍での画像、（ｃ）は４０００倍での画像である。図３（ａ）においては腎小体と尿細管の管腔構造が観察できていおり、図３（ｂ）においては腎糸球体の明確な管腔構造が観察できており、図３（ｃ）においては足細胞の突起構造が観察されている。
　図４は、本実施の形態による観察画像と、従来の光学顕微鏡像による観察画像とを比較したものである。図４（ａ）は図３（ｂ）と同じ画像であり、図４（ｂ）はヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）され光学顕微鏡によって撮影された腎糸球体のほぼ同倍率の画像である。図４（ｂ）の画像は、色の情報はあるものの、管腔構造は明確に撮影されておらず、その詳細な構造の把握は困難である。
　図５は、本実施の形態に従い、３０μｍの厚さに切り出したＳＥＭ観察用試料片Ｓの観察画像と、４～５μｍの厚さに切り出した切片の光学顕微鏡の観察画像とを比較したものである。図５（ａ）は３０μｍの厚さにて作製されたラット肺胞胞試料の観察例であり、図５（ｂ）は、は同じ試料を光学顕微鏡の観察に適した４～５μｍの厚さに切り出した場合の光学顕微鏡の観察画像である。図５（ａ）では肺胞壁の立体構造や肺胞壁の正面が観察できているが、試料に厚さがない図５（ｂ）の光学顕微鏡像では、単なる一断面の形態を示すに止まっており、ラット肺胞試料の立体構造の把握はできない。
　図６は、本実施の形態に従い、２０μｍの厚さにて作製されたラット肺組織の観察画像の第１の例を示す。図６（ａ）はＳＥＭの観察倍率を６００倍に設定した場合の観察画像であり、図６（ｂ）は１２００倍、図６（ｃ）は３０００倍である。図６（ａ）、（ｂ）においては肺胞の構造が観察でき、図６（ｃ）においては細気管支線毛上皮や円形の粘液細胞が観察されている。
　図７は、本実施の形態に従い、３０μｍの厚さにて作製されたラット肺組織の観察画像の第２の例であり、細胞ひとつひとつの線毛上皮が見える。一般的には本図を垂直方向に切断した断面を観察することが多く、そのような画像が一般的に文献等で紹介されているが、本図を補うことにより、線毛の太さや長さ、線毛細胞と分泌顆粒の表面形態と大きさ、分布密度などを視覚的に把握することができる。
　図８は、本実施の形態に従い、３０μｍの厚さにて作製されたラット血管組織の試料の観察画像の一例である。この試料では、その表面を金属コーティングせず、電子線染色された試料なので、反射電子信号を用いることで、組織の内部の構造が透視でき（図８の符号Ａ）、血管奥の結合組織の構造や内皮細胞の核など（図８の符号Ｂ）、凍結割断コーティングされた通常のＳＥＭ試料作成・観察法では見ることのできない新たな知見が得られている。
［効果］
　第１の実施の形態の効果を以下に説明する。第１の実施の形態では、生物組織から切り出した試料を固定、脱水及びパラフィン包理し得られた試料ブロックから、好適には刃先角２２°のミクロトーム替刃で、１５～５０μｍの厚さの試料片Ｓを切り出す。その後、試料片ＳをスライドガラスＳＧに転載し、当該試料片Ｓを前記スライドガラスＳＧ上で伸展し、脱パラフィン処理を行う。その後、ＳＥＭでの観察のため、重金属系の染色剤で試料片Ｓを染色する。そして、染色した試料片Ｓを走査型電子顕微鏡で観察する。パラフィン包埋した切片をＳＥＭで観察するので、光学顕微鏡では観察できなかった微細な構造を観察することができる。また、光学顕微鏡では数μｍ程度に薄切りして観察をする必要があったところ、本発明では観察にＳＥＭを用いるため、１５～５０μｍという厚さの試料片Ｓを（更に薄切りすることなく）一括して観察することができる。試料片Ｓが５０μｍのような大きな厚さを有していたとしても、ＳＥＭの大きな焦点深度により、試料片Ｓの表面から裏面まで、鮮明にその構造が撮像された立体画像を得ることができる。このような大きな厚さの試料片Ｓをリアルタイムに観察することは光学顕微鏡では不可能であり、また、ＳＥＭでも、従来はＳＢＭ－ＳＥＭ法などにより、薄切りされた試料片を連続撮影し、合成する必要があった。
　パラフィンに包埋された生物組織は室温で半永久的に保存することができることから、数十年前に包埋され、当時は高精細な解析が不可能であった試料に本法を応用することで新たな知見の取得が期待できる。病理組織の場合、光学顕微鏡では分解能が不足して知見を得ることが難しいので、疾患の進行度を判定することができないケースもあるが、ＳＥＭで詳細な知見を得ることで、正確な診断が行える。そして、光学顕微鏡で供する切片よりも厚い、１５μｍ以上の厚さの組織片であっても、一括してリアルタイムで観察することができる。ＳＢＦ-ＳＥＭ法やＦＩＢ-ＳＥＭ法のように、試料は消失しないので、観察試料は半永久的に保存できる。そのような特性から早い情報の取得とともに、結果の追試や別手段による検証も可能である。
［第２の実施の形態］
　次に、第２の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図１０のフローチャートを参照して説明する。
　この第２の実施の形態の観察方法は、高真空雰囲気化で行われる。このため、電子染色（Ｓ９）の後、イオン液体を、試料片Ｓの表面に塗布するか、又は試料片Ｓをイオン液体中に含浸させるなどして、試料片Ｓにイオン液体を付加させる（ステップＳ１０）。それ以外の工程は、第１の実施の形態（図１）と同一である。
　高真空のＳＥＭを用いた場合、試料片Ｓへの電荷の蓄積が増加し、二次電子に影響を与えることがある。しかし、イオン液体を試料片Ｓの表面に付加することで、試料片Ｓへの電荷の蓄積（チャージアップ）を抑制することができ、これにより二次電子に基づく画像が観察しやすくなる。ただし、この場合、試料片Ｓの観察は、主に表面となる。ただし、表面の下方の画像は撮像され、これにより試料を立体観察することができる。
　なお、第２の実施の形態においても帯電が問題にならない場合は、反射電子を用いた観察も可能である。
［第３の実施の形態］
　次に、第３の実施の形態に従う生物組織試料の観察方法、及び生物組織試料の作成方法を、図１１を参照して説明する。
　この第３の実施の形態では、ＳＥＭにおいて、図１１に示すように、検出器１０６として、複数、例えば４つに分割された反射電子検出器１０６Ａ～１０６Ｄを用いる。４つの反射電子検出器１０６Ａ～１０６Ｄは、反射電子の方位角に合致した向きに検出面を有する。すなわち、反射電子検出器１０６Ａ～１０６Ｄは、反射電子の方位角によって複数に分割されており、方位角ごとに独立して画像形成することが可能に構成されている。これにより、反射電子に基づく画像をより鮮明にすることができる。
　最後に、本発明の実施の形態と、一般的なＳＥＭ観察、ＴＥＭ観察、及び光学顕微鏡の観察を図１２の対比表を参照して比較する。図１２から明らかなように、本実施の形態によれば、試料を固定・脱水等した後、パラフィン包理処理を行い、１５～５０μｍの厚さに切り出すことで、容易に生物組織の立体構造を観察することが可能になる。このような試料の固定・脱水処理は、光学顕微鏡での観察では行われていたが、試料の切り出しの厚さは、上述の理由から５μｍ以下とされ、これでは立体構造の観察はできない。一方、一般のＳＥＭ観察では、金属コーティングを行った観察が行われ、これでは立体構造の観察はできない。
　この点、本実施の形態では、試料を固定、脱水及びパラフィン包理した試料を１５～５０μｍに切り出すものであり、このような処理はＳＥＭ、ＴＥＭ、光学顕微鏡のいずれの観察でも行われていなかったものである。本発明は、このような試料の処理を行うことにより、初めて生物組織試料の立体構造を、組織を破壊することなく簡便に行うことを可能にしたものである。
　以上、本発明のいくつかの実施の形態を説明したが、これらの実施の形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施の形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施の形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
生物学、組織学、病理学などの観察機器、教材に応用できるほか、診断、再生医療、医薬品、化粧品、食品の研究開発において利用が可能である。
１０１…電子銃、１０２…照射レンズ系、１０３…走査コイル、１０４…対物レンズ
１０６、１０６Ａ～１０６Ｄ…反射電子検出器、１０７…二次電子検出器、
１０８…画像処理部、１０９…走査電源、１１０…表示装置、１１３…ステージ、Ｓ…観察用試料片、ＳＧ…スライドガラス。

Claims (13)

  1. 　生体組織試料の立体的な形態を観察する生物組織試料の観察方法であって、
    　生物組織から切り出した試料を固定、脱水、及びパラフィン包埋して得られた試料ブロックから１５～５０μｍの厚さの試料を切り出し、
    　前記試料をスライドガラスに転載し、
    　前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、
    　その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色し、
    　染色した前記試料を走査型電子顕微鏡で観察する、
    　ことを特徴とする、生物組織試料の観察方法。
  2. 　前記試料を前記スライドガラス上で伸展することは、４５℃～５５℃の温度下で行われる、請求項１記載の生物組織試料の観察方法。
  3. 　前記試料ブロックからの試料の切り出しは、刃先角２２°のミクロトーム替刃を用いて行われる、請求項１又は２記載の生物組織試料の観察方法。
  4. 　前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる二次電子の信号に基づく画像を観察する、請求項１、２、３記載の観察方法。
  5. 　前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる反射電子の信号に基づく画像を観察する、請求項１、２、３記載の観察方法。
  6. 　前記走査型電子顕微鏡で、前記試料から生じる二次電子の信号と、前記試料から生じる反射電子の信号とを加算した信号に基づく画像を観察する、請求項１、２、３記載の観察方法。
  7. 　染色した前記試料に対し、更にイオン液体を付加させる、請求項４、５、６記載の生物組織試料の観察方法。
  8. 　前記走査型電子顕微鏡において、前記試料への電子線の入射角度が異なる複数の画像を取得することを特徴とする、請求項４、５、６、７記載の観察方法。
  9. 　前記走査型電子顕微鏡において、前記試料の傾斜角を異ならせて複数の画像を取得することを特徴とする、請求項４、５、６、７記載の観察方法。
  10. 　反射電子検出器が反射電子の方位角によって複数に分割され、方位角ごとに独立して画像形成する、請求項５、７記載の観察方法。
  11. 　生物組織から切り出した試料を固定、脱水、パラフィン包埋して得られた試料ブロックから１５～５０μｍの厚さの試料を切り出し、
    　前記試料をスライドガラスに転載し、
    　前記試料を前記スライドガラス上で伸展し、脱パラフィン処理を行い、
    　その後、重金属系の染色剤で前記試料を染色する
    ことを特徴とする、走査型電子顕微鏡で観察するための生物組織試料の作成方法。
  12. 　前記試料を前記スライドガラス上で伸展することは、４５℃～５５℃の温度下で行われる、請求項１１記載の生物組織試料の作成方法。
  13. 　前記試料ブロックからの試料の切り出しは、刃先角２２°のミクロトーム替刃を用いて行われる、請求項１１又は１２記載の生物組織試料の作成方法。
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