CN114839025B - 一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其依次包括以下步骤：组织预处理、组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与烘片、脱蜡和组织复水、染色、脱水与透明、封片和观察。本申请最终切片对蛹组织内部各个器官的区分度高，能观察到嗜尸性蝇类蛹组织完整的空间结构，适用于有坚硬外壳、液体含量较高、固定液渗透较慢的嗜尸性蝇类蛹组织虫体；本染色方法处理嗜尸性蝇类蛹组织，在显微镜下可以清晰地观察到大脑、胸神经节、胸部肌肉、黄体、直肠袋、触角、咽扩张肌、性腺等蛹组织内部结构器官，且该方法具有操作简单、耗时短、成本低等优势；本申请还填补了嗜尸性蝇类蛹组织内部器官及组织观察的空白。
Description
技术领域
本发明涉及显微组织切片技术领域，特别涉及一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法。
背景技术
昆虫学证据为法庭科学工作者提供特殊的视角和思考方向，在解决死亡时间、死亡地点、死亡原因等方面可以为案件侦破提供新的切入点和线索。双翅目(Diptera)中的嗜尸性蝇类是尸体上最常见的昆虫证据，因此被研究和实际应用最多，尤其是在一些非自然死亡、无监控、尸体高度腐败案件的调查中发挥了巨大的作用，受到法医昆虫学者的广泛关注。嗜尸性蝇类的蛹是案发现场常见的昆虫证据，对推断尸体的死亡时间具有重要作用，然而由于有蛹壳的阻碍，对蛹内发育观察造成了困难。
昆虫石蜡切片及染色技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术，利用组织切片技术可实现对嗜尸性蝇类蛹内部组织结构的观察，进而用于蛹期日龄和死亡时间的推断。然而目前石蜡切片及染色技术多用于昆虫幼虫及成虫的局部组织或器官，对于昆虫蛹组织的研究则较少。
针对嗜尸性蝇类蛹这种有坚硬外壳、液体含量较高、固定液渗透较慢的虫体材料,目前常规应用于其他虫态的石蜡切片及染色方法不仅操作复杂,需要耗费较长时间,更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想,最终切片对蛹组织内部器官区分度十分有限,部分蛹组织器官容易变形或破碎,难以观察到蛹组织完整空间结构，严重限制了嗜尸性蝇类在法庭科学中的研究和应用。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，此方法不仅填补了嗜尸性蝇类蛹组织内部器官及组织观察的空白，还解决了常见嗜尸性蝇类蛹组织切片染色困难等技术性难题，能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构
为了达到上述目的，本发明提供了一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其依次包括以下步骤：
组织预处理：嗜尸性蝇类常规饲养，然后将发育到不同发育阶段的嗜尸性蝇类蛹放入装有1％的PBS缓冲溶液的培养皿中，将培养皿置于体视显微镜下，调整成适合的倍数和亮度，用昆虫针、尖头镊和弯头镊剥去蛹壳，然后将剥掉蛹壳的蛹内组织放入超纯水中清洗一遍；
组织固定：将清洗后的蛹组织浸没在75％的乙醇固定液4℃固定24小时，然后转到Carnoy固定液中4℃固定12小时，再转到10％福尔马林固定液中常温固定12小时；
组织脱水：首先将固定后的蛹组织取出，在室温条件下，用流水漂洗30min去除固定液残留，再将漂洗过的蛹组织通过不同梯度的乙醇溶液进行脱水，具体脱水过程为：70％、80％、90％、95％、100％无水乙醇溶液依次脱水，每个梯度的处理时间为30min；
组织透明：将经过脱水处理后的蛹组织取出，室温下依次在二甲苯：乙醇为1:1的混合液、二甲苯：乙醇为2:1的混合液中浸泡10min，最后在100％二甲苯溶液中浸泡5min，进行透明处理；
浸蜡、包埋与切片：将经过透明处理后的蛹组织取出，在55℃的液体石蜡：二甲苯为1:1的混合液中浸泡120min，再将其放入盛有纯石蜡溶液的包埋盒中浸泡240min；将浸好蜡的蛹组织于包埋机内进行包埋；于-20℃冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块，将修整好的蜡块放在切片机上固定，组织切片厚度为4-6um，用新的钢刀刀片对石蜡蜡块进行连续切片；
展片与烘片：用眼科镊子镊起切好的石蜡切片轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平，待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中1/3和下1/3的中间，倾去载玻片上的余水，将切好的切片均匀的铺在烘片机上，温度设置为37℃，烘片；
脱蜡和组织复水：取烘片后的载玻片先后分别浸泡在体积分数为100％二甲苯Ⅰ5min、100％二甲苯Ⅱ5min、100％乙醇溶液3min、95％乙醇溶液3min、90％乙醇溶液3min、80％乙醇溶液3min、70％乙醇溶液3min、蒸馏水浸洗5min，进行脱蜡和组织复水；
染色：取组织复水后的载玻片分别浸泡在苏木精溶液中5min、蒸馏水中5min、返蓝液中1min、分化液中1min、伊红溶液中2min；
脱水与透明：取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5min,再依次浸泡在浓度梯度为70％乙醇溶液2min、85％乙醇溶液2min、95％乙醇溶液2min、100％乙醇溶液2min进行脱水，然后浸泡在100％二甲苯Ⅰ2min、100％二甲苯Ⅱ3min透明；
封片和观察：在染色完成的切片上滴加中性树胶,盖上盖玻片,置于通风橱中进行晾干后,在显微镜下观察。
依照本发明的一个方面，所述组织固定过程中的Carnoy固定液是由乙醇、氯仿和乙酸，按照6:3:1的比例混合。
依照本发明的一个方面，所述组织固定过程中，蛹组织完全浸没在固定液中，固定液用量与蛹组织体积比为50:1。
依照本发明的一个方面，所述组织脱水过程中，乙醇用量与蛹组织的体积比为50:1。
依照本发明的一个方面，所述浸蜡、包埋与切片过程中的包埋具体为先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。
本发明的实施优点：本发明提供的一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，不仅填补了嗜尸性蝇类蛹组织内部器官及组织观察的空白，还解决了常见嗜尸性蝇类蛹组织切片染色困难等技术性难题，采用该方法处理嗜尸性蝇类蛹组织，在显微镜下可以清晰地观察到大脑、胸神经节、胸部肌肉、黄体、直肠袋、触角、咽扩张肌、性腺等蛹组织内部结构器官，适用于有坚硬外壳、液体含量较高、固定液渗透较慢的嗜尸性蝇类蛹组织虫体，为开展嗜尸性蝇类蛹组织显微结构的研究提供了基础，且该方法具有操作简单、耗时短、成本低等优势。
附图说明
图1是本发明实施例1制备出的一种嗜尸性蝇类(棕尾别麻蝇)的不同发育阶段蛹组织的纵切面切片图；
图2是本发明对比例1制备出的一种嗜尸性蝇类(棕尾别麻蝇)的不同发育阶段蛹组织的纵切面切片图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有定义，下文所用专业术语和本领域专业技术人员所理解的含义一致；除非特殊说明，本文所涉及的原料、试剂均可从市场购买，或通过公知的方法制得。
实施例1
一种嗜尸性蝇类(棕尾别麻蝇)蛹组织石蜡切片染色方法，包括以下步骤：
(1)组织预处理：
棕尾别麻蝇常规饲养，然后将发育到不同发育阶段的蛹放入装有1％的PBS缓冲溶液的培养皿中，将培养皿置于体视显微镜(Moticam pro 285A)下，调整成适合的倍数和亮度，用昆虫针、尖头镊和弯头镊小心剥去蛹壳，然后将剥掉蛹壳的蛹内组织放入超纯水中小心清洗一遍。
(2)组织固定：
在化学通风橱中配制75％的乙醇固定液、Carnoy固定液、10％福尔马林固定液。其中Carnoy固定液是由乙醇、氯仿和乙酸，按照6:3:1的比例混合而来的混合型固定液。10％福尔马林固定液是由市面上销售的福尔马林(40％甲醛溶液)和水，按照1:9的比例混合而来的混合型固定液。
将清洗后的蛹组织浸没在75％的乙醇固定液4℃固定24小时，然后转到Carnoy固定液中4℃固定12小时，再转到10％福尔马林固定液中常温固定12小时。注意保证组织完全浸没在固定液中，固定液用量与蛹组织体积比为50:1。
(3)组织脱水：
首先将固定后的蛹组织取出，在室温条件下，用流水漂洗30min去除固定液残留，注意调节水流量大小。再将漂洗过的蛹样本通过不同梯度的乙醇溶液进行脱水，具体脱水过程为：70％、80％、90％、95％、100％无水乙醇溶液依次脱水，每个梯度的处理时间为30min。乙醇用量与虫体的体积比为50:1。
(4)组织透明：
将经过脱水处理后的蛹组织取出，室温下依次在二甲苯：乙醇为1:1的混合液、二甲苯：乙醇为2:1的混合液中浸泡10min，最后在100％二甲苯溶液中浸泡5min，进行透明处理。
(5)浸蜡、包埋与切片：
将经过透明处理后的蛹组织取出，在55℃的液体石蜡：二甲苯为1:1的混合液中浸泡120min，再将其放入盛有纯石蜡溶液的包埋盒中浸泡240min。将浸好蜡的蛹组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。将修整好的蜡块放在切片机上固定，组织切片厚度一般在设定为4-6um，用新的钢刀刀片对石蜡蜡块进行连续切片。
(6)展片与烘片：
用眼科镊子镊起切好的石蜡切片轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平。待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中1/3和下1/3的中间，倾去载玻片上的余水。将切好的切片均匀的铺在烘片机上，温度设置为37℃，烘片时间在12h左右。
(7)脱蜡和组织复水：
取烘片后的载玻片先后分别浸泡在体积分数为100％二甲苯Ⅰ5min、100％二甲苯Ⅱ5min、100％乙醇溶液3min、95％乙醇溶液3min、90％乙醇溶液3min、80％乙醇溶液3min、70％乙醇溶液3min、蒸馏水浸洗5min，进行脱蜡和组织复水。
(8)染色：
取组织复水后的载玻片分别浸泡在苏木精溶液中5min、蒸馏水中5min、返蓝液中1min、分化液中1min、伊红溶液(醇溶液)中2min。
(9)脱水与透明：
取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5min,再依次浸泡在浓度梯度为70％乙醇溶液2min、85％乙醇溶液2min、95％乙醇溶液2min、100％乙醇溶液2min进行脱水，然后浸泡在100％二甲苯Ⅰ2min、100％二甲苯Ⅱ3min透明。
(10)封片和观察：
在染色完成的切片上滴加中性树胶,盖上盖玻片,置于通风橱中进行晾干后,在显微镜下观察。
在显微镜下可以清晰地观察到大脑、胸神经节、胸部肌肉、黄体、直肠袋、触角、咽扩张肌、性腺等蛹组织内部结构器官。见图1。
对比例1
一种嗜尸性蝇类(棕尾别麻蝇)蛹组织石蜡切片染色方法，包括以下步骤：
(1)组织预处理：没有进行组织预处理步骤；
(2)组织固定：没有进行变换固定液操作，直接用10％福尔马林固定液固定24小时，剩余操作与实施例1一致；
(3)组织脱水：与实施例1一致
(4)组织透明：与实施例1一致
(5)浸蜡、包埋与切片：浸蜡改为120min，剩余操作与实施例1一致。
(6)展片与烘片：使用展片试剂展片，而不是温水展片，剩余操作与实施例1一致。
(7)脱蜡和组织复水：与实施例1一致。
(8)染色：与实施例1一致。
(9)脱水与透明：与实施例1一致。
(10)封片和观察：与实施例1一致。
在显微镜下不能得到完整的嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片，在显微镜下可以看到组织破碎，脱片、裂片现象严重，不能区分蛹组织内部各结构器官，不能用于正常的观察和研究。
由实施例1和对比例1可知，由于嗜尸性蝇类蛹的外部蛹壳存在，没有进行组织预处理的步骤，会导致固定液渗透不了蛹组织内部，导致固定效果不好，组织固定不足；对于组织固定操作，蛹这种非常柔软的组织，如果直接使用10％福尔马林固定液，会导致固定效果过强，组织质脆，切片容易导致组织破碎，而采用本发明的75％的乙醇固定液、Carnoy固定液，再转到10％福尔马林固定液，这种连续梯度固定操作，则会使固定效果较好。此外，为了使石蜡能充分融入组织，在浸蜡步骤，须将蛹浸蜡的时间延长至240min。贴片时，贴片剂含有蛋白会对切片背景产生干扰，因此，本发明中采用的温水漂浮贴片，可以得到干净的背景，上述步骤都不是单一有效的，上述步骤与其它步骤相互协同，共同作用实现本申请的技术效果。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (5)
1.一种嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，其依次包括以下步骤：
组织预处理：嗜尸性蝇类常规饲养，然后将发育到不同发育阶段的嗜尸性蝇类蛹放入装有1％的PBS缓冲溶液的培养皿中，将培养皿置于体视显微镜下，调整成适合的倍数和亮度，用昆虫针、尖头镊和弯头镊剥去蛹壳，然后将剥掉蛹壳的蛹内组织放入超纯水中清洗一遍；
组织固定：将清洗后的蛹组织浸没在75％的乙醇固定液4℃固定24小时，然后转到Carnoy固定液中4℃固定12小时，再转到10％福尔马林固定液中常温固定12小时；
组织脱水：首先将固定后的蛹组织取出，在室温条件下，用流水漂洗30min去除固定液残留，再将漂洗过的蛹组织通过不同梯度的乙醇溶液进行脱水，具体脱水过程为：70％、80％、90％、95％、100％无水乙醇溶液依次脱水，每个梯度的处理时间为30min；
组织透明：将经过脱水处理后的蛹组织取出，室温下依次在二甲苯：乙醇为1:1的混合液、二甲苯：乙醇为2:1的混合液中浸泡10min，最后在100％二甲苯溶液中浸泡5min，进行透明处理；
浸蜡、包埋与切片：将经过透明处理后的蛹组织取出，在55℃的液体石蜡：二甲苯为1:1的混合液中浸泡120min，再将其放入盛有纯石蜡溶液的包埋盒中浸泡240min；将浸好蜡的蛹组织于包埋机内进行包埋；于-20℃冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块，将修整好的蜡块放在切片机上固定，组织切片厚度为4-6um，用新的钢刀刀片对石蜡蜡块进行连续切片；
展片与烘片：用眼科镊子镊起切好的石蜡切片轻轻平铺在40～45℃的水面上，借水的张力和水的温度，将略皱的蜡带自然展平，待切片在恒温水面上充分展平后，将蜡片捞到载玻片的中1/3和下1/3的中间，倾去载玻片上的余水，将切好的切片均匀的铺在烘片机上，温度设置为37℃，烘片；
脱蜡和组织复水：取烘片后的载玻片先后分别浸泡在体积分数为100％二甲苯Ⅰ5min、100％二甲苯Ⅱ5min、100％乙醇溶液3min、95％乙醇溶液3min、90％乙醇溶液3min、80％乙醇溶液3min、70％乙醇溶液3min、蒸馏水浸洗5min，进行脱蜡和组织复水；
染色：取组织复水后的载玻片分别浸泡在苏木精溶液中5min、蒸馏水中5min、返蓝液中1min、分化液中1min、伊红溶液中2min；
脱水与透明：取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5min,再依次浸泡在浓度梯度为70％乙醇溶液2min、85％乙醇溶液2min、95％乙醇溶液2min、100％乙醇溶液2min进行脱水，然后浸泡在100％二甲苯Ⅰ2min、100％二甲苯Ⅱ3min透明；
封片和观察：在染色完成的切片上滴加中性树胶,盖上盖玻片,置于通风橱中进行晾干后,在显微镜下观察。
2.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，所述组织固定过程中的Carnoy固定液是由乙醇、氯仿和乙酸，按照6:3:1的比例混合。
3.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，所述组织固定过程中，蛹组织完全浸没在固定液中，固定液用量与蛹组织体积比为50:1。
4.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，所述组织脱水过程中，乙醇用量与蛹组织的体积比为50:1。
5.根据权利要求1所述的嗜尸性蝇类蛹组织石蜡切片染色方法，其特征在于，所述浸蜡、包埋与切片过程中的包埋具体为先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5700656A (en) * | 1995-05-25 | 1997-12-23 | Pig Research Institute, Taiwan | Silver stain for collagen matrix from paraffin embedded tissue |
| CN103759994A (zh) * | 2014-01-02 | 2014-04-30 | 河南科技大学 | 一种昆虫幼虫石蜡切片方法 |
| CN105928752A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-09-07 | 沈阳大学 | 一种昆虫成虫石蜡切片染色方法 |
| CN107917832A (zh) * | 2017-12-04 | 2018-04-17 | 山西农业大学 | 鱼类卵巢组织石蜡切片的制作方法 |
| WO2019082293A1 (ja) * | 2017-10-25 | 2019-05-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法 |
-
2022
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5700656A (en) * | 1995-05-25 | 1997-12-23 | Pig Research Institute, Taiwan | Silver stain for collagen matrix from paraffin embedded tissue |
| CN103759994A (zh) * | 2014-01-02 | 2014-04-30 | 河南科技大学 | 一种昆虫幼虫石蜡切片方法 |
| CN105928752A (zh) * | 2016-04-13 | 2016-09-07 | 沈阳大学 | 一种昆虫成虫石蜡切片染色方法 |
| WO2019082293A1 (ja) * | 2017-10-25 | 2019-05-02 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 生物組織試料の作成方法、及び生物組織片試料の観察方法 |
| CN107917832A (zh) * | 2017-12-04 | 2018-04-17 | 山西农业大学 | 鱼类卵巢组织石蜡切片的制作方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Seasonal necrophagous insect community assembly during vertebrate carrionde composition;Benbow M E 等;J Med Entormol;20131231;全文 * |
| 嗜尸性蝇类线粒体基因组结构特点与系统发育分析研究;尚艳杰 等;华中昆虫研究;20191231;全文 * |
| 蛆症异蚤蝇幼期石蜡切片的制备;冯典兴;关明慧;贾志红;杜新丽;岳国华;肖顺圆;;沈阳大学学报(自然科学版);20170615(03);全文 * |
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