CN111257089A - 一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法，包括以下步骤：(1)固定；(2)脱水；(3)浸蜡；(4)包埋；(5)切片与展片；(6)脱蜡与复水；(7)甲苯胺蓝染色，镜检，根据组织着色深浅进行适当的分化，烤干；(8)透明封片。本发明针对蝴蝶兰不同花部组织优化了固定，软化和脱水环节试剂的成分和操作时间，更好地保持了切片中细胞的完整性，能清晰区分开未木质化的柔软组织和木质化的较硬组织。
Description
技术领域
本发明属于石蜡切片技术领域，具体涉及一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法。
背景技术
石蜡切片是指通过石蜡包埋的方式对组织进行制片处理，是组织学常用的一种制片方式。
目前常规石蜡切片的制作方法存在着一些不足。其中之一是周期较长，做一批所需要的时间长，且手续复杂，步骤多，传统的石蜡切片包括取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片和粘片、脱蜡、染色、及封片。另外，除了周期长各步骤还同时互相关联，某个步骤的失误会直接影响观察结果，例如脱水、透明、浸蜡、包埋的过程中操作不够严谨，容易使材料变脆，变硬或变形而导致无法继续下一步过程。
关于石蜡切片耗时问题上，相关研究在时间和步骤上开展了优化。对茉莉叶石蜡切片繁琐的步骤进行改进，在清洗、脱水、透明、浸蜡等步骤进行时间上的优化，结果比常规节省了1840分钟，且玻片较为清晰[1]。在使用木兰不同时期的花蕾制作切片时，不脱蜡直接进行番红染色，省略一堆繁琐步骤的同时，制片效果也较为不错[2]。
常规石蜡切片另外一个缺点是制片过程的步骤需要根据材料的不同而做出具体调整，这是因为制作不同种或属之间的植物组织石蜡切片差异较大，即使是同一物种，不同器官也需要做出相应的调整。除此以外渗蜡步骤也因不同部位和生长时期具有较大差异，且根据不同组织特点，染色方法也需要进行对应调整。
中国专利201810137942.2中公开了一种枣花石蜡切片的制备方法，是将带有0.3～0.5cm的茎段的枣花花蕾通过染色方式和脱水方式优化后的步骤制备石蜡切片，能够较好地保持细胞形态和胚囊发育结构。该方法可以对不同发育时期的枣花花蕾进行石蜡切片，进而观察整个枣花发育过程中囊胚组织结构的变化及生殖过程的基本规律。
目前关于蝴蝶兰的石蜡切片报道较少，较多集中在胚性愈伤组织和叶片组织方面，而关于花梗和花瓣等花部组织观察较少。本研究通过开展蝴蝶兰花瓣及花梗的观察，可以对蝴蝶兰最具经济效益、最有代表性的花朵部位，从细胞学水平进行观察研究，同时对蝴蝶兰花梗和花瓣的石蜡切片进行步骤的优化，以期望得到更快，更好的观察结果，从而提高经济及科研价值。
[1]邓传远，郭素枝，刘伟军，潘东明，赖钟雄，茉莉叶石蜡制片技术的改进，三明学院院报，2008，25(2)：187-189。
[2]王静，左幸，黄正文，常规植物石蜡制片技术的改进及应用，安徽农业通报，2011，17(11)：36-38。
发明内容
本发明提供了一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法。通过对花朵的不同组织部位优化了各自适合的制作方法，更好地保持了切片中细胞的完整性，成品石蜡切片能清晰区分开未木质化的柔软组织和木质化的较硬组织。
一方面，本发明提供了一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法，包括以下步骤：
(1)固定：使用含不同浓度的酒精的FAA固定液对蝴蝶兰花的不同部位进行固定；
(2)脱水：将不同的花部组织采用依次梯度酒精进行脱水；
(3)浸蜡：脱水完成后材料在恒温箱中浸入融化石蜡1h，更换三次融化石蜡，每次浸入1h；
(4)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，蜡凝固后修整蜡块；
(5)切片与展片：切片后漂浮于摊片机温水上将组织展平；烤片；
(6)脱蜡与复水：依次将切片放入脱蜡剂20分钟后，更换脱蜡剂再脱蜡20分钟，再切换无水乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-75％酒精5分钟，自来水冲洗；
(7)甲苯胺蓝染色，镜检，根据组织着色深浅进行适当的分化，烤干；
(8)透明封片：二甲苯透明5分钟，使用中性树胶封片，烘干。
具体地，所述的步骤(1)中不同酒精浓度的FAA固定液的使用方法为：花瓣组织使用含50％酒精的FAA固定液进行固定；花梗组织使用含70％酒精的FAA固定液进行固定。
进一步具体地，所述的50％酒精的FAA固定液的组成为38％甲醛5mL:冰醋酸5mL:50％酒精90mL；所述的70％酒精的FAA固定液的组成为38％甲醛5mL:冰醋酸5mL:70％酒精90mL。
具体地，所述的步骤(2)采用的依次梯度酒精脱水的方法根据不同花部组织有所不同，其中：花瓣组织的脱水方法为75％酒精4小时-85％酒精2小时-90％酒精2小时-95％酒精1小时-无水乙醇30分钟-无水乙醇30分钟-醇苯5分钟-二甲苯5分钟-二甲苯5分钟；花梗组织的脱水方法为60％酒精4小时-65％酒精4小时-70％酒精3小时-75％酒精3小时-80％酒精3小时-85％酒精3小时-90％酒精2小时-95％酒精2小时-无水乙醇1小时-无水乙醇1小时-醇苯10分钟-二甲苯10分钟-二甲苯10分钟。
具体地，所述的步骤(3)恒温箱的温度根据石蜡融点确定；在一些实施例中，优选为65℃。
优选地，所述的步骤(5)切片厚度为4μm，摊片机温水温度为40℃，烤片温度为60℃。
优选地，所述步骤(6)的脱蜡剂为二甲苯。
优选地，所述步骤(7)染色时间为2-5分钟。
优选地，所述步骤(8)烘干温度为32℃。
可选择地，对于蝴蝶兰花部组织已木质化结构，如较长较硬的花梗，在步骤(1)固定和步骤(2)脱水之间增加软化步骤。
具体地，所述的软化步骤为将包埋框放入容器，倒入软化剂，放入55℃鼓风干燥箱中，进行软化。软化剂更换周期为7天，每周观察一次软化程度。当用拇指和食指轻轻按压组织时，组织按压得动且有弹性时，即软化完成。
具体地，所述的软化步骤中，具体软化时长需根据蝴蝶兰花梗的木质化程度不同确定。
进一步具体地，所述兰花梗的木质化程度包括：刚萌发的花梗芽(轻微木质化)、较长较硬的花梗(进一步木质化)；其中较长较硬的花梗的软化时间为刚萌发的花梗芽的1.5-2.5倍；优选地，刚萌发的花梗芽的软化时间为12-16天，较长较硬的花梗的软化时间为28-32天；进一步优选为刚萌发的花梗芽的软化时间为14天，较长较硬的花梗的软化时间为30天。
具体地，所述的软化剂包括但不限于：乙二胺水溶液软化剂、甘油-乙醇软化剂、纤维素乙酸酯、福尔马林-乙酸-乙醇软化剂等。
优选地，所述的乙二胺水溶液软化剂的使用浓度为4％的水溶液。
另一方面，本发明提供了一种蝴蝶兰花部组织的石蜡切片。
具体地，所述的蝴蝶兰花部组织的石蜡切片通过上述制备方法制备。
具体地，所述的蝴蝶兰花部组织的石蜡切片包括但不限于花瓣组织，花梗组织的石蜡切片。
再一方面，本发明提供了一种蝴蝶兰花部组织的石蜡切片的应用。
具体地，所述的蝴蝶兰花部组织的石蜡切片通过上述制备方法制备。
具体地，所述的应用包括但不限于在研究蝴蝶兰花部组织细胞形态中的应用、在研究蝴蝶兰花部组织相关的病理学中的应用。
具体地，所述的应用包括但不限于在蝴蝶兰品种培育中的应用。
本发明提供的制片方法较为简短，相比很多传统石蜡制片法，很多溶液梯度被省略(例如在浸蜡前未如传统石蜡中增加一定比例的石蜡：二甲苯的梯度缓冲溶液)，但从结果来说细胞形态的观察依旧不错，总体上节约了时间。本发明提供的方法制得的蝴蝶兰花部组织石蜡切片能够通过切片的颜色区分木质化部分和未木质化部分：木质化细胞呈蓝绿色，其他细胞呈蓝紫色。
附图说明
图1为蝴蝶兰花瓣组织石蜡切片显微结构图。其中A为实验材料选区部位图，B为100倍镜下显微结构图，C为200倍镜下显微结构图，D为400倍镜下显微结构图。
图2为蝴蝶兰柔软幼嫩的花梗芽组织(未木质化花梗)石蜡切片显微结构图。其中A为实验材料选区部位图，B为100倍镜下显微结构图，C为200倍镜下显微结构图，D为400倍镜下显微结构图。
图3为已木质化的花梗芽组织石蜡切片显微结构图。其中A为实验材料选区部位图，B为100倍镜下显微结构图，C为200倍镜下显微结构图，D为400倍镜下显微结构图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1蝴蝶兰花瓣组织石蜡切片的制作
1、固定：将蝴蝶兰花瓣洗净，取新鲜组织到含50％酒精的FAA固定液中进行固定。对固定液进行抽气，直到不再有气泡产生，排除材料中细胞间隙的空气。固定时间24h以上，将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将组织修薄为2-3mm，将修切好的组织放入脱水盒中。
2、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水，酒精梯度与脱水时间依次为：75％酒精4小时-85％酒精2小时-90％酒精2小时-95％酒精1小时-无水乙醇30分钟-无水乙醇30分钟-醇苯5分钟-二甲苯5分钟-二甲苯5分钟。
3、浸蜡：脱水完成后材料在65℃恒温箱中浸入融化石蜡1h，更换三次融化石蜡，每次都为1h。
4、包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
5、切片与展片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚度选择4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，清去多余的蒸馏水，并在60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
6、脱蜡及复水：依次将切片放入二甲苯20分钟后，再浸入二甲苯20分钟，再切换无水乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-75％酒精5分钟，自来水冲洗。
7、甲苯胺蓝染色：切片放入甲苯胺蓝染液约2-5分钟后水洗，镜检，根据组织着色深浅进行适当的分化或者不分化，自来水洗后，将切片置于烤箱内烤干。注意染完后的切片不能长时间放在水里，会出现褪色；植物组织一定要完全烤干后再封片，避免组织残留小水珠。
8、透明封片：切片入干净的二甲苯透明5分钟，使用中性树胶封片。从侧面慢慢移动盖上盖玻片，在恒温箱中32℃烘干或置于室内自然晾干并贴标签。蝴蝶兰花瓣组织切片染色后呈蓝紫色(图1)。
实施例2蝴蝶兰未木质化花梗组织石蜡切片的制作
1、固定：将蝴蝶兰未木质化花梗(幼嫩的花梗)洗净，取新鲜组织到含70％酒精的标准固定液(FAA固定液)中进行固定。对固定液进行抽气，直到不再有气泡产生，排除材料中细胞间隙的空气。固定时间24h以上，将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将组织修薄为2-3mm，将修切好的组织放入脱水盘中。
2、软化：将包埋框用乙二胺软化剂浸没，密封，放入55℃鼓风干燥箱中，进行软化。软化剂更换周期为7天换一次，每周观察一次软化程度，软化时间为14天左右。
3、脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水，梯度酒精浓度和脱水时间分别为：60％酒精4小时-65％酒精4小时-70％酒精3小时-75％酒精3小时-80％酒精3小时-85％酒精3小时-90％酒精2小时-95％酒精2小时-无水乙醇1小时-无水乙醇1小时-醇苯10分钟-二甲苯10分钟-二甲苯10分钟。
后续步骤参考实施例1步骤3-8。蝴蝶兰未木质化组织切片染色后呈蓝紫色(图2)。
实施例3蝴蝶兰已木质化花梗组织石蜡切片的制作
参考实施例2，其中步骤2的软化时间为30天左右。
蝴蝶兰已木质化花梗组织切片染色后呈蓝绿色(图3)，能够明显地与花瓣组织和未木质化的花梗组织区分开来。
Claims (10)
1.一种优化的蝴蝶兰不同花部组织石蜡切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)固定：使用含不同浓度的酒精的FAA固定液对蝴蝶兰花的不同部位进行固定；
(2)脱水：将不同的花部组织采用依次梯度酒精进行脱水；
(3)浸蜡：脱水完成后材料在恒温箱中浸入融化石蜡1h，更换三次融化石蜡，每次浸入1h；
(4)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，蜡凝固后修整蜡块；
(5)切片与展片：切片后漂浮于摊片机温水上将组织展平，烤片；
(6)脱蜡与复水：依次将切片放入脱蜡剂20分钟后，更换脱蜡剂再脱蜡20分钟，再切换无水乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-75％酒精5分钟，自来水冲洗；
(7)甲苯胺蓝染色，镜检，根据组织着色深浅进行适当的分化，烤干；
(8)透明封片：二甲苯透明5分钟，使用中性树胶封片，烘干。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤(1)中的FAA固定液分别含50％和70％体积比的酒精；其中含50％体积比酒精的FAA用来固定未木质化组织，如花瓣；含70％体积比酒精的FAA用来固定木质化组织，如花梗。
3.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，当组织为木质化组织时，在所述步骤(1)固定和步骤(2)脱水之间增加软化步骤。
4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中对应蝴蝶兰花瓣组织的梯度酒精脱水方法为：75％酒精4小时-85％酒精2小时-90％酒精2小时-95％酒精1小时-无水乙醇30分钟-无水乙醇30分钟-醇苯5分钟-二甲苯5分钟-二甲苯5分钟；对应花梗组织的脱水方法为60％酒精4小时-65％酒精4小时-70％酒精3小时-75％酒精3小时-80％酒精3小时-85％酒精3小时-90％酒精2小时-95％酒精2小时-无水乙醇1小时-无水乙醇1小时-醇苯10分钟-二甲苯10分钟-二甲苯10分钟。
5.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述的含50％体积比酒精的FAA固定液的组成为38％甲醛5mL:冰醋酸5mL:50％酒精90mL；所述的含70％体积比酒精的FAA固定液的组成为38％甲醛5mL:冰醋酸5mL:70％酒精90mL。
6.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，所述的软化步骤为：将包埋框放入容器，倒入软化剂，放入55℃鼓风干燥箱中，进行软化；软化剂更换周期为7天，每周观察一次软化程度；当用拇指和食指轻轻按压组织时，组织按压得动且有弹性时，即软化完成。
7.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，所述的软化剂为乙二胺水溶液软化剂、甘油-乙醇软化剂、纤维素乙酸酯、福尔马林-乙酸-乙醇软化剂中的一种；优选为浓度为4％的乙二胺水溶液。
8.根据权利要求3所述的制作方法，其特征在于，木质化程度高的花梗的软化时间为木质化程度低的花梗芽的1.5-2.5倍；木质化程度低的花梗芽的软化时间为12-16天，木质化程度高的花梗的软化时间为28-32天。
9.一种蝴蝶兰花部组织的石蜡切片，其特征在于，所述的石蜡切片由权利要求1-8所述的制作方法制备。
10.权利要求9所述的石蜡切片在蝴蝶兰花部组织器官和细胞观察、研究蝴蝶兰花部组织相关的病理学和蝴蝶兰品种培育中的应用。
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