CN110553890A - 马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，属于植物解剖技术领域。本发明选取正常生长的马铃薯植株的幼根和向阳面成熟叶片，经固定、保存、部分材料番红整体染色、脱水、透明、浸腊、包埋、切片、脱蜡、固绿染色和封片，得到马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片。本发明通过天然无毒的有机溶剂松节油来代替有机合成有毒溶剂二甲苯来作为透明剂，消除了二甲苯对制片工作和人体健康构成的潜在危险。同时优选高效贴片剂，优化了番红与固绿的染色方法，精简了脱水、透明和浸蜡的实验操作流程，当切片材料较多时，本发明在保证了切片高质量的前提下同时大大减少了制作切片的工作量，提高了制片的效率。
Description
技术领域
本发明属于植物解剖技术领域，具体涉及一种马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法。
背景技术
石蜡切片是观察植物显微结构最重要也是最常用的一种方法，在植物解剖学及其相关领域的生产和科研中有着广泛应用。近年来，石蜡切片技术活跃于植物科学研究的各个领域，并成为了研究不同环境条件下植物耐胁迫生态适应性研究的重要手段。然而，传统的石蜡切片方法不但耗时长，而且其常用的透明剂是二甲苯，二甲苯是有机合成的易挥发可疑致癌物，其气味不但臭而且毒性较大。颜士勇，郭丰涛，砖青.二甲苯对原代培养神经细胞毒性的实验研究，海军医学杂志，2002(3)：200-202，研究表明二甲苯能够通过呼吸道和皮肤粘膜进入人体，损害人的神经和呼吸道黏膜系统，对制片工作和人体健康构成了潜在的危险。此外传统石蜡切片程序复杂、步骤烦琐，不易切出满意的切片，因而石蜡切片技术的改进一直是学者关注和研究的重要问题之一。如杨虎彪，李晓霞，罗丽娟.植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良[J].植物学报.2009.44(2)：230-235.主要研究透明和脱蜡技术的改良；姜建福,赵长竹,方金豹.植物石蜡切片包埋、修错过程的改进[J].生物学杂志.2011.28(1):85-86.主要研究关于包埋和修蜡过程的改进；王静，左幸，黄正文.常规植物石蜡制片技术的改进及应用[J].安徽农学通报.2011.17(11):36-39.主要研究关于常规植物石蜡制片技术的改进等。但在安全、高效的关键性技术问题上尚未见有大的突破。
本发明以马铃薯的根、叶为主要试验材料，对传统植物石蜡切片方法的主要技术环节进行了长时间的探究和大胆的改进。成功地以天然无毒的有机溶剂松节油来代替二甲苯作为透明脱蜡剂、高效蛋白粘片剂，并改进番红与固绿的对染方法，精简脱水、透明、浸蜡和染色等试验操作流程。利用改进的石蜡切片技术对几十份马铃薯的根、叶组织材料进行了显微观察，得到的植物组织显微结构图像清晰，达到优质的效果，研究效果显著。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，而提供一种马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，该方法简便易行，不仅可以减少实验的工作量，缩短实验时间，而且能够大大提高制片质量，获得更清晰的马铃薯组织显微结构图像。
本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，包括如下步骤：
步骤一，取材、固定与保存：选取正常生长的马铃薯植株的幼根和向阳面成熟叶片，根切成小段，沿叶脉两侧切成小块，置于卡诺固定液中进行固定；将固定好的材料先用体积分数为95％的酒精浸泡，期间摇晃2～3次，再转入83％的酒精浸泡，期间摇晃2～3次，最后将材料转入70％的酒精中进行长时间的保存；
步骤二，部分材料进行番红整体染色：将保存到70％酒精中的材料取部分转到1％番红/70％乙醇染色液中整体染色；
步骤三，脱水、透明：将经1％番红/70％乙醇整体染色的材料，从83％乙醇开始逐级脱水，再用松节油进行透明处理；
步骤四，浸腊和包埋：将经过透明处理后的材料，进行浸蜡和包埋；
步骤五，切片、脱蜡与固绿染色：将包埋好的蜡块修整为小蜡块，然后进行切；将好的蜡带进行脱蜡，然后干燥，干燥后的切片用松节油脱蜡两次，脱蜡完毕，进入复水与固绿染色，固绿染色之后，再继续脱水和透明；
步骤六，封片：用浓度适中的中性树胶封片，即得马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片。
更进一步地，步骤一中，将根切成长2mm的小段，沿叶脉两侧切成4mm×8mm的小块，置于卡诺固定液中固定24h；将固定好的材料先用体积分数为95％的酒精浸泡1.5小时，期间摇晃2～3次，再转入83％的酒精浸泡1.5小时，期间摇晃2～3次，最后将材料转入70％的酒精中4℃下进行长时间的保存；
更进一步地，步骤二中，染色时间为48h。
更进一步地，步骤三所述从83％乙醇开始逐级脱水，再用松节油进行透明处理，具体为：83％乙醇→95％乙醇→无水乙醇→体积比为1:1的无水乙醇与松节油混合液→松节油，从83％乙醇到95％乙醇每级脱水1h，在无水乙醇中脱水2h，无水乙醇与松节油1:1混合液和松节油两级每级透明1.5小时，每级中间摇晃1次，每次换液时，将液体缓缓吸出，尽量不让余液留至下级。
更进一步地，步骤五中，将包埋好的蜡块修整为材料周围各留2mm的小蜡块；切片时的切片厚度8-12μm；干燥后的切片用松节油脱蜡两次，第一次12min，第二次10min；所述复水与固绿染色具体为：1:1无水乙醇与松节油混合液→无水乙醇→95％乙醇→0.5％固绿/95％乙醇染色液，每步停留4～5min；所述继续脱水和透明具体为：95％乙醇→无水乙醇→体积比为1:1的无水乙醇与松节油混合液→松节油→松节油，每步5min。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明通过天然无毒的有机溶剂松节油来代替有机合成有毒溶剂二甲苯来作为透明剂，消除了二甲苯对制片工作和人体健康构成的潜在危险。同时优选高效贴片剂，优化了番红与固绿的染色方法，精简了脱水、透明和浸蜡的实验操作流程，当切片材料较多时，本发明在保证了切片高质量的前提下同时大大减少了制作切片的工作量，提高了制片的效率。
附图说明
图1为光学显微镜4倍镜下马铃薯叶片石蜡切片图；
图2为光学显微镜10倍镜下马铃薯叶片石蜡切片图；
图3为光学显微镜10倍镜下马铃薯根尖石蜡切片图；
图4为光学显微镜40倍镜下马铃薯根尖石蜡切片图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等效形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
以下结合具体实施例对本发明做详细说明。
本发明中使用的70％乙醇、83％乙醇、95％乙醇等各乙醇的浓度均指体积浓度。
实施例
1.试剂的配制
1.1卡诺固定液
将无水乙醇和冰乙酸按3:1的比例进行配制。
1.2蛋白粘片剂
取鸡蛋清用玻璃棒搅化后用滤纸进行过滤，然后加入相同比例的甘油混合均匀保存。
1.3番红染色剂的配制
将1g番红溶于100mL的70％乙醇中待用。
1.4固绿染色剂的配制
将0.5g固绿溶于100mL的95％乙醇中即成。
1.5封片剂
用牙签沾取一定量的中性树胶于松节油还未干的载玻片上，将盖玻片沿着一边轻轻盖上。
2试验方法
2.1取材、固定与保存
选取正常生长马铃薯植株的幼根和向阳面成熟叶片。根切成长约2mm的小段，叶片最好选取新梢的成熟叶，太嫩的发育不完全，太老的中脉易断裂，沿叶脉两侧切成约4mm×8mm的小块，置于卡诺固定液中固定24h。将固定好的材料先用95％的酒精浸泡1.5小时，期间摇晃2～3次，再转入83％的酒精浸泡1.5小时，期间也摇晃2～3次，最后将材料转入70％的酒精中4℃下进行长时间的保存。
2.2部分材料进行番红整体染色
将保存到70％酒精中的材料取部分转到1％番红/70％乙醇染色液中整体染色48小时。
2.3脱水、透明
将1％番红/70％酒精整体染色的材料，从83％乙醇开始逐级脱水，再用松节油进行透明处理。即83％乙醇→95％乙醇→无水乙醇→体积比为1:1的无水乙醇与松节油混合液→松节油，具体为：将整体染色的材料先放入83％的乙醇中脱水1h，然后将材料再转入到95％的乙醇中继续脱水1h，用95％的乙醇脱水后迅速转入到无水乙醇中继续脱水2h，无水乙醇中脱水完成后将材料转入到无水乙醇与松节油1:1的混合液中进行透明处理1.5h，最后再将材料转入到松节油中继续进行透明处理1.5h，每次移样时，将材料取出后，应迅速放入滤纸上，再转入下级，以防材料将余液带至下级。
2.4浸腊和包埋
材料经松节油透明后，进行透蜡和包埋。首先，将经过透明的材料和松节油一起倒在浸蜡用的小烧杯中，蜡在75℃烘箱中溶化，将溶化的蜡缓缓倒入杯中并不断地摇晃小烧杯直至石蜡在松节油中呈过饱和状态，然后在35℃的电热恒温培养箱中浸蜡72小时。
72小时后将温度升到75℃使蜡块融化，同时在恒温培养箱中放几瓶纯石蜡，把原先折好的长∶宽∶高约为3∶1∶1的小纸盒放在台上，将熔化的纯石蜡倒入写有标签的纸盒内，再用稍热的镊子把材料移入纸盒里、为了防止材料沉入纸盒底部，用稍热的镊子反复整理材料几次，使熔蜡缓慢凝固成蜡块，尽量将材料包埋到石蜡的中央，方便后续的修蜡及切片。
2.5切片、脱蜡与固绿染色
将包埋好的蜡块修整为材料周围各留2mm的小蜡块，然后将小蜡块的一头和小木块在酒精灯上烧热，将小蜡块固定在小木块上。然后用切片机夹夹紧木块，使蜡块与刀口平行，然后进行切片。切片厚度以8-12μm为宜。选取好的蜡带，先在干净的载玻片上滴上鸡蛋清-甘油粘贴剂，再用毛笔轻轻将蜡带贴在载玻片上，放于40～45℃的恒温烫板表面进行展片，等蜡带溶化，蜡带中的小气泡全部散尽后取下并用铅笔写上标记(有些记号笔迹遇乙醇会褪色，影响后期染色)。然后置于35℃的电热恒温培养箱中烘片12小时。干燥后的切片用松节油脱蜡2遍，第1遍12min，第2遍10min。脱蜡完毕，即进入复水与固绿染色系列：1:1无水乙醇与松节油混合液→无水乙醇→95％乙醇→0.5％固绿/95％乙醇染色液，具体为：进入复水与固绿染色系列，将脱蜡完毕的切片放入无水乙醇与松节油1:1的混合液中4～5min，然后移入无水乙醇中继续复水4～5min，之后再转入95％乙醇中继续复水4～5min后将切片放入0.5％固绿/95％乙醇染色液中进行固绿染色，注意固绿染色停留时间最好进行镜检确定，即在固绿中染色1min时取出、放入95％乙醇中漂去浮色，在显微镜中观察着色效果而增减时间。经番红整体染色的材料红色较深，固绿染色时间稍长，可以获得很好的对染效果。固绿染色之后，再继续进行脱水和透明处理，将染色完毕的切片先放入95％乙醇中冲洗一下，再转入无水乙醇中脱水5min，脱水结束后再继续转入无水乙醇与松节油体积比1:1混合液中进行透明处理5min，最后将材料转入松节油中进行透明处理5min，为了使材料完全透明，此处我们在材料转入松节油中进行透明处理5min后，继续将材料放入新的松节油中再继续透明5min。
2.6封片
用浓度适中的中性树胶封片，在载玻片上尚有松节油时进行封片，有利于封片剂扩散，少有气泡。即在材料一边滴上封片剂，沿着一边轻轻盖上盖玻片。制片完成，稍干即可在显微镜下观察和摄像。
图1为光学显微镜4倍镜下马铃薯叶片石蜡切片图，在此图中可整体清晰的观察到马铃薯叶片薄壁组织细胞和海绵组织细胞的形状及结构。
图2为光学显微镜10倍镜下马铃薯叶片石蜡切片图，在此图中可进一步清晰的观察到马铃薯叶片局部放大的薄壁组织细胞和海绵组织细胞的形状及结构。
图3为光学显微镜10倍镜下马铃薯根尖石蜡切片图，在此图中可整体清晰的观察到马铃薯中柱鞘及导管细胞的形状及结构。
图4为光学显微镜40倍镜下马铃薯根尖石蜡切片图，在此图中可进一步清晰的观察到马铃薯根尖中柱鞘及导管细胞局部放大的形状及结构。
上述实施例对本发明的实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (5)
1.马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，取材、固定与保存：选取正常生长的马铃薯植株的幼根和向阳面成熟叶片，根切成小段，沿叶脉两侧切成小块，置于卡诺固定液中进行固定；将固定好的材料先用体积分数为95％的酒精浸泡，期间摇晃2～3次，再转入83％的酒精浸泡，期间摇晃2～3次，最后将材料转入70％的酒精中进行长时间的保存；
步骤二，部分材料进行番红整体染色：将保存到70％酒精中的材料取部分转到1％番红/70％乙醇染色液中整体染色；
步骤三，脱水、透明：将经1％番红/70％乙醇整体染色的材料，从83％乙醇开始逐级脱水，再用松节油进行透明处理；
步骤四，浸腊和包埋：将经过透明处理后的材料，进行浸蜡和包埋；
步骤五，切片、脱蜡与固绿染色：将包埋好的蜡块修整为小蜡块，然后进行切；将好的蜡带进行脱蜡，然后干燥，干燥后的切片用松节油脱蜡两次，脱蜡完毕，进入复水与固绿染色，固绿染色之后，再继续脱水和透明；
步骤六，封片：用浓度适中的中性树胶封片，即得马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片。
2.根据权利要求1所述的马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，其特征在于，步骤一中，将根切成长2mm的小段，沿叶脉两侧切成4mm×8mm的小块，置于卡诺固定液中固定24h；将固定好的材料先用体积分数为95％的酒精浸泡1.5小时，期间摇晃2～3次，再转入83％的酒精浸泡1.5小时，期间摇晃2～3次，最后将材料转入70％的酒精中4℃下进行长时间的保存；
3.根据权利要求1所述的马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，其特征在于，步骤二中，染色时间为48h。
4.根据权利要求1所述的马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，其特征在于，步骤三所述从83％乙醇开始逐级脱水，再用松节油进行透明处理，具体为：83％乙醇→95％乙醇→无水乙醇→体积比为1:1的无水乙醇与松节油混合液→松节油，从83％乙醇到95％乙醇每级脱水1h，在无水乙醇中脱水2h，无水乙醇与松节油1:1混合液和松节油两级每级透明1.5小时，每级中间摇晃1次，每次换液时，将液体缓缓吸出，尽量不让余液留至下级。
5.根据权利要求1所述的马铃薯根叶的安全高效的石蜡切片方法，其特征在于，步骤五中，将包埋好的蜡块修整为材料周围各留2mm的小蜡块；切片时的切片厚度8-12μm；干燥后的切片用松节油脱蜡两次，第一次12min，第二次10min；所述复水与固绿染色具体为：1:1无水乙醇与松节油混合液→无水乙醇→95％乙醇→0.5％固绿/95％乙醇染色液，每步停留4～5min；所述继续脱水和透明具体为：95％乙醇→无水乙醇→体积比为1:1的无水乙醇与松节油混合液→松节油→松节油，每步5min。
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|---|---|---|---|---|
| CN113358391A (zh) * | 2021-06-02 | 2021-09-07 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种植物叶片石蜡切片的方法 |
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