CN107702966A - 一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，该方法在常规石蜡切片技术上，对染色、横切切片角度和脱蜡等步骤进行了改进。采用爱利氏苏木精染液进行植物组织的染色，将传统的脱蜡后染色改为脱蜡前整体染色。切片角度采用横切，切片厚度为5‑10μm。本发明还改进了脱蜡方式，采用TO型生物制片透明剂代替二甲苯进行脱蜡。本发明空心菜根结巨型细胞石蜡切片的制作方法，明显提高了空心菜根结石蜡切片的染色效果，提高工作效率，保证了空心菜巨型细胞石蜡切片的效果。
Description
技术领域
本发明涉及石蜡切片的制作方法，具体涉及一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法。
背景技术
根结线虫是农业生产上严重的农作物线虫病害，给全世界的蔬菜、果树和粮食作物生产带来巨大的经济损失。根结线虫侵染寄主植物细胞，植物本身会发生复杂多变的病生理变化，根结中诱导产生多个巨型细胞。
目前对根结线虫的防治主要采用传统的方法，防治较为困难。随着分子生物学的日趋成熟，通过分子生物学技术深入研究根结线虫与其寄主植物巨型细胞的分子互作机理，培育新型的转基因抗线虫作物，从根本上切断根结线虫的侵染途径，从而对根结线虫进行防治成为努力方向，因此揭示巨型细胞的发育过程至关重要。
观察巨型细胞的发育过程常常需要用到石蜡切片。一张质量优良的切片必须具备完整、组织面平整、厚薄适当、染色清晰和反差强的特点。石蜡切片沿用多年，已经形成较为成熟的操作步骤，但在制作石蜡切片时，也会遇到脱片、切片碎裂、蜡带不连续、切片褶皱、染色效果不佳、模糊不清及细胞结构染色对比不明显等现象，极其影响后期观察。
石蜡切片中每一环节都具相关性，环环相扣，制作出优质切片，每一步都至关重要，任何一个环节操作不规范，都有可能影响最终的片子质量。影响片子质量的的因素有很多，不仅受组织本身特性的影响，还受标本的取材、组织块固定、脱水、包埋、浸蜡、切片、染色等因素的影响，因此需要针对每种材料的特点，建立适合的石蜡切片技术。
空心菜是一种理想的根结线虫寄主植物，空心菜接种南方根结线虫后，生长周期可超过6个月；因此可以利用空心菜研究根结线虫的重复侵染机理。而研究重复侵染机理，需要借助石蜡切片技术，观察空心菜根结巨型细胞的发育过程。
虽然植物组织石蜡切片的基本步骤相同，但是由于植物组织的具体特点不同，针对一种特定植物组织，需要建立具体的石蜡切片技术。到目前为止，尚未见空心菜根结巨型细胞石蜡切片技术的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，该方法在常规石蜡切片技术上，针对空心菜材料的组织特点和根结巨型细胞的发育特点，对染色、横切切片角度和脱蜡等步骤进行了摸索和改进，提供了适合于观察巨型细胞发育过程的石蜡切片制作方法，同时克服了脱蜡剂对制作人员的毒害、根结内巨型细胞细胞核不清楚、切片内难以同时获得根结线虫和巨型细胞等缺点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，包括以下步骤：
(1)抽真空和固定
将空心菜根结切成0.5-1cm的小段材料；把FAA固定液和材料放入注射器，推动抽筒排尽空气，然后手指按住针头插孔，另一只手推拔抽筒若干次，将材料内的空气抽出；然后材料置于FAA固定液中固定24h以上，至材料下沉为止；
步骤(1)所述的固定，固定期间更换一次固定液，以保证固定液维持一定的浓度；
(2)染色
将材料清洗干净，接着把材料置于2％丙酸溶液中浸泡48h以上，然后转移至爱利氏苏木精染液中浸泡4d以上，最后将材料清洗干净；
步骤(2)所述的将材料清洗干净，是先用流水冲洗24h以上，再用蒸馏水浸洗1h以上；
所述的流水冲洗，是将材料置于两端开口的指形筒中，两端分别盖上尼龙网，扎紧，放在自来水下流水冲洗；这样既方便冲洗，也避免了手或其他部件对材料的污染；
(3)脱水
将材料置于体积浓度由低到高的若干乙醇溶液中逐级脱水1.5h以上，然后在无水乙醇中脱水1h以上，并重复一次上述操作；
步骤(3)所述的若干乙醇溶液优选体积浓度分别为15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇溶液；
步骤(3)的操作完成后，材料可在70％(体积浓度)乙醇溶液中脱水过夜；
(4)5级氯仿透明
将材料放入标有等距5分格标记的瓶中，并加入无水乙醇至5格处，透明处理0.5h以上；然后逐级换入氯仿，即每次吸出1格溶液，加入1格氯仿，透明处理0.5h以上；最后一级全部吸出，再加入氯仿至2.5格处；若材料放入乙醇氯仿后溶液出现浑浊，则表示材料脱水不彻底，应重新脱水；
(5)浸蜡
标有等距5分格标记的瓶中余下的一半位置分多次加入石蜡，每次加蜡相隔1h以上，然后将瓶移至38-40℃恒温培养浸蜡2d以上；接着将材料移入浸蜡盒中，加入50％体积的纯蜡和50％体积的二甲苯，40-42℃恒温培养45min以上；再换入75％体积的纯蜡和25％体积的二甲苯，46-48℃恒温培养45min以上；最后换入纯蜡54-58℃恒温培养3h以上，期间换蜡两次以上；
步骤(5)所述的分多次加入石蜡，优选分3次加入石蜡，即分别加到3.5格刻度、4.5格刻度、加满；
(6)包埋
将包埋机中的纯蜡熔化后倒入包埋模具内，将材料从浸蜡盒中取出放在包埋模具中央的蜡液里，各个材料之间应有一定的距离以便于后面的修块，然后将包埋模具移至4℃冷冻台上使其迅速冷却凝固，最后卸下蜡块；包埋剂应尽量装满，使蜡块表面平整，以利于后续切片；
(7)蜡块修整
将蜡块修整成长方形六面体，六面均不使材料暴露，且六面的蜡面平整、四边平行，材料四周要留下部分石蜡；接着用温热的金属小蜡铲将蜡块底部固着在台木正中，在蜡块基部的周围再添加一些熔化了的石蜡，用小刀将材料前后左右1-2mm以外的蜡修去；
(8)切片
将修好的蜡块及台木固定在切片机上，调整刀锋的位置以及切片的厚度，使材料的切面与切片刀口及空心菜根结中柱线三者平行，并尽可能将蜡块对着刀片的中间而使用力均匀稳固，控制切片速度，避免由于连续旋转摩擦生热使切下的蜡片黏成蜡带；切片角度采用横切，切片厚度为5-10μm；切出的切片用毛笔或镊子轻轻挑起，放置在纸板上，以备贴片；
切片时，动作要缓慢，以免力气过大使蜡碎裂，切出的片以直直地连在一起，皱褶少为佳；另外切片的速度太快也容易起皱褶；
步骤(8)所述的切片机优选LEICA RM 2235型手动轮转式切片机；
(9)贴片
贴片前在载玻片上涂抹明胶黏贴剂，然后将切下的蜡带(即连片的切片)放入温度为38-40℃的恒温水浴锅中展片，放入水中时应将蜡带光滑的一面朝下，且动作要缓慢以免产生气泡，再用引流法将蜡带引至载玻片上，使蜡带光滑的一面紧贴载玻片，调整蜡带的位置；
步骤(9)所述的明胶黏贴剂，优选每张载玻片上涂抹10μL，过少会导致掉片，过多则会使脱蜡困难；
(10)拷片、脱蜡和封片
将贴好的片子烘干，然后将片子放入装有TO型生物制片透明剂的染缸中脱蜡10min以上，换掉透明剂后再浸泡10min以上，重复若干次；晾干后，取中性树胶滴在材料上，再将盖玻片倾斜放下封片，制得空心菜根结巨型细胞石蜡切片；
步骤(10)所述的将片子烘干优选在组织摊片机上、38-40℃下烘烤30min以上。
在进行植物根结巨型细胞石蜡切片时，所采用的染色技术和切片角度，是决定切片效果的关键因素。本发明在研究各项参数的基础上，经过探索和筛选，确定了最佳染色技术和切片角度，提高了切片效率，保证了切片质量。
染色是利用染料在组织切片上给与颜色，使组织细胞的各种微细结构在显微镜下能显现不同颜色，便于观察。传统的石蜡切片染色是在脱蜡步骤完成之后，材料首先经过浓度由高至低的酒精梯度来完成复水过程，以便材料染色，染色之后又经过浓度由低至高的酒精梯度来完成脱水过程，最后再经过两次二甲苯透明，材料中的酒精完全被二甲苯置换后才能进行封片处理。由于传统染色程序繁多，多次冲洗对组织结构的完整性造成损伤，甚至产生整体脱片现象，严重影响实验结结果，所以对染色方法的改进很有必要。本发明结合空心菜根结组织幼嫩、含水量高的特点，采用爱利氏苏木精染液进行植物组织的染色，将传统的脱蜡后染色改为脱蜡前整体染色，即样品经过固定冲洗后先用2％丙酸进行48h以上媒染，以便于苏木精染液的渗透，然后将材料移至爱利氏苏木精染液中浸泡4d以上，最后流水冲洗返蓝完成染色。结果显示此改良方法得到的组织结构，比传统石蜡切片更完整，染色的效果比传统石蜡切片更清晰且对比明显，细胞核着色良好。因此，最终采用爱利氏苏木精进行整体染色。
切片角度一般分为横切与纵切两种，角度的选择关系到能否切到理想的片子。若要观察根结线虫侵染寄主植物后不同侵染天数的巨型细胞与根结线虫的组织病理结构，那么切片角度的选择至关重要。本发明首先采用横切和纵切两种方式对侵染后期的空心菜根结进行石蜡切片，结果显示横切根结得到的片子中呈现出梨形的根结线虫且结构完整，巨型细胞分布在根结线虫头部附近，而纵切根结得到的片子中没有梨形的根结线虫和巨型细胞出现，因此，本发明最终采用横切的方式进行巨型细胞和根结线虫的组织病理结构观察，同时TUNEL实验、免疫荧光定位实验和基因沉默效果检测所用切片也采用横切方式。
在病理技术工作中，石蜡切片无论是进行常规染色或是其他特殊染色，首先都要对切片进行脱蜡，特别是在免疫组化的染色过程中，人们常把脱蜡不彻底作为免疫组化染色失败的原因之一。切片脱蜡的好坏主要取决于脱蜡剂的新旧、温度及时间。常规脱蜡方式中二甲苯脱蜡3次，每次10min，将浸泡在二甲苯中的切片取出置于无水酒精中，涮洗几次后发现粘有组织的部分呈云雾状，组织轮廓不清，表明脱蜡不彻底。虽然二甲苯作为传统的透明脱蜡溶剂广泛应用于常规石蜡制片中，但二甲苯是一种毒害性较大的试剂，会对操作人员会造成伤害，因此本研究改进了脱蜡方式，采用TO代替二甲苯进行脱蜡。TO成分为优质松节油，主要用于石蜡切片的脱蜡，与二甲苯具备同样的功能。首先在脱蜡前将石蜡切片入38-40℃恒温烘箱或组织摊片机中烘烤30min以上，然后浸入TO中脱蜡若干次，每次10min以上，最后将浸泡在TO中的切片取出置于无水酒精中，涮洗几次后发现切片上除组织外原来粘有蜡带的位置已同玻片其他位置一样透明，说明已彻底脱蜡。有时在操作过程中如捞片或烤片过程中污染上杂质而看到切片上除组织外周围有点状物而被认为是没脱净的蜡膜，此种情况要仔细加以辨别，以免被其影响而认为脱蜡不彻底。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明空心菜根结巨型细胞石蜡切片的制作方法，明显提高了空心菜根结石蜡切片的染色效果，提高工作效率，保证了空心菜巨型细胞石蜡切片的效果。
附图说明
图1是不同染色方法下空心菜根结巨型细胞石蜡切片的染色效果图；A-本发明整体染色下的染色效果图；B-现有技术脱蜡后染色方法下的染色效果图；
图2是不同切片角度下空心菜根结巨型细胞石蜡切片的染色效果图；A-本发明横切下的染色效果图；B-纵切下的染色效果图；
CN-细胞核；CW-细胞壁；GC-巨型细胞；RKN-根结线虫。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，包括以下步骤：
(1)取材
将收集到的根结切成0.5-1cm的小段；
(2)抽真空
根据材料大小配不同大小的注射器针筒。首先将抽筒提出，左手拿针筒且食指按住针头插孔，其次将FAA固定液和材料倒入，插入针筒并倒转针筒使针头插孔朝上，然后移去食指将抽筒推入直到固定液开始从针头孔冒出为止，此时筒内只有固定液和材料而无其他空隙，最后再用食指按住针头插孔，右手拔抽筒，连续2-3次，材料内空气即被抽出；
(3)固定
将材料放入装有FAA固定液的固定瓶中固定24h以上，一般固定液的用量为固定材料总体积的20倍，材料下沉说明其内部空气已被抽出固定液已渗透材料，期间更换一次固定液以保证固定液维持一定的浓度；
(4)冲洗
首先将两端开口的指形筒的其中一端盖上尼龙网，用橡皮筋捆扎，放入冲洗材料，然后将另一端同法封上并放在自来水下流水冲洗24h。最后用蒸馏水浸洗1h；
(5)媒染
将材料在2％丙酸溶液中浸泡48h；
(6)染色
将材料转移至爱利氏苏木精染液中浸泡4d；
(7)再冲洗
先在自来水下流水冲洗24h，最后用蒸馏水浸洗1h；
(8)脱水
15％、30％、50％、70％、85％、95％乙醇每级脱水1.5h，无水乙醇脱水1h并重复一次。必要时可在70％乙醇中停留过夜；
(9)透明
脱水后透明利于包埋剂的渗入，采用5级氯仿透明，每级停留0.5h。材料脱水至无水乙醇后转入标有等距5分格标记的小指形瓶中，并浸于无水乙醇至5格处，后逐级换入氯仿，即各次吸出1格，加入1格氯仿，最后一级全部吸出，再换一次氯仿至2.5格处。若材料放入酒精氯仿后溶液出现浑浊，则表示材料脱水不彻底，应退回无水乙醇中重新脱水；
(10)浸蜡
此过程石蜡逐渐溶入浸有材料的透明剂中，使石蜡完全代替透明剂进入材料的组织中。透明步骤中加氯仿至2.5格后，余下的一半位置供加石蜡用，共分3次加入碎蜡，至溶液为1/2石蜡，1/2透明剂为止，即按分格刻度2.5格-3.5格-4.5格-5格，每次加蜡相隔1h，加蜡过程在可在38-40℃恒温水浴锅中进行，加蜡后移入38-40℃恒温培养箱中过夜，并继续浸蜡2-3d。然后将材料移至铜网活底的铝片活套浸蜡盒中按50％纯蜡+50％二甲苯，放置42℃恒温培养箱45min、
75％+25％二甲苯，放置48℃恒温培养箱45min、纯蜡A放置58℃恒温培养箱60min、纯蜡B放置58℃恒温培养箱60min、纯蜡C放置58℃恒温培养箱60min的顺序分级浸蜡，此过程在恒温培养箱内进行。
(11)包埋
将包埋机中已经熔化的纯蜡倒入包埋模具内，再用镊子(事先放在40℃预热)将经过浸蜡的组织块从铝片活套浸蜡盒中取出放在包埋模具中央的蜡液里，各个组织之间应有一定的距离以便于后面的修块，然后移至4℃冷冻台上使其迅速冷却凝固，最后卸下组织蜡块；(注意：包埋剂应尽量装满，使蜡块表面平整，以利于后续切片)
(12)蜡块修整
将小蜡块修整成长方形六面体，六面均不使材料暴露，且六面的蜡面均平整，小蜡块四边要平行，材料四周要留下部分石蜡，接着用温热的金属小蜡铲将小蜡块底部固着在台木正中，在小蜡块基部的周围再添加一些熔化了的石蜡，再用小刀将材料前后左右1-2mm以外的蜡修去；
(13)切片
将修好的蜡块黏在小木块上，固定在LEICA RM 2235型手动轮转式切片机上，调整刀锋的位置以及切片的厚度(10μm)，使材料的切面与切片刀口平行，材料的纵横与刀口垂直，并尽可能将蜡块对着刀片的中间而使用力均匀稳固，摇动手柄控制速度，由于连续旋转摩擦生热使切下的蜡片黏成蜡带。切片时，动作要缓慢，以免力气过大使蜡容易碎裂，切出的片以直直的连在一起，皱褶少为佳。另外切片的速度太快也容易起皱褶。切好的切片用毛笔或镊子将连在一起的切片轻轻挑起，放置在纸板上，以备贴片；
(14)贴片
贴片前在干净的载玻片上涂抹稍许明胶黏贴剂，每张载玻片上约10μL，过少会导致掉片，过多则会使脱蜡困难。然后用刀片轻轻切取一定长度的连片，缓慢放入温度为38-40℃的恒温水浴锅中展片，注意放的时候应将蜡带光滑的一面朝下，且动作要缓慢以免产生气泡，再用引流法将蜡带引至载玻片上，使蜡带光滑的一面紧贴载玻片，调整蜡带的位置；
(15)拷片
将贴好的片子置于温度为37-40℃的组织摊片机上烤干蜡带表面水分，至少需要拷片3h。务必干透，以免下一步脱蜡时材料脱落；
(16)脱蜡
将粘有蜡带的载玻片放入装有TO型生物制片透明剂的染缸中脱蜡10min，重复5次至脱蜡干净；
(17)封片
稍微晾干后，取中性树胶少许滴在材料上，再将洁净盖玻片倾斜放下即为封片，制得空心菜根结巨型细胞石蜡切片。
本实施例采用苏木精染色剂进行组织切片的染色，结果表明，整体染色的效果优于脱蜡后染色。整体染色图中整体着色效果良好，巨型细胞、根结线虫及巨型细胞内细胞核清晰可见(见图1-A所示)；而现有技术的脱蜡后染色方法着色效果较差，只能呈现巨型细胞的大致轮廓，而巨型细胞内的细胞核没有显示(见图1-B)。
实施例2
一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，本实施例的方法同实施例1，仅是在步骤(13)，将切片角度采用横切和纵切两种，切片厚度为10μm。
结果表明，横切根结得到的片子中呈现出梨形的根结线虫且结构完整，巨型细胞分布在根结线虫头部附近(见图2-A)；纵切根结得到的片子中没有梨形的根结线虫和巨型细胞出现(见图2-B)。因此，本发明最终采用横切的方式进行巨型细胞和根结线虫的组织病理结构观察。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)抽真空和固定
将空心菜根结切成0.5-1cm的小段材料；把FAA固定液和材料放入注射器，推动抽筒排尽空气，然后手指按住针头插孔，另一只手推拔抽筒若干次，将材料内的空气抽出；然后材料置于FAA固定液中固定24h以上，至材料下沉为止；
(2)染色
将材料清洗干净，置于2％丙酸溶液中浸泡48h以上，然后转移至爱利氏苏木精染液中浸泡4d以上，最后将材料洗净；
(3)脱水
将材料置于体积浓度由低到高的若干乙醇溶液中逐级脱水1.5h以上，然后在无水乙醇中脱水1h以上，并重复一次上述操作；
(4)5级氯仿透明
将材料放入标有等距5分格标记的瓶中，并加入无水乙醇至5格处，透明处理0.5h以上；然后逐级换入氯仿，即每次吸出1格溶液，加入1格氯仿，透明处理0.5h以上；最后一级全部吸出，再加入氯仿至2.5格处；若材料放入乙醇氯仿后溶液出现浑浊，则表示材料脱水不彻底，应重新脱水；
(5)浸蜡
标有等距5分格标记的瓶中余下的一半位置分多次加入石蜡，每次加蜡相隔1h以上，然后将瓶移至38-40℃恒温培养浸蜡2d以上；接着将材料移入浸蜡盒中，加入50％体积的纯蜡和50％体积的二甲苯，40-42℃恒温培养45min以上；再换入75％体积的纯蜡和25％体积的二甲苯，46-48℃恒温培养45min以上；最后换入纯蜡54-58℃恒温培养3h以上，期间换蜡两次以上；
(6)包埋
将包埋机中的纯蜡熔化后倒入包埋模具内，将材料从浸蜡盒中取出放在包埋模具中央的蜡液里，各个材料之间保持距离，然后将包埋模具移至4℃冷冻台上使其迅速冷却凝固，最后卸下蜡块；
(7)蜡块修整
将蜡块修整成长方形六面体，接着用温热的金属小蜡铲将蜡块底部固着在台木正中，在蜡块基部的周围再添加石蜡，用小刀将材料前后左右1-2mm以外的蜡修去；
(8)切片
将修好的蜡块及台木固定在切片机上，材料的切面与切片刀口及空心菜根结中柱线三者平行，切片角度采用横切，切片厚度为5-10μm；切出的切片用毛笔或镊子轻轻挑起放置，以备贴片；
(9)贴片
贴片前在载玻片上涂抹明胶黏贴剂，然后将切下的蜡带放入温度为38-40℃的恒温水浴锅中展片，再将蜡带引至载玻片上，使蜡带光滑的一面紧贴载玻片；
(10)拷片、脱蜡和封片
将贴好的片子烘干，然后将片子放入装有TO型生物制片透明剂的染缸中脱蜡10min以上，换掉透明剂后再浸泡10min以上，重复若干次；晾干后，取中性树胶滴在材料上，再将盖玻片倾斜放下封片，制得空心菜根结巨型细胞石蜡切片。
2.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(1)所述的固定，固定期间更换一次固定液。
3.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(2)所述的将材料清洗干净，是先用流水冲洗24h以上，再用蒸馏水浸洗1h以上。
4.根据权利要求3所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：所述的流水冲洗，是将材料置于两端开口的指形筒中，两端分别盖上尼龙网，扎紧，放在自来水下流水冲洗。
5.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(3)所述的若干乙醇溶液是指体积浓度分别为15％、30％、50％、70％、85％、95％的乙醇溶液。
6.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(3)的操作完成后，材料在70％(体积浓度)乙醇溶液中脱水过夜。
7.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(5)所述的分多次加入石蜡，是分3次加入石蜡，分别加到3.5格刻度、4.5格刻度、加满。
8.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(8)所述的切片机是LEICA RM 2235型手动轮转式切片机。
9.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(9)所述的明胶黏贴剂，是每张载玻片上涂抹10μL。
10.根据权利要求1所述的制作空心菜根结巨型细胞石蜡切片的方法，其特征在于：步骤(10)所述的将片子烘干是在组织摊片机上、38-40℃下烘烤30min以上。
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