CN107702955B - 一种石蜡切片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种石蜡切片的制备方法，在制备切片的过程中，提供了一处高效环保的脱水透明剂和脱蜡剂，本发明所述的脱水透明剂与现有常用的二甲苯相比，更为安全环保，还可简化实验步骤，将脱水和透明在一步操作中完成。为进一步的提高操作的效率，针对于本申请的脱水透明剂和脱蜡剂，对脱水透明和染色脱蜡的操作条件进行了优化，严格控制各步骤的温度，并控制反应在负压的条件下进行，进而优化了染色脱蜡操作的步骤。通过上述操作，可大大缩短实验时间，且最终得到十分清晰的组织结构图。
Description
技术领域
本发明涉及石蜡切片技术领域，具体涉及一种脱水透明剂。
背景技术
石蜡切片(paraffin section)组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。
现有技术中的石蜡切片制备方法复杂，包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片、贴片、烤片、脱蜡至水、染色、脱水、透明、封片等多个步骤。而且在制备的过程中需要使用多种试剂，尤其是在透明的过程中通过使用二甲苯作为透明液，这种试剂具有较高的毒性。而且在制备的过程中由于步骤复杂，通常耗时较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效地制备石蜡切片的方法，其为通过有效地减少脱水透明和染色的时间，可明显地缩短石蜡切片的制备周期。具体的，包括如下步骤：材料的固定、脱水透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、染色脱蜡和封片；脱水透明中所用的脱水透明剂包括：
a：不同浓度梯度的乙醇溶液；
b：不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的混合液；
所述不同浓度梯度的乙醇溶液中，最小浓度的乙醇溶液与固定液操作中所使用的固定液中乙醇溶液的浓度相同；最大浓度的乙醇溶液的浓度为80～90％；
所述不同浓度梯度蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的混合液，按体积比，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35；5：40：55；0：25：75；和0：0：100；
所述浸蜡过程中所使用的试剂为不同浓度梯度的叔丁醇和石蜡的混合液以及纯石蜡，按体积重量比，所述不同浓度梯度的叔丁醇和石蜡的混合液的体积质量比为(4～7)mL:1g和(6～9)mL:3g。
现有技术中脱水和透明通常分两步进行，用酒精溶液完全将固定后的材料中的水分去替换，再用二甲苯、苯、氯仿或丙酮等透明剂进行透明处理，操作步骤复杂，且现用的透明剂多为有毒、有害试剂。本发明所述的试剂由乙醇和叔丁醇溶剂混合而成，毒性相对较小，安全环保，而且用这种试剂在进行脱水和透明的过程中可一步完成，不需要先将水分完全去除再进行透明处理，简化了操作步骤。而且与脱水透明剂相适应的，本申请对浸蜡试剂也进行了相应的调整，与现有技术相比，使用这种浸蜡试剂可缩短处理时间。
优选的，所述脱水透明的具体操作为，按浓度从小到大的顺序，用不同浓度梯度的酒精依次对材料进行处理，然后再按叔丁醇浓度从小到大的顺序，用不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的混合液对材料进行处理。
优选的，所述浸蜡的具体操作为按石蜡用量从小到大的顺序，用不同浓度梯度的叔丁醇和石蜡的混合液对材料进行处理，最后用所述纯石蜡对材料进行处理。
优选的，在用不同浓度梯度的酒精溶液对材料进行处理的过程中，控制温度为23～28℃，绝对压力0.01～0.03MPa，同一浓度的酒精溶液对材料的处理时间为0.5～2h；在用不同浓度的梯度蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的混合液对材料进行处理的过程中，控制温度为28～32℃，绝对压力0.02～0.04MPa，同一浓度的混合液对材料的处理时间为0.5～2h。
优选的，用叔丁醇和石蜡的混合液对材料进行处理的过程中，控制处理的温度比石蜡熔点的最低温度低0～3℃，绝对压力0.02～0.04MPa，在使用纯石蜡对材料进行处理的过程中控制温度比石蜡熔点的最高温度高0～10℃，绝对压力0.02～0.04MPa，同一浓度的叔丁醇和石蜡的混合液以及纯石蜡对材料的处理时间0.5～2h。
本申请中，脱水透明和浸蜡在负压的条件下进行，并严格地控制处理温度，可有效地缩短处理时间，提高制备效率。
优选的，所述染色操作为：将切片经1％番红水溶液染色和0.5％固绿溶液进行染色后，再进行脱蜡处理优选的。
更优选的，所述染色脱蜡的操作为：切片放入1％番红水溶液染色15min→70％酒精1min→0.5％固绿溶液染色3min→100％酒精10s→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min。
在常规方法中，脱蜡至水的具体操作为：石蜡切片依次经过2次二甲苯各10min，1/2二甲苯+1/2无水乙醇10min，2次无水乙醇各2min，95％，85％，75％，50％的乙醇各2min，最后蒸馏水水洗。染色的具体操作为：脱蜡至水的切片→0.1％番红染液(4h)→蒸馏水→50％酒精(1min)→75％酒精(1min)→85％酒精(1min)→95％酒精(1min)→0.1％固绿染液(30s)→95％酒精(1min)→100％酒精(1min)→1/2二甲苯+1/2无水乙醇(1min)→纯二甲苯透明(5min)。由以上操作步骤可知，本申请先染色后脱蜡，并优化了染色的具体操作，染色至脱蜡仅需约1小时20分钟，而传统的方法先脱蜡至水后染色，需要约4小时12分钟，因此，本申请的方法可大大缩短染色和脱蜡的时间。
优选的，本发明所述的方法包括如下步骤：
(1)固定：用FAA固定液对材料进行固定，固定时间为24h以上，所述FAA固定液由90mL70％的乙醇、5mL冰醋酸、5mL38％的甲醛、5mL甘油混合配成；
(2)脱水透明：材料先经过70％乙醇和80％乙醇在温度23～28℃，绝对压力0.02MPa的条件下分别处理0.5～1.5h；
再经过不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，在温度29～31℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理时间为0.5～1.5h；所述不同浓度梯度的述混合液，按体积比，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35；5：40：55；0：25：75；0：0：100；其中，体积比0：0：100混合液需处理2次；经过以上操作，渐次脱去组织中的水分并透明；
(3)浸蜡：将透明后的材料放置在不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，在温度低于石蜡熔点的最低温度低0～3℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理的时间为1～2h；所述不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，叔丁醇和石蜡碎屑的体积质量比分别为(4～7)mL:1g和(6～9)mL:3g；之后在温度高于石蜡熔点的最高温度0～10℃，绝对压力0.03MPa的条件下进行处理，每间隔1h换一次纯蜡，共换2次；
然后依次进行包埋、切片、展片、贴片、烤片、染色脱蜡和封片；
所述染色具体为：将切片依次经1％番红水溶液染色和0.5％固绿溶液进行染色后，再进行脱蜡处理。
进一步优选的，包括如下步骤：
(1)固定：用FAA固定液对材料进行固定，固定时间在24h以上；
(2)脱水透明：将所述材料先经过70％乙醇和80％乙醇在温度24℃，绝对压力0.02MPa的条件下分别处理1h；
再经过不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，在温度30℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理时间为1h；所述不同浓度梯度的述混合液，按体积比，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35；5：40：55；0：25：75；和0：0：100；其中，体积比0：0：100混合液需处理2次；经过以上操作，渐次脱去组织中的水分并透明；
(3)浸蜡：将透明后的材料放置在不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，在温度低于石蜡熔点的最低温度0～3℃，绝对压力0.03MPa的条件下进行处理，每次处理的时间为1h；所述不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，叔丁醇和石蜡碎屑的体积质量比分别为6mL:1g和8mL:3g；之后在温度高于石蜡熔点的最高温度0～10℃，绝对压力0.03MPa的条件下，每间隔1h换一次纯蜡，共换2次，完成浸蜡；
(4)包埋；
(5)切片，切片至厚度为8～12um；
(6)展片和贴片
(7)烤片，将切好的切片粘在粘附性载玻片上，置于38～40℃烘箱中过夜。
(8)染色和脱蜡：切片放入1％番红水溶液染色15min→70％酒精1min→0.5％固绿溶液染色3min→100％酒精10s→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min；
(9)封片。
番红在常规的石蜡切片中要在脱蜡后“复水”才染色，然后再脱水才能染固绿。复水、脱水都要在不同浓度的乙醇水溶液中逐级进行，材料在溶液中浸泡时间长、移动次数多，极易从载玻片上脱落。本方法改进在片染时直接进行染色，水洗掉浮色后直接用吹风机吹干。这样免去了复水和脱水等一系列操作程序，大量减少了实验时间、移动次数和掉片现象，而且材料着色较深，分色效果显著，结构图像清晰。
上述方法中：
FAA固定液：100mLFAA固定液由90mL70％的乙醇、5mL冰醋酸、5mL38％的甲醛、5mL甘油混合配成。
1％番红染液：将1g番红溶于100mL的水中即成。
0.5％固绿染液：将0.5g固绿溶于100mL的95％乙醇中即成。
蛋白粘贴剂：鸡蛋打孔取蛋清25mL，加入甘油25mL和防腐剂石碳酸0.5g，用力摇动，产生很多泡沫，静止片刻，使泡沫上升到液面，倒去泡沫或用纱布过滤即可。
上述蛋白粘贴剂在贴片的过程中使用。
为了便于在包埋、切片和选片中辨认和操作，可以在脱水时将材料整体染色，即第一步放在0.5％的番红70％乙醇溶液中脱水。
本发明的最后一个目的是保护本发明的方法在制备绦柳花芽、红叶石楠叶片和幼嫩茎段和狗尾草叶片、茎秆以及根尖石蜡切片中的应用。
本发明的方法是适用于多种植物的简单、高效的石蜡切片的制备方法，经试验，在制备绦柳花芽、红叶石楠叶片和幼嫩茎段和狗尾草叶片、茎秆以及根尖石蜡切片中的效果均较好。
本发明所述的方法具有如下有益效果：
1)本发明提出了一种更为安全环保的脱水透明剂，简化了实验步骤，操作的安全性更高。
2)为进一步的提高操作的效率，针对于本申请有脱水透明剂和脱蜡剂，本发明对脱水透明和染色脱蜡过程的具体操作进行了优化，严格控制各步骤的温度，并控制反应在负压的条件下进行，进一步优化染色脱蜡的操作步骤，可大大地提高操作效率，缩短实验时间，且能够得到十分清晰的组织结构图。
3)本发明从脱水透明、脱蜡和染色多个步骤进行改进，提出了一种操作简便、安全环保、制备周期短，且制片效果好，组织结构完整，图像清晰的石蜡切片的制备方法。
附图说明
图1常规方法石蜡切片绦雌柳花芽10×10；
图2改良方法石蜡切片绦雌柳花芽10×10；
图3改良方法石蜡切片红叶石楠叶片10×10；
图4改良方法石蜡切片红叶石楠幼嫩茎段4×10；
图5改良方法石蜡切片狗尾草叶片20×10；
图6改良方法石蜡切片狗尾草茎秆20×10；
图7改良方法石蜡切片狗尾草根尖10×10。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例涉及一种绦柳花芽石蜡切片的制备方法，包括如下步骤：
(1)固定：用FAA固定液对绦柳花芽进行固定，固定时间在24h以上，将固定好的花芽剥除鳞片；
(2)脱水透明：将所述绦柳花芽先经过70％乙醇和80％乙醇在温度24℃，绝对压力0.02MPa的条件下分别处理1h；
再经过不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，在温度30℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理时间为1h；所述不同浓度梯度的述混合液，按体积比，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35；5：40：55；0：25：75、0：0：100和0：0：100(即0：0：100这个体积比需要进行2次操作)；将绦柳花芽经上述混合液依次进行处理，渐次脱去组织中的水分并透明；
(3)浸蜡：将透明后的材料分别放置在浓度比例为6mL:1g和8mL:3g的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，在温度54℃，绝对压力0.03MPa的条件下进行处理，每次处理的时间为1h；之后在温度60℃绝对压力0.03MPa的条件下，用纯蜡进行处理，每次处理1h，共换蜡2次，完成浸蜡；
(4)包埋；
(5)切片，切片至厚度为8～12um；
(7)烤片，将切好的切片粘在粘附性载玻片上，置于38～40℃烘箱中过夜。
(8)染色和脱蜡：切片放入1％番红水溶液染色15min→70％酒精1min→0.5％固绿溶液染色3min→100％酒精10s→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min；
(9)封片。
其显微结构图如图2。
实施例2
本实施例涉及一种红叶石楠叶片石蜡切片的制备方法，其步骤与实施例1中相同。其显微结构图如图3，由图可看出，其组织结构完整，几乎无蜡片脱落现象，图像清晰。
实施例3
本实施例涉及一种红叶石楠幼嫩茎段石蜡切片的制备方法，其步骤与实施例1中相同。其显微结构图如图4，由图可看出，其组织结构完整，几乎无蜡片脱落现象，图像清晰。
实施例4
本实施例涉及一种狗尾草叶片石蜡切片的制备方法，其步骤与实施例1中相同。其显微结构图如图5，由图可看出，其组织结构完整，几乎无蜡片脱落现象，图像清晰。
实施例5
本实施例涉及一种狗尾草茎秆石蜡切片的制备方法，其步骤与实施例1中相同。其显微结构图如图6，由图可看出，其组织结构完整，几乎无蜡片脱落现象，图像清晰。
实施例6
本实施例涉及一种狗尾草根尖石蜡切片的制备方法，其步骤与实施例1中相同。其显微结构图如图7。由图可看出，其组织结构完整，几乎无蜡片脱落现象，图像清晰。
实验例
采用常规的方法制备绦柳花芽石蜡切片(其显微结构图如图1)和实施例1的方法制备切片的比较
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (3)
1.一种用于制备绦柳花芽、红叶石楠叶片、红叶石楠幼嫩茎段、狗尾草叶片、狗尾草茎秆以及狗尾草根尖石蜡切片的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固定：用FAA固定液对材料进行固定，固定时间在24h以上，所述FAA固定液由90mL70％的乙醇、5mL冰醋酸、5mL38％的甲醛、5mL甘油混合配成；
(2)脱水透明：材料先经过70％乙醇和80％乙醇在温度23～28℃，绝对压力0.02MPa的条件下分别处理0.5～1.5h；
再经过不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，在温度29～31℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理时间为0.5～1.5h；所述不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35，5：40：55，0：25：75，0：0：100；其中，体积比0：0：100混合液需处理2次；经过以上操作，渐次脱去组织中的水分并透明；
(3)浸蜡：将透明后的材料放置在不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，在温度低于石蜡熔点的最低温度0～3℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理的时间为1～2h；所述不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，叔丁醇和石蜡碎屑的体积质量比分别为(4～7)mL:1g和(6～9)mL:3g；之后在温度高于石蜡熔点的最高温度0～10℃，绝对压力0.03MPa的条件下进行处理，每间隔1h换一次纯蜡，共换2次；
然后依次进行包埋、切片、展片、贴片、烤片、染色脱蜡和封片；
所述染色脱蜡具体为：将切片依次经1％番红水溶液染色和0.5％固绿溶液进行染色后，再进行脱蜡处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色脱蜡的具体操作为，切片放入1％番红水溶液染色15min→70％酒精1min→0.5％固绿溶液染色3min→100％酒精10s→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固定：用FAA固定液对材料进行固定，固定时间在24h以上；
(2)脱水透明：将所述材料先经过70％乙醇和80％乙醇在温度24℃，绝对压力0.02MPa的条件下分别处理1h；
再经过不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，在温度30℃，绝对压力0.02～0.03MPa的条件下进行处理，每次处理时间为1h；所述不同浓度梯度的蒸馏水、95％乙醇和叔丁醇混合溶液，按体积比，蒸馏水、95％乙醇溶液以及叔丁醇的体积比分别为15：50：35，5：40：55，0：25：75和0：0：100；其中，体积比0：0：100混合液需处理2次；经过以上操作，渐次脱去组织中的水分并透明；
(3)浸蜡：将透明后的材料放置在不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，在温度低于石蜡熔点的最低温度0～3℃，绝对压力0.03MPa的条件下进行处理，每次处理的时间为1h；所述不同浓度比例的叔丁醇和石蜡碎屑混合溶液中，叔丁醇和石蜡碎屑的体积质量比分别为6mL:1g和8mL:3g；之后在温度高于石蜡熔点的最高温度0～10℃，绝对压力0.03MPa的条件下，每间隔1h换一次纯蜡，共换2次，完成浸蜡；
(4)包埋；
(5)切片，切片至厚度为8～12um；
(6)展片和贴片
(7)烤片，将切好的切片粘在粘附性载玻片上，置于38～40℃烘箱中过夜；
(8)染色脱蜡：切片放入1％番红水溶液染色15min→70％酒精1min→0.5％固绿溶液染色3min→100％酒精10s→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min→超安环保透明剂脱蜡20min；
(9)封片。
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