CN103759994A - 一种昆虫幼虫石蜡切片方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种昆虫幼虫石蜡切片方法,属于显微组织切片技术领域。该方法包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡和组织复水等步骤,操作简单、耗时短,最终切片对组织区分度高,能观察到虫体完整的空间结构,适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体,在明场下观察其体壁完整,体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间,占身体比例大的消化道结构清晰完整,一对腹足的空间结构正常;在蓝光激发下,能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种昆虫幼虫石蜡切片方法,属于显微组织切片技术领域。
背景技术
昆虫石蜡切片技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术,一般包括解剖、固定、脱水透明、包埋、切片等步骤。昆虫外骨骼较为坚硬,难以制作完整的石蜡切片,目前昆虫石蜡切片方法多数用于昆虫的局部组织或器官(如触角、消化道、足等),这样不能观察到昆虫整体的显微结构。昆虫幼虫柔韧的体壁包裹着开放流动的血淋巴和体液,血淋巴和体液中从头部至尾部贯穿着管状消化道,消化道相对体积较大,消化道内由昆虫摄取的食物填充,食物水分含量高。针对这种身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料,目前常规的切片方法不仅操作复杂,需要耗费较长时间,且常使用毒性大的二甲苯等化学物质,更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想,最终切片对组织区分度十分有限,尤其是占虫体比例非常大的消化道容易变形或破碎,难以观察到虫体完整空间结构。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆虫幼虫石蜡切片方法。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
一种昆虫幼虫石蜡切片方法,包括以下步骤:
(1)组织固定:
取昆虫虫体浸于组织固定液中,抽真空并保持负压10~30分钟(使虫体完全沉至底部),再于4℃下静置10~14小时;
(2)组织脱水:
取组织固定后的虫体,4℃条件下,依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水,每个梯度的处理时间至少为1小时;
(3)组织透明:
取组织脱水后的虫体,室温下在组织透明剂中浸泡5~9小时(每1.5~2小时更换组织透明剂一次);
(4)浸蜡、包埋与切片:
取组织透明后的虫体,在65℃的液体石蜡中浸泡7~9小时,凝固定型后切片;
(5)展片与粘片:
取切片移至载玻片上,在切片边缘滴加60℃的蒸馏水至切片完全展开,再置于30~37℃条件下10~14小时粘片;
(6)脱蜡和组织复水:
取组织透明剂滴加在切片组织上,保持至少20分钟后吸走,重复至少按此,再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水,每个梯度的处理时间为1~5分钟。
所述步骤(1)中的组织固定液为:取100mL PBS缓冲液,调节缓冲液pH值至10.5~11.5,加热至65~75℃,加入多聚甲醛至终浓度为4%,待溶解完全后冷却,调节溶液pH值至6.5~7.5,再加入30μL吐温-20或吐温X-100,冷却至4℃备用。固定液的用量与虫体的体积比为20:1。
所述的PBS缓冲液的组成为:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L,pH值为5~7。
所述步骤(1)中负压的压力值为-1.0KPa。
所述步骤(2)中乙醇用量与虫体的体积比为20:1;每个梯度的处理时间优选为1小时。
所述步骤(2)中组织脱水步骤为:
1)4℃条件下,50%乙醇中保持1h,
2)4℃条件下,60%乙醇中保持1h,
3)4℃条件下,70%乙醇中保持1h(此步骤可长期存放),
4)4℃条件下,90%乙醇中保持1h,
5)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
6)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
7)4℃条件下,无水乙醇中保持1h。
所述步骤(3)中组织透明步骤为:
1)室温条件下,组织透明剂中浸泡1.5~3小时,
2)室温条件下,组织透明剂中浸泡1.5~3小时,
3)室温条件下,组织透明剂中浸泡2~3小时。
所述步骤1)、2)中的浸泡时间优选1.5小时,步骤3)中的浸泡时间优选2小时。
所述的组织透明剂为Histo-Clear,型号为SG HS-200,购自美国National Diagnotics公司。
所述步骤(4)中浸蜡步骤为:
1)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
2)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
3)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
4)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时。
所述步骤(4)中将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中,迅速调整虫体在石蜡中的位置,在冷水中凝固定型完成包埋。
所述步骤(6)中脱蜡和组织复水步骤为:
1)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
2)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
3)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
4)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
5)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
6)将95%乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
7)将85%乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
8)将70%乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
9)将50%乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
10)将30%乙醇滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走,
11)将无菌水滴加在切片组织上,保持1min,再用吸水纸在切片边缘吸走。
本发明的有益效果:
本发明中昆虫幼虫石蜡切片方法,操作简单、耗时短,最终切片对组织区分度高,能观察到虫体完整的空间结构,适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体,在明场下观察其体壁完整,体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间,尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整,甚至一对腹足也空间结构正常;在蓝光激发下,能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。本发明昆虫整体石蜡切片方法即可以弥补局部观察的不足,还可以进行免疫酶染色和原位杂交等组织定位,为昆虫生理、病理学等方面的研究提供新的试验方法。
本发明在组织透明步骤中采用Histo-Clear组织透明剂,在处理组织切片时不需要吸入有毒的二甲苯,安全性高,透明处理效果好。Histo-Clear处理的样本没有二甲苯处理的硬和脆,方便切成更薄的切片,并且延长了切片刀片的寿命。
附图说明
图1为本发明实施例1中棉铃虫3龄幼虫虫体腹节横切面切片。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明,但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
本实施例中昆虫幼虫石蜡切片方法,包括以下步骤:
1、组织固定
在化学通风柜中配制4%的多聚甲醛溶液作为组织固定液,固定液现配现用,组织固定液配制流程为:在100毫升PBS缓冲液(PBS缓冲液:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L,pH值为5~7)中,添加固体氢氧化钠颗粒,使pH值达到11,然后在微波炉中加热到70℃,加入多聚甲醛颗粒4g,快速摇动至溶解,用冰水浴对溶液进行冷却,用浓硫酸调整pH值至7,最后添加30μl Tween20,配制好的组织固定液冷却到4℃;
固定流程为:将供试虫体(室内饲养棉铃虫3龄幼虫,饲养室温度27℃,相对湿度60%,光照16:8/L:D)直接投放入到4℃预冷的现配的固定液中,固定液的量与虫体的体积比为20:1,用真空泵抽真空,保持负压值-1.0kpa,时间15min,解除负压后,确认虫体已沉入固定液底部,将固定液连同虫体一起放入4℃保持12h;
2、组织脱水
从固定液取出中组织固定完毕的虫体,使用乙醇梯度溶液依次进行如下脱水步骤(乙醇溶液用量与虫体的体积比为20:1):
1)4℃条件下,50%乙醇中保持1h,
2)4℃条件下,60%乙醇中保持1h,
3)4℃条件下,70%乙醇中保持1h,
4)4℃条件下,90%乙醇中保持1h,
5)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
6)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
7)4℃条件下,无水乙醇中保持1h;
3、组织透明处理
采用美国National Diagnotics公司组织透明剂Histo-Clear,每次Histo-Clear的量与虫体的体积比为20:1,依次进行以下3个步骤:
1)室温条件下,Histo-Clear液体中浸泡1.5小时,
2)室温条件下,Histo-Clear液体中浸泡1.5小时,
3)室温条件下,Histo-Clear液体中浸泡2小时;
4、浸蜡与包埋
预先将石蜡在65℃下融化,将经组织透明处理过的虫体依次经过以下4个浸蜡步骤:
1)浸入液体石蜡,65℃浸泡2h,
2)浸入液体石蜡,65℃浸泡2h,
3)浸入液体石蜡,65℃浸泡2h,
4)浸入液体石蜡,65℃浸泡2h,
将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中,迅速调整虫体在石蜡中的位置,在冷水中凝固定型完成包埋;
5、切片
将虫体石蜡包埋块固定于切片机刀架上,虫体横切面垂直于刀口,修除近刀一端包埋块的石蜡仅保留虫体组织,控制切片厚度9μm进行连续切片;
6、展片
用毛笔将连续切片转移至载玻片上,用移液器滴加60℃蒸馏水150μl到切片边缘,切片处于半悬浮状态,待切片缓慢舒展;
7、粘片
展片置于35℃烘箱中,经12h完成粘片;
8、脱蜡和组织复水
室温条件下,对切片进行如下脱蜡和组织复水步骤:
1)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
2)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
3)用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上,保持20min,然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear,
4)用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇,
5)用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇,
6)用移液器将95%乙醇轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走95%乙醇,
7)用移液器将85%乙醇轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走85%乙醇,
8)用移液器将70%乙醇轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走70%乙醇,
9)用移液器将50%乙醇轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走50%乙醇,
10)用移液器将30%乙醇轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走30%乙醇,
11)用移液器将无菌水轻滴加在切片组织上,保持1min,然后用吸水纸在切片边缘吸走无菌水;
9、封片和观察
在切片组织上滴加甘油1滴,盖上盖玻片,在可见光下观察明场下的组织结构,在蓝光激发下观察暗场下的特殊组织结构(见图1)。
在明场下观察,发现体壁完整,体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间,尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整,甚至一对腹足也空间结构正常(见图1a);在蓝光激发下,能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平(见图1b)。
Claims (10)
1.一种昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)组织固定:
取昆虫虫体浸于组织固定液中,抽真空并保持负压10~30分钟,再于4℃下静置10~14小时;
(2)组织脱水:
取组织固定后的虫体,4℃条件下,依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水,每个梯度的处理时间至少为1小时;
(3)组织透明:
取组织脱水后的虫体,室温下在组织透明剂中浸泡5~9小时;
(4)浸蜡、包埋与切片:
取组织透明后的虫体,在65℃的液体石蜡中浸泡7~9小时,凝固定型后切片;
(5)展片与粘片:
取切片移至载玻片上,在切片边缘滴加60℃的蒸馏水至切片完全展开,再置于30~37℃条件下10~14小时粘片;
(6)脱蜡和组织复水:
取组织透明剂滴加在切片组织上,保持至少20分钟后吸走,重复至少3次,再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水,每个梯度的处理时间为1~5分钟。
2.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(1)中的组织固定液为:取100mL PBS缓冲液,调节缓冲液pH值至10.5~11.5,加热至65~75℃,加入多聚甲醛至终浓度为4%,待溶解完全后冷却,调节溶液pH值至6.5~7.5,再加入30μL吐温-20或吐温X-100,冷却至4℃备用。
3.根据权利要求2所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述的的PBS缓冲液的组成为:NaCl 137mmol/L,KCl 2.7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L,pH值为5~7。
4.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(1)中负压的压力值为-1.0KPa。
5.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(2)中组织脱水步骤为:
1)4℃条件下,50%乙醇中保持1h,
2)4℃条件下,60%乙醇中保持1h,
3)4℃条件下,70%乙醇中保持1h,
4)4℃条件下,90%乙醇中保持1h,
5)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
6)4℃条件下,无水乙醇中保持1h,
7)4℃条件下,无水乙醇中保持1h。
6.根据权利要求5所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(2)中乙醇用量与虫体的体积比为20:1。
7.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(3)中组织透明步骤为:
1)室温条件下,组织透明剂中浸泡1.5~2小时;
2)室温条件下,组织透明剂中浸泡1.5~2小时;
3)室温条件下,组织透明剂中浸泡2~3小时。
8.根据权利要求7所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述的组织透明剂为Histo-Clear。
9.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(4)中浸蜡步骤为:
1)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
2)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
3)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时,
4)浸入液体石蜡,65℃浸泡2小时。
10.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法,其特征在于:所述步骤(6)中脱蜡和组织复水步骤为:
1)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min后吸走,
2)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min后吸走,
3)将组织透明剂滴加在切片组织上,保持20min后吸走,
4)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
5)将无水乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
6)将95%乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
7)将85%乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
8)将70%乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
9)将50%乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
10)将30%乙醇滴加在切片组织上,保持1min后吸走,
11)将无菌水滴加在切片组织上,保持1min后吸走。
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