CN108332989B - 一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，属于高淀粉含量谷物籽粒剖析技术领域。包括固定、漂洗、脱水、包埋、渗透、切片、取片、成像前处理、染色、观察等步骤，操作简单、效率高、组织形态保持完整，内部组分区分度高，可观察到紧实的谷物籽粒的内部结构，适用于高淀粉含量谷物籽粒内部结构剖析，尤其适用于收获后水分含量较低、结构紧实、籽粒坚硬的谷物。

Description

一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法

技术领域

本发明涉及一种高淀粉含量谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，属于高淀粉含量谷物籽粒剖析技术领域。

背景技术

切片技术是动、植物样本进行内部显微结构观察的常用手段。对于动物组织样本进行切片、染色为开展病理学、免疫组化及原位杂交等方面研究提供了技术保障。此外，随着植物生态学和育种技术的不断发展，切片技术广泛的应用于植物育种、鉴别及植物形态建立的研究，成为植物科学研究领域的重要手段，因此，组织切片品质的优良对动、植物组织化学的研究具有重要的意义。

谷物是地球上最主要的粮食作物，目前有关切片技术在谷物方面的应用主要集中在遗传育种、栽培及环境、生理生化等方面且取得了巨大的进展，但对于指导谷物的加工及品质判定贡献较少。随着人们对谷物研究的不断深入，籽粒内部的结构与谷物的品质特性之间的相关性成为研究重点。谷物籽粒的发育通常需经历生长期、灌浆初期，乳熟期，蜡熟期和完熟期，随着谷物的发育，籽粒中的主要贮藏物质淀粉和蛋白质组间不断进行积累，胚乳由液态逐渐发育成质地紧密的固态。常规的谷物组织分析主要基于灌浆早期的籽粒切片，由于初期籽粒水分含量高，质地松软，有利于固定液及包埋液的渗透，因而比较容易切片。但随着籽粒的进一步发育，籽粒内部水分将会逐渐减少，淀粉体、蛋白体不断积累并紧密的充实在籽粒内部，使得固定剂、包埋剂很难渗透。同时，因籽粒内部较高含量的淀粉，使得籽粒在较长的脱水过程中粘结性下降，坚硬易碎。同时，籽粒内部因组分分布十分致密，常规的组织染色方法很难将不同组分有效的区分开。因此，一直难以实现高淀粉含量成熟籽粒内部结构的剖析。

目前较为常用的切片方法是石蜡切片法及树脂切片法。Ogawa等人报道了大米颖果石蜡切片的方法，但所述方法步骤较多，且组分间区分度不高。专利CN105547793A公布了一种玉米成熟种子的石蜡切片方法，专利CN104374601A公布了一种谷物成熟种子树脂切片的方法，本方法也以石蜡作为包埋剂切片，但与传统的石蜡切片法有很大的不同：传统切片法所用石蜡一般融化温度在60-70℃之间，且固定、包埋、渗透、烘片均在较高的温度下，而对于高淀粉含量谷物籽粒来说，较高的温度会使淀粉糊化，从而影响谷物籽粒的原始结构。另一方面，传统切片法主要基于水分含量较高的植物组织，如Liuqiaoquan等人报道了颖果的切片方法，因而固定及渗透时间均较长，而对于成熟且粉体含量较高的样品，较长的固定及后处理时间会使得样品十分坚硬，且易破裂，切片时易碎，尤其是在较长的梯度酒精脱水过程中，因此，很难获得完整的籽粒截面。树脂切片法因树脂渗透性佳的特点近年来开始应用于籽粒的结构分析，但是因树脂成本较高，且同样存在切片易碎、处理温度高、周期长、干扰荧光观测等缺点而受到了限制。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种高淀粉含量成熟谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，不仅缩短了制片的时间、有效的保存了籽粒内部组分的原始结构、提高了切片效率，还通过干法展片及不同染色方法实现了区分度较高的结构剖析。可运用于高淀粉谷物籽粒内部结构的剖析，进而指导谷物的加工及控制。

本发明的第一个目的是提供一种高淀粉含量成熟谷物籽粒的预处理方法，所述方法包括水分平衡、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片和展片；所述水分平衡是将谷物籽粒的水分调节至14～20％；所述脱水，是将固定后的籽粒干燥至水分含量为5％以下；所述浸蜡是在30～50℃环境下进行。

在本发明的一种实施方式中，所述谷物包括玉米、小麦、大麦、藜麦、大米、小米、绿豆、红豆、大豆等淀粉含量在40％以上的谷物。

在本发明的一种实施方式中，所述浸蜡过程是将脱水后的籽粒在石蜡中预浸1～30min后转移至另一份石蜡中渗透30～120min。

在本发明的一种实施方式中，所述脱水是将多余的固定液吸取后，浸泡在液氮中1～10min，再真空干燥40～60min。

在本发明的一种实施方式中，所述固定是浸泡于固定液中，置于真空环境中30～120min；所述真空环境的真空度控制在0.01MPa-0.1MPa。

在本发明的一种实施方式中，所述固定采用福尔马林、多聚甲醛、戊二醛或冰醋酸中的一种或多种固定液的共混液进行固定；

在本发明的一种实施方式中，所述水分平衡是在30～50℃，湿度60-100RH％的环境下进行水分调节。

在本发明的一种实施方式中，所述切片采用超薄切片机、冷冻切片机或石蜡切片机进行切片。

在本发明的一种实施方式中，所需的切片厚度为1～5μm时选用超薄切片机，切片厚度为5～10μm时选用冷冻切片机，切片厚度为10～50μm时选用石蜡切片机。

在本发明的一种实施方式中，所述展片是用表面涂有聚合黏胶的载玻片将样品平展的粘附于载玻片上。

在本发明的一种实施方式中，所述聚合黏胶的主要成分为聚丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮或阿拉伯胶中的一种或多种胶体的复合物，浓度为0.01～1g/mL，将载玻片浸入黏胶中晾干，或将黏胶薄层涂抹于载物台表面。

在本发明的一种实施方式中，所述染色包括碘染或荧光染色。

在本发明的一种实施方式中，所述碘染具体为：取碘/碘化钾溶液(按体积分数计，1％)与丙三醇以1:1混合均匀，将染料滴于样品截面上，避光染色30min，随后用去离子水冲去多余染料，反复3次，盖上盖玻片，放置于显微镜上进行结构观察及偏光分析。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光染色具体为：分别采用浓度为0.001-1g/mL的罗丹明、甲基红、尼罗红、异硫氰酸荧光素或甲基橙染料，按照蛋白质、脂肪、淀粉的顺序进行染色；其中，蛋白质采用罗丹明或甲基红染色；脂肪采用尼罗红染色；淀粉采用异硫氰酸荧光素或甲基橙染色；每种染料染色后均用30～50％的乙醇反复冲洗2～3次，染色、洗涤过程中避光处理。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光染色具体为：采用浓度为0.001-1g/mL的复配染液进行染色，所述复配染液含有罗丹明、甲基红、尼罗红、异硫氰酸荧光素或甲基橙中的至少两种；用于淀粉和蛋白质染色时，淀粉染料的浓度控制在比蛋白质染料浓度高5-20倍；用于淀粉和脂肪染色时，淀粉染料的浓度控制在比脂肪染料浓度高2-10倍；用于脂肪与蛋白质染色时，脂肪染料的浓度高于蛋白质染料浓度的2-10倍；所述淀粉染料含有异硫氰酸荧光素(FITC)或甲基红；所述脂肪染料含有尼罗红；所述蛋白质染料含有罗丹明或甲基红；染色后用30～50％的乙醇反复冲洗2～3次，染色、洗涤过程中避光处理。

在本发明的一种实施方式中，所述荧光染色具体为：分别称取异硫氰酸荧光素(FITC)、甲基红、甲基橙、尼罗红、罗丹明染料溶于丙酮中，配制出浓度为0.001-1g/mL的染料，其中FITC、甲基橙用于染色淀粉，尼罗红用于染色脂肪，甲基红、罗丹明用于蛋白质的染色；染色后淀粉产绿色荧光，蛋白质产红色荧光，脂肪显橙色荧光；为了同时观察不同组分的分布，可将配制好的染料进行复配；其中，观察淀粉与蛋白质时，淀粉染料的浓度控制在比蛋白质染料浓度高5-20倍，观察淀粉与脂肪时，淀粉染料的浓度控制在比脂肪染料浓度高2-10倍，而观察脂肪与蛋白质时，脂肪染料浓度需高于蛋白浓度2-10倍，与此同时，染色顺序依次为蛋白质、脂肪、淀粉，每种染料染色后均用50％的乙醇反复冲洗3次，操作过程中避光处理，荧光染色主要通过激光共聚焦显微镜、荧光显微镜进行观察。

本发明的第二个目的是提供一种高淀粉含量成熟谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，所述方法是先将高淀粉含量成熟谷物籽粒采用所述预处理方法进行预处理，再进行观察。

在本发明的一种实施方式中，所述观察包括但不限于在光学显微镜、激光共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：

(1)取样：从收获的谷物中挑选颗粒饱满的完全籽粒，进行脱壳、去皮处理；

(2)水分平衡：将获取的籽粒放置于密闭的容器中，进行过湿度调节；使得籽粒水分保持在14-20％；

(3)固定：将平衡后籽粒取出，浸泡于复配固定液中，抽真空，负压30-120min；

(4)脱水：取固定后籽粒，吸去多余固定液，浸泡于液氮中1-10min，随后真空干燥60min；

(5)浸蜡：融化一定量的石蜡，分成两份，将脱水后籽粒在其中一份中预浸1-30min后取出放置于另一份石蜡中渗透30min-120min，浸蜡均在30-50℃环境下进行；

(6)包埋：取浸蜡后的籽粒放置于模具中，同时倒入融化后的石蜡，平衡30-60min；

(7)切片：将包埋后模具放于低温平台上固化石蜡，随后使用切片机切片，并根据具体测定需求控制籽粒厚度，连续切片至连续截面出现；

(8)展片：镊取连续样品切片面，用表面涂有聚合黏胶、贴有专用胶带的载玻片、载物台及进行捞片，样品平展的粘附于载玻片及载物台上；

(9)脱蜡：将载有籽粒截面的载玻片放置于烘箱中，常温吹干，随后用脱蜡剂脱蜡；

(10)样品观察：将固定在载物台上样品进行SEM、TEM、自发荧光预处理，进行对应的显微观察；

(11)染色观察：根据所需观察目的进行样品处理，同时根据不同观察目的及组分热性进行染色处理。

本发明还提供所述方法在食品领域的应用，如谷物垩白、硬质度的判定，谷物加工品质、产品品质预测。

本发明有益的技术效果在于：

本发明对传统的石蜡切片法进行了改进，建立了适用于多种谷物成熟籽粒的切片及观察方法。通过对籽粒进行水分调节，降低了籽粒在固定过程中的破碎率；通过不同固定液的复配最大程度保持了籽粒的组织结构，改善了籽粒的切片品质；建立了高淀粉、低水分籽粒特有的冻干脱水的方法，缩短了脱水时间，提高了切片效率；通过不同的切片方法及干法展片实现了不同籽粒结构内部结构的观察；通过特殊的荧光染色方式，提高了组分间的区分度。另外，本发明为高淀粉含量成熟谷物籽粒提供了新的分析手段，操作简便，成本低，同时为指导谷物加工及品质控制提供保障，有助于推动我国粮食工业的发展。

附图说明

图1为所制得大米切片的整体截面图；

图2为扫描电子显微镜下大米颗粒切片截面图；

图3为光学显微镜下经碘液染色后的大米颗粒内部淀粉分布图；

图4为共聚焦激光扫描显微镜下荧光染色后的大米颗粒内部不同组分分布图；

图5为对照例1所得切片整体截面图；

图6为对照例2所得切片扫描电镜截面图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

具体实施方式如下：

(1)取样：从收获的谷物中挑选颗粒饱满的完全籽粒，进行脱壳、去皮处理；

(2)水分平衡：将获取的籽粒放置于密闭的容器中，进行过湿度调节；使得籽粒水分保持在16％；

(3)固定：将平衡后籽粒取出，浸泡于福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、冰醋酸(体积比为1:1:1:1的纯溶液)固定液中，抽真空，0.5MPa负压30min；

(4)脱水：取固定后籽粒，吸去多余固定液，浸泡于液氮中1min，随后真空干燥1h；

(5)浸蜡：融化一定量的石蜡，分成两份，将脱水后籽粒在其中一份中预浸30min后取出放置于另一份石蜡中渗透30min，浸蜡均在40℃环境下进行；

(6)包埋：取浸蜡后的籽粒放置于模具中，同时倒入融化后的石蜡，平衡1h；

(7)切片：将包埋后模具放于低温平台上固化石蜡，随后使用切片机切片，并根据具体测定需求控制籽粒厚度，连续切片至连续截面出现；

(8)展片：镊取连续样品切片面，用表面涂有聚合黏胶、贴有专用胶带的载玻片、载物台及进行捞片，样品平展的粘附于载玻片及载物台上；

(8)脱蜡：将载有籽粒截面的载玻片放置于烘箱中，常温吹干，随后用脱蜡剂脱蜡；

(9)样品观察：将固定在载物台上样品进行SEM、TEM、自发荧光预处理，进行对应的显微观察；

(10)染色观察：根据观察目的进行样品处理，同时根据不同观察目的及组分热性进行荧光染色处理。

图1为所制得切片的截面图，由图可知：该方法能获得完整的完全成熟大米的籽粒结构，内部结构完整，无碎片，形态保持较佳；

图2为所制得切片的SEM图，该方法制得切片能完整观察籽粒内部的结构的分布情况；

图3为所制得切片的LM图，由图可知：该方法所制得切片能以碘染的方式观察淀粉的分布情况，淀粉粒和淀粉体区分度高；

图4为所得切片的CLSM图，由图可知：通过所制得切片能以荧光染色的方式观察细胞结构及不同组分的分布情况，左图为淀粉体的荧光染色图，中图为蛋白质的荧光染色图，而右图为淀粉、蛋白质的复合染色图，由图可知，淀粉体成多角形紧密分布，而蛋白体小于淀粉体松散的分散于淀粉体周围，复合图中淀粉和蛋白呈现不同颜色的荧光，淀粉体和蛋白体能够清晰的区分开，细胞结构荧光明显。

对照例1

具体实施方式同实施例1，区别在于采用一种固定液固定的方法，所用固定液为戊二醛，浸蜡温度为70℃，图5为所得切片图，切片结构易碎，不能获得完整的籽粒结构，同时籽粒内部淀粉结构遭到破坏。

对照例2

具体实施方式同实施例1，区别在于，将谷物籽粒的水分调节至小于5％，固定液为福尔马林，所用脱水方式为酒精脱水的方式，图6为所得SEM截面图，由图可知所得截面已失去原有籽粒形态，内部结构模糊，有不同程度爆裂纹呈现，表面结构粗糙，不能反映籽粒内部的原始结构。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高淀粉含量成熟谷物籽粒的预处理方法，其特征在于，所述方法包括水分平衡、固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、展片和荧光染色；所述水分平衡是将谷物籽粒的水分调节至16%；所述固定，是将平衡后的谷物籽粒浸泡于体积比为1:1:1:1的福尔马林、多聚甲醛、戊二醛、冰醋酸固定液中，抽真空，0.5MPa负压30min；所述脱水，是将固定后的籽粒干燥至水分含量为5%以下；所述浸蜡是在40℃环境下进行；所述浸蜡是将脱水后的籽粒在石蜡中预浸1~30 min后转移至另一份石蜡中渗透30~120 min；所述脱水是将多余的固定液吸取后，浸泡在液氮中1~10 min，再真空干燥40~60 min；所述水分平衡是在30~50℃，湿度60-100RH%的环境下进行水分调节；

荧光染色步骤为（a）或（b）：

（a）分别采用浓度为0.001-1g/mL的罗丹明、甲基红、尼罗红、异硫氰酸荧光素或甲基橙染料，按照蛋白质、脂肪、淀粉的顺序进行染色；其中，蛋白质采用罗丹明或甲基红染色；脂肪采用尼罗红染色；淀粉采用异硫氰酸荧光素或甲基橙染色；每种染料染色后均用30~50%的乙醇反复冲洗2~3次，染色、洗涤过程中避光处理；

（b）采用浓度为0.001-1g/mL的复配染液进行染色，所述复配染液含有罗丹明、甲基红、尼罗红、异硫氰酸荧光素、甲基橙中的至少两种；用于淀粉和蛋白质染色时，淀粉染料的浓度控制在比蛋白质染料浓度高5-20倍；用于淀粉和脂肪染色时，淀粉染料的浓度控制在比脂肪染料浓度高2-10倍；用于脂肪与蛋白质染色时，脂肪染料的浓度高于蛋白质染料浓度的2-10倍；所述淀粉染料含有异硫氰酸荧光素或甲基橙；所述脂肪染料含有尼罗红；所述蛋白质染料含有罗丹明或甲基红；染色后用30~50%的乙醇反复冲洗2~3次，染色、洗涤过程中避光处理。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述谷物包括玉米、小麦、大麦、藜麦、大米、小米、绿豆、红豆或大豆。

3.一种高淀粉含量成熟谷物籽粒剖析及内部结构观察的方法，其特征在于，应用权利要求1或2所述的方法进行预处理，再进行观察。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述观察在光学显微镜下观察。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述观察在激光共聚焦显微镜或荧光显微镜下观察。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：

（1）取样：从收获的谷物中挑选颗粒饱满的完全籽粒，进行脱壳、去皮处理；

（2）水分平衡：将获取的籽粒放置于密闭的容器中，进行湿度调节；使得籽粒水分保持在16%；

（3）固定：将平衡后籽粒取出，浸泡于复配固定液中，抽真空，负压30min；

（4）脱水：取固定后籽粒，吸去多余固定液，浸泡于液氮中1-10min，随后真空干燥60min；

（5）浸蜡：融化一定量的石蜡，分成两份，将脱水后籽粒在其中一份中预浸1-30min后取出放置于另一份石蜡中渗透30min-120min，浸蜡均在40℃环境下进行；

（6）包埋：取浸蜡后的籽粒放置于模具中，同时倒入融化后的石蜡，平衡30-60min；

（7）切片：将包埋后模具放于低温平台上固化石蜡，随后使用切片机切片，并根据具体测定需求控制籽粒厚度，连续切片至连续截面出现；

（8）展片：捞取步骤（7）的切片，镊取连续样品切片面平展的粘附于表面涂有聚合黏胶或贴有专用胶带的载玻片上，将载玻片置于载物台上；

（9）脱蜡：将载有籽粒截面的载玻片放置于烘箱中，常温吹干，随后用脱蜡剂脱蜡；

（10）样品观察：将固定在载物台上样品进行SEM、TEM、自发荧光预处理，进行对应的显微观察；

（11）染色观察：根据所需观察目的进行样品处理，并根据不同观察目的及组分特性进行染色处理。

7.权利要求1~6任一所述方法在食品领域的应用。

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