CN105136548B - 一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法及应用该方法的组织挑移工具 - Google Patents

Abstract

本发明属于昆虫解剖生理学技术领域，具体涉及一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法及应用该方法的组织挑移工具。本制备方法的固定步骤中，固定液的主要成分按体积百分比为：饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70％酒精10份；固定方式为在室温条件下，固定4～8h。通过该种方法所制作的组织切片，其具有切片效果更好、显微观察组织结构更为清晰等显著特点。组织挑移工具包括由蚊香盘状构造的托撑体，以及由该托撑体处向外延伸的手柄；托撑体呈便于组织平整放置的平面结构，且构成该平面盘状蚊香构造的各相邻环间间隙构成供溶液下漏的漏口。该工具能可靠实现不同处理过程中对组织的移动，并有效确保了组织的完整性。

Description

一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法及应用该方 法的组织挑移工具

技术领域

本发明属于昆虫解剖生理学技术领域，具体涉及一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法及应用该方法的组织挑移工具。

背景技术

茶尺蠖作为我国主要茶树害虫之一,其危害性在国内各茶区普遍存在，其中以江南茶区危害最为严重。该虫年发生6～7代，世代交替严重。成虫产卵量较大，室内测定表明，在适宜的温湿度和食料充足的条件下，单雌平均产卵量达400多粒。幼虫取食量最大期为3～5龄期，危害严重时形成扫帚枝，经过2～3年才能恢复原有树势，严重制约茶树的优质高产。除危害茶树外，该虫对大豆、菊花、杨柳、石榴、樱桃等植物均可造成危害。当前国内外对茶叶质量安全的要求较严格，鉴于茶尺蠖害虫对农业生产带来的危害，选择合适的方法防控，更好的控制田间虫口数，减少化学农药使用，已成为当前研究的重点。

组织石蜡切片法是昆虫形态学、生理学、胚胎学、病理学等生命科学领域研究细胞与组织结构的基本方法之一，可以补充活体观察的不足，从组织的细胞水平分析昆虫的形态和显微结构，且材料可长期保存。另外，其连续切片还可以进行免疫酶染色和原位杂交等组织定位。通过对茶尺蠖的组织切片观察，可起到了解该虫内生殖系统的构造，有助于进一步了解其生物学特性,这对检查利用各种不育技术和性信息化合物来控制种群数量亦是不可缺少的。由于茶尺蠖等鳞翅目昆虫内生殖器的结构独特性，完全照搬传统的组织切片方式显然不可取的。如何寻求一种新的针对茶尺蠖雄成虫内生殖器或该类昆虫的石蜡切片制备方法，以提升对雄成虫生殖系统及其相关结构的了解，从而加速研发各种不育技术和性信息化合物来达到控制种群数量的效果，为本领域近年来所亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的其中一个目的为克服传统组织切片技术的不足，提供一种操作合理而实用的茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，通过该种方法所制作的组织切片，其具有制片效率更高、切片效果更好、显微观察组织结构更为清晰等显著特点，其对茶尺蠖的种间鉴定、繁殖规律等研究具有重要的意义。本发明的另一个目的在于提供应用于上述制备方法的组织挑移工具，以能可靠实现不同处理过程中对组织的移动，并有效确保了组织的完整性，为试验的成功提供了基础保障。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，至少包括取材、固定、冲洗脱水、透明、浸蜡、包埋、修整固定、切片、贴片、脱蜡、染色和封片步骤；其中：

固定步骤中，固定液的主要成分按体积百分比为：饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70％酒精10份；固定方式为在室温条件下，固定4～8h。

所述取材步骤中，取材时间控制在成虫羽化后10～15h。

所述透明步骤中，组织材料经纯酒精与二甲苯溶剂等量混合液处理10～12min后再经由二甲苯溶剂处理10～12min；

浸蜡步骤于熔蜡器内进行，温度设定60℃，材料经TO型生物透明溶剂与石蜡等量混合液浸13～15min后，至石蜡溶剂中浸13～15min，最后再于石蜡溶剂内浸13～15min；

脱蜡步骤中，将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15-20min；再依次经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液、纯酒精、95％酒精、80％酒精、70％酒精、50％酒精、30％酒精、15％酒精以及蒸馏水，各脱蜡3～5min。

所述染色步骤采用HE染色处理：用苏木精染色液滴染5-6min，并使用水流从载玻片顶端冲洗多余的染色液，时间40s；再用伊红染色液染色5～6min，之后于70％的酒精中洗涤3～5秒；将染色后的玻片再依次经95％酒精洗涤2～3min、纯酒精洗涤5～7min、纯酒精洗涤5～7min、TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液洗涤5～7min、TO型生物透明试剂洗涤5～7min、TO型生物透明溶剂洗涤5～7min；进入封片步骤；

封片步骤中，用加拿大树脂胶滴在切片上的组织所在面，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在上述面上；然后调整好盖玻片，在切片处贴上标签。

冲洗脱水步骤中，固定后的组织材料分别经70％的酒精清洗3次，每次清洗时间均控制在15～20min；再依次经80％酒精、95％酒精、纯酒精分别洗涤3次，每次时间13～15min，进入包埋步骤；

包埋步骤中，挑取包埋组织，移至有一半蜡液的组织包埋盒内的1/3的位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理，之后进入修整固定步骤；

修整固定步骤中，用刀片切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，之后用加热的小刀融化碎蜡，将其固定在小木块上，进入切片步骤；

切片步骤中，用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6μm，之后进入贴片步骤；

贴片步骤中，在载玻片的一端，滴一滴甘油蛋白粘片剂，抹成均匀的薄层，再滴加1滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上；再将玻片在酒精灯上来回过热，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38℃。

一种应用于上述制备方法的组织挑移工具，至少包括由单根金属丝盘绕回旋而成的盘状蚊香构造的托撑体，以及由该托撑体处向外延伸的手柄；所述托撑体呈便于组织切片平整放置的平面结构，且构成该平面盘状蚊香构造的各相邻环间间隙构成供溶液下漏的漏口。

所述托撑体所用金属丝为铜丝或镍丝。

所述手柄长度为60mm～100mm，托撑体最大直径为4mm～8mm，构成托撑体的各相邻环间间隙＜1mm。

所述构成托撑体的单根金属丝的最外端向外直线延伸以构成前述手柄，于该手柄延伸方向的末端布置便于握持的把手。

本发明的主要优点在于：

1)、克服了常规的混合固定液的配比枷锁，另辟蹊径的采用了新的固定液配比结构。使用表明，新的混合固定液可有效缩短组织固定时间，解决了传统固定液配比对组织材料硬化程度过大的不利影响，尤其适宜于茶尺蠖等鳞翅目昆虫内生殖器的固定，制片效率可得到显著提升。

2)、确定了适用于茶尺蠖雄成虫内生殖器制片中各步骤的处理时间：也即内生殖器取材时间以雄虫羽化后10-15小时最宜。茶尺蠖雄成虫在该时间段时，其内生殖器已经完全发育成熟，并处于待交配状态，此期制作的切片能更好的反应内生殖器的发育状态，观察到完整的组织结构。取材早生殖器未发育成熟，特别像精巢等组织内部的精原细胞、精母细胞和精子等更是如此。而取材晚成虫已交配，切片不能真实的反应内容物的填充状态。确定最适宜的取材时间，对切片质量和预期目的影响极大。

3)、建立了二甲苯与TO型生物透明剂交替使用的透明脱蜡处理方式。二甲苯对组织中乙醇的置换效果优于TO型生物透明剂，但基于其毒性，后期的脱蜡利用TO，两者共同作用即可减少对人体危害，又可明显提高组织切片结构的清晰度，从而可进一步的提升其切片效果及显微观察质量。

4)、摒弃了传统的粗放式的组织挑移操作所带来的诸如操作要求苛刻乃至组织材料移动时极易破裂等诸多缺陷。通过采用可标准化制作的挑移器具，一方面，通过具备面状结构并带有漏口的托撑体作为托撑面，以提供待挑移的组织材料以平稳的放置基面，来确保组织材料在移动时的整体受力均匀性乃至组织完整性。另一方面，通过手柄来提供托撑体以移动施力，以在避免人手部与组织材料间的直接接触的同时保证操作时的持续目视效果。作为本发明主体的托撑体，其具体实施方式可为多种，或为呈现漏勺状的弧面构造，或为呈现由金属丝弯折而成的四方状甚至是多边状结构等；其只需实现在对组织材料进行面托撑的同时，再保证诸如蜡液等多余溶液的快速沥除效果即可。作为本发明的进一步优选方案，本发明采用单根的金属丝盘绕形成的平面蚊香盘结构。通过上述结构，能可靠实现不同处理过程中对组织的移动，并有效确保了组织的完整性，为试验的成功提供了基础保障。

5)、托撑体的材质选择，之所以采用铜丝或镍丝，这是考虑到铜丝或镍丝自身的高加工性以及耐蚀性，即使长时间工作于腐蚀环境中，也不会产生生锈等现象，从而杜绝了对组织材料乃至相应溶液的污染现象。对于手柄等各结构间的尺寸限定，可针对不同的处理材料，而在相应尺寸上均存在一定差异。如针对茶尺蠖雄成虫内生殖器官等组织切片中，则选用前述各尺寸等，此处就不再赘述。

6)、此处设置的所谓托撑体的最外端，是指构成蚊香盘状结构后，以其前端为中心并由内而外盘旋时的金属丝最末端结构。当然。此处的金属丝最末端还应当继续向远离上述中心而向外继续延伸，以构成手柄；同时在手柄上设置把手，以便于实验人员快速和便捷握持。

附图说明

图1-3为组织挑移工具的三种实施例结构示意图；

图4取材时间为成虫羽化后48小时以上的雄虫精巢切片效果图；

图5取材时间为成虫羽化后12小时的精巢切片效果图；

图6精巢固定6小时切片效果图；

图7精巢固定10小时切片效果图。

图1-3中所示各标号与组织挑移工具中各部件名称对应关系如下：

10-托撑体 11-漏口

20-手柄 30-把手

具体实施方式

为便于理解，此处结合图1-7对本发明的具体结构及工作方式作以下进一步描述：

本发明的具体技术方案如下：

1)、取材：内生殖器取于成虫羽化10～15小时内为宜，解剖取材在生理盐水内进行。

2)、固定：在固定液内进行固定处理，室温条件下，固定时间掌握在4～8小时。

3)、冲洗与脱水：组织材料分别经70％的酒精清洗3次，每次清洗时间控制在15～20min，去除固定液黄色。再经80％→95％→纯酒精洗涤3次，每次时间13～15min，各处理时间需一致。

4)、透明：组织材料经纯酒精与二甲苯溶剂等量混合液→二甲苯溶剂，各10～12min。

5)、浸蜡：熔蜡器内进行，温度设定为60℃，材料经TO型生物透明溶剂+石蜡等量混合液→石蜡溶剂→石蜡溶剂，各13～15min。

6)、包埋：用昆虫针挑取包埋组织，快速的移至有一半蜡液的组织包埋盒内距一端的1/3位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理。

7)、修整和固定：用刀片小心切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，底部面积大便于固定。之后用加热的刀片融化碎蜡，将其固定在小木块上，固定蜡条时要注意组织材料包埋位置，切勿造成损失。

8)、切片：用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6μm。

9)、贴片：在载玻片的一端，滴一滴绿豆大小的甘油蛋白粘片剂(也即蛋清+甘油等量混合)，用干净的手指涂抹成均匀的薄层，再滴加1滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上，再将玻片在酒精灯上来回过热几次，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38℃。

10)、将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15～20min,尽量脱蜡干净；再经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液→纯酒精→95％酒精→80％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→15％酒精→蒸馏水，各3～5min。

11)、染色：采用苏木精-伊红染色液(HE染色)进行染色处理。也即用苏木精染色液滴染5～6min，用细水流冲洗掉多余的染色液，时间控制在35～45s。再用伊红染色液染色5～6min，立即置于70％的酒精中洗涤3～5秒。

12)、将染色后的玻片再经95％酒精2-3min→纯酒精→纯酒精→TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液→TO型生物透明试剂→TO型生物透明溶剂，各5～7min。

13)、封藏和贴标签：用加拿大树脂胶滴在组织所在面积的切片上，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在切片上，速度要放慢，切勿产生气泡。然后用昆虫针缓慢的调整好盖玻片，在切片的右端贴上标签，注明器官的名称和制作日期。

14)、观察：将做好的石蜡切片在生物光学显微镜下进行观察和拍照。

上述操作中，组织材料处理过程中对材料的挑移均采用组织挑移工具。而所述的固定液是由下列试剂按体积百分比配制而成，具体为：饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70％酒精10份。石蜡是采用熔点为52-54℃的生物组织用石蜡。本发明涉及的浓度均为质量百分比。

实施例1：

1)、取材：在生理盐水中，解剖羽化后10～11小时之间的雄成虫，移出内生殖器，取出精巢，整个取材时间控制在1分钟以内，确保材料的新鲜度。

2)、固定：利用组织挑移工具，将各精巢组织移至固定液中进行固定，时间为5小时。

3)、冲洗与脱水：因固定液有黄色，因此试验材料需经70％的酒精清洗3次，每次清洗时间均控制在20min，除去固定液黄色。再经80％→95％→纯酒精洗涤3次，每次时间15min。

4)、透明：组织材料经纯酒精+TO型生物透明溶剂等量混合液→TO型生物透明溶剂，各12min。

5)、浸蜡：熔蜡器内进行，温度设定为60℃，材料经TO型生物透明溶剂+石蜡等量混合液→石蜡溶剂→石蜡溶剂，各15min。

6)、包埋：用两根昆虫针挑取精巢，快速的移至有一半蜡液的组织包埋盒内的距一端1/3的位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理。

7)、修整和固定：用刀片小心切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，底部面积大易于固定。蜡条高3cm，下底边长0.8cm，上底边长0.5cm。之后利用加热的刀片融化碎蜡，将其固定在小木块上，固定蜡条时要注意组织材料包埋位置，切勿造成损失。

8)、切片：用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6μm。

9)、贴片：在载玻片的一端(2/5处)，滴一滴绿豆大小的甘油蛋白粘片剂，用干净的手指涂抹成均匀的薄层，再滴加1滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上，再将玻片在酒精灯上来回过热几次，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38℃。

10)、将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15min；再经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液→纯酒精→95％酒精→80％酒精→70％酒精→50％酒精→30％酒精→15％酒精→蒸馏水，各5min。

11)、染色：采用苏木精-伊红染色液(HE染色)进行染色处理。用苏木精染色液滴染6min，用细水流冲洗掉多余的染色液，时间控制在40秒。再用伊红染色液染色5min，立即用70％的酒精中洗涤5秒。

12)、将染色后的玻片再经95％酒精2min→纯酒精→纯酒精→TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液→TO型生物透明试剂→TO型生物透明溶剂，各5min。

13)、封藏和贴标签：用加拿大树脂胶滴在组织所在面积的切片上，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在切片上，速度要放慢，切勿产生气泡。然后用昆虫针缓慢的调整好盖玻片，在切片的右端贴上标签，注明器官的名称和制作日期。

14)、观察：将做好的石蜡切片在生物光学显微镜下进行观察和拍照。

石蜡切片技术作为一种重要的组织细微结构观察手段，在动植物研究中已经很成熟，但针对不同的处理材料，在试验手段与步骤上均存在差异。本方法针对茶尺蠖雄成虫内生殖器官，分别确定了取材时间和某些关键步骤的独特处理方式，但不仅仅局限于茶尺蠖，对及其它种均具有重要的指导意义。根据茶尺蠖雄成虫内生殖器官的特点，本发明通过上述制备方法及采用独特的组织挑移工具，其制作的切片组织具有切片效果更好，显微观察组织结构更为清晰等显著特点，丰富了茶尺蠖雄成虫生殖生理的研究，对种间鉴定、繁殖规律等研究具有重要的意义。

Claims (8)

1.一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：至少包括取材、固定、冲洗脱水、透明、浸蜡、包埋、修整固定、切片、贴片、脱蜡、染色和封片步骤；其中：

固定步骤中，固定液的主要成分按体积百分比为：饱和苦味酸50份，甲醛25份，冰醋酸5份，70％酒精10份；固定方式为在室温条件下，固定4～8h；

所述透明步骤中，组织材料经纯酒精与二甲苯溶剂等量混合液处理10～12min后再经由二甲苯溶剂处理10～12min；

浸蜡步骤于熔蜡器内进行，温度设定60℃，材料经TO型生物透明溶剂与石蜡等量混合液浸13～15min后，至石蜡溶剂中浸13～15min后，继续再移至新的石蜡溶剂内浸13～15min；

脱蜡步骤中，将干燥后的蜡片用TO型生物透明溶剂脱蜡2次，每次15-20min；再依次经TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液、纯酒精、95％酒精、80％酒精、70％酒精、50％酒精、30％酒精、15％酒精以及蒸馏水，各脱蜡3～5min。

2.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述取材步骤中，取材时间控制在成虫羽化后10～15h。

3.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述染色步骤采用HE染色处理：用苏木精染色液滴染5～6min，并使用水流从载玻片顶端冲洗多余的染色液，时间40s；再用伊红染色液染色5～6min，之后于70％的酒精中洗涤3～5秒；将染色后的玻片再依次经95％酒精洗涤2～3min、纯酒精洗涤5～7min、纯酒精洗涤5～7min、TO型生物透明试剂与纯酒精等量混合液洗涤5～7min、TO型生物透明试剂洗涤5～7min、TO型生物透明溶剂洗涤5～7min；进入封片步骤；

封片步骤中，用加拿大树脂胶滴在切片上的组织所在面，盖玻片背面滴上一滴TO型生物透明溶剂，反盖在上述面上；然后调整好盖玻片，在切片处贴上标签。

4.根据权利要求1或2或3所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：冲洗脱水步骤中，固定后的组织材料分别经70％的酒精清洗3次，每次清洗时间均控制在15～20min；再依次经80％酒精、95％酒精、纯酒精分别洗涤3次，每次时间13～15min，进入包埋步骤；

包埋步骤中，挑取包埋组织，移至有一半蜡液的组织包埋盒内的1/3的位置，再将包埋盒加满蜡液，置于冷却台面进行冷却处理，之后进入修整固定步骤；

修整固定步骤中，用刀片切去材料周围多余的蜡，根据组织的位置与大小，修正蜡条，且各个面要削得平整，呈梯形，之后用加热的小刀融化碎蜡，将其固定在小木块上，进入切片步骤；

切片步骤中，用莱卡切片机将蜡条切成薄片，切片厚度设置为6μm，之后进入贴片步骤；

贴片步骤中，在载玻片的一端，滴一滴甘油蛋白粘片剂，抹成均匀的薄层，再滴加1滴蒸馏水，用昆虫针将切好的蜡片移至玻片上；再将玻片在酒精灯上来回过热，使蜡片平展开，用吸水纸除去多余的水，置于烘干器上待其干燥，烘干器温度设置为38℃。

5.根据权利要求1所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述固定步骤中，利用组织挑移工具将茶尺蠖雄成虫的精巢组织移至固定液中进行固定；

该组织挑移工具至少包括由单根金属丝盘绕回旋而成的盘状蚊香构造的托撑体(10)，以及由该托撑体(10)处向外延伸的手柄(20)；所述托撑体(10)呈便于组织切片平整放置的平面结构，且托撑体(10)的各相邻环间间隙构成供溶液下漏的漏口(11)。

6.根据权利要求5所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述托撑体(10)所用金属丝为铜丝或镍丝。

7.根据权利要求5所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述手柄(20)长度为60mm～100mm，托撑体(10)的最大直径为4mm～8mm，构成托撑体的各相邻环间间隙＜1mm。

8.根据权利要求5所述的一种茶尺蠖雄成虫内生殖器石蜡切片的制备方法，其特征在于：所述构成托撑体(10)的单根金属丝的最外端向外直线延伸以构成前述手柄(20)，于该手柄(20)延伸方向的末端布置便于握持的把手(30)。