CN103759994A

CN103759994A - 一种昆虫幼虫石蜡切片方法

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Publication number: CN103759994A
Application number: CN201410001003.7A
Authority: CN
Inventors: 李永丽; 周洲; 源春彦; 李红英; 刘圣明
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-02
Also published as: CN103759994B

Abstract

本发明公开了一种昆虫幼虫石蜡切片方法，属于显微组织切片技术领域。该方法包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与粘片、脱蜡和组织复水等步骤，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构，适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，占身体比例大的消化道结构清晰完整，一对腹足的空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。

Description

一种昆虫幼虫石蜡切片方法

技术领域

本发明具体涉及一种昆虫幼虫石蜡切片方法，属于显微组织切片技术领域。

背景技术

昆虫石蜡切片技术是研究昆虫组织形态及组织病理的重要实验技术，一般包括解剖、固定、脱水透明、包埋、切片等步骤。昆虫外骨骼较为坚硬，难以制作完整的石蜡切片，目前昆虫石蜡切片方法多数用于昆虫的局部组织或器官（如触角、消化道、足等），这样不能观察到昆虫整体的显微结构。昆虫幼虫柔韧的体壁包裹着开放流动的血淋巴和体液，血淋巴和体液中从头部至尾部贯穿着管状消化道，消化道相对体积较大，消化道内由昆虫摄取的食物填充，食物水分含量高。针对这种身体柔软、液体含量高、腔室比例大的幼虫虫体材料，目前常规的切片方法不仅操作复杂，需要耗费较长时间，且常使用毒性大的二甲苯等化学物质，更重要的是最终固定、包埋、切片等的效果不够理想，最终切片对组织区分度十分有限，尤其是占虫体比例非常大的消化道容易变形或破碎，难以观察到虫体完整空间结构。

发明内容

本发明的目的是提供一种昆虫幼虫石蜡切片方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种昆虫幼虫石蜡切片方法，包括以下步骤：

（1）组织固定：

取昆虫虫体浸于组织固定液中，抽真空并保持负压10～30分钟（使虫体完全沉至底部），再于4℃下静置10～14小时；

（2）组织脱水：

取组织固定后的虫体，4℃条件下，依次用浓度梯度为50%、60%、70%、90%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间至少为1小时；

（3）组织透明：

取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡5～9小时（每1.5～2小时更换组织透明剂一次）；

（4）浸蜡、包埋与切片：

取组织透明后的虫体，在65℃的液体石蜡中浸泡7～9小时，凝固定型后切片；

（5）展片与粘片：

取切片移至载玻片上，在切片边缘滴加60℃的蒸馏水至切片完全展开，再置于30～37℃条件下10～14小时粘片；

（6）脱蜡和组织复水：

取组织透明剂滴加在切片组织上，保持至少20分钟后吸走，重复至少按此，再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每个梯度的处理时间为1～5分钟。

所述步骤（1）中的组织固定液为：取100mL PBS缓冲液，调节缓冲液pH值至10.5～11.5，加热至65～75℃，加入多聚甲醛至终浓度为4%，待溶解完全后冷却，调节溶液pH值至6.5～7.5，再加入30μL吐温-20或吐温X-100，冷却至4℃备用。固定液的用量与虫体的体积比为20:1。

所述的PBS缓冲液的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，pH值为5～7。

所述步骤（1）中负压的压力值为-1.0KPa。

所述步骤（2）中乙醇用量与虫体的体积比为20:1；每个梯度的处理时间优选为1小时。

所述步骤（2）中组织脱水步骤为：

1）4℃条件下，50%乙醇中保持1h，

2）4℃条件下，60%乙醇中保持1h，

3）4℃条件下，70%乙醇中保持1h（此步骤可长期存放），

4）4℃条件下，90%乙醇中保持1h，

5）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

6）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

7）4℃条件下，无水乙醇中保持1h。

所述步骤（3）中组织透明步骤为：

1）室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5～3小时，

2）室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5～3小时，

3）室温条件下，组织透明剂中浸泡2～3小时。

所述步骤1）、2）中的浸泡时间优选1.5小时，步骤3）中的浸泡时间优选2小时。

所述的组织透明剂为Histo-Clear，型号为SG HS-200，购自美国National Diagnotics公司。

所述步骤（4）中浸蜡步骤为：

1）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

2）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

3）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

4）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时。

所述步骤（4）中将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中，迅速调整虫体在石蜡中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋。

所述步骤（6）中脱蜡和组织复水步骤为：

1）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

2）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

3）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

4）将无水乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

5）将无水乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

6）将95%乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

7）将85%乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

8）将70%乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

9）将50%乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

10）将30%乙醇滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走，

11）将无菌水滴加在切片组织上，保持1min，再用吸水纸在切片边缘吸走。

本发明的有益效果：

本发明中昆虫幼虫石蜡切片方法，操作简单、耗时短，最终切片对组织区分度高，能观察到虫体完整的空间结构，适用于身体柔软、液体含量高、腔室比例大的的幼虫虫体材料。采用该方法处理3龄棉铃虫幼虫虫体，在明场下观察其体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整，甚至一对腹足也空间结构正常；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平。本发明昆虫整体石蜡切片方法即可以弥补局部观察的不足，还可以进行免疫酶染色和原位杂交等组织定位，为昆虫生理、病理学等方面的研究提供新的试验方法。

本发明在组织透明步骤中采用Histo-Clear组织透明剂，在处理组织切片时不需要吸入有毒的二甲苯，安全性高，透明处理效果好。Histo-Clear处理的样本没有二甲苯处理的硬和脆，方便切成更薄的切片，并且延长了切片刀片的寿命。

附图说明

图1为本发明实施例1中棉铃虫3龄幼虫虫体腹节横切面切片。

具体实施方式

下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例中昆虫幼虫石蜡切片方法，包括以下步骤：

1、组织固定

在化学通风柜中配制4%的多聚甲醛溶液作为组织固定液，固定液现配现用，组织固定液配制流程为：在100毫升PBS缓冲液（PBS缓冲液：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，pH值为5～7）中，添加固体氢氧化钠颗粒，使pH值达到11，然后在微波炉中加热到70℃，加入多聚甲醛颗粒4g，快速摇动至溶解，用冰水浴对溶液进行冷却，用浓硫酸调整pH值至7，最后添加30μl Tween20，配制好的组织固定液冷却到4℃；

固定流程为：将供试虫体（室内饲养棉铃虫3龄幼虫，饲养室温度27℃，相对湿度60%，光照16:8/L:D）直接投放入到4℃预冷的现配的固定液中，固定液的量与虫体的体积比为20：1，用真空泵抽真空，保持负压值-1.0kpa，时间15min，解除负压后，确认虫体已沉入固定液底部，将固定液连同虫体一起放入4℃保持12h；

2、组织脱水

从固定液取出中组织固定完毕的虫体，使用乙醇梯度溶液依次进行如下脱水步骤（乙醇溶液用量与虫体的体积比为20:1）：

1）4℃条件下，50%乙醇中保持1h，

2）4℃条件下，60%乙醇中保持1h，

3）4℃条件下，70%乙醇中保持1h，

4）4℃条件下，90%乙醇中保持1h，

5）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

6）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

7）4℃条件下，无水乙醇中保持1h；

3、组织透明处理

采用美国National Diagnotics公司组织透明剂Histo-Clear，每次Histo-Clear的量与虫体的体积比为20:1，依次进行以下3个步骤：

1）室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡1.5小时，

2）室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡1.5小时，

3）室温条件下，Histo-Clear液体中浸泡2小时；

4、浸蜡与包埋

预先将石蜡在65℃下融化，将经组织透明处理过的虫体依次经过以下4个浸蜡步骤：

1）浸入液体石蜡，65℃浸泡2h，

2）浸入液体石蜡，65℃浸泡2h，

3）浸入液体石蜡，65℃浸泡2h，

4）浸入液体石蜡，65℃浸泡2h，

将第四次的石蜡连同虫体组织一起倒入包埋盒中，迅速调整虫体在石蜡中的位置，在冷水中凝固定型完成包埋；

5、切片

将虫体石蜡包埋块固定于切片机刀架上，虫体横切面垂直于刀口，修除近刀一端包埋块的石蜡仅保留虫体组织，控制切片厚度9μm进行连续切片；

6、展片

用毛笔将连续切片转移至载玻片上，用移液器滴加60℃蒸馏水150μl到切片边缘，切片处于半悬浮状态，待切片缓慢舒展；

7、粘片

展片置于35℃烘箱中，经12h完成粘片；

8、脱蜡和组织复水

室温条件下，对切片进行如下脱蜡和组织复水步骤：

1）用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上，保持20min，然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear，

2）用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上，保持20min，然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear，

3）用移液器将Histo-Clear液体轻滴加在切片组织上，保持20min，然后用吸水纸在切片边缘吸走Histo-Clear，

4）用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇，

5）用移液器将无水乙醇液体轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走无水乙醇，

6）用移液器将95%乙醇轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走95%乙醇，

7）用移液器将85%乙醇轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走85%乙醇，

8）用移液器将70%乙醇轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走70%乙醇，

9）用移液器将50%乙醇轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走50%乙醇，

10）用移液器将30%乙醇轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走30%乙醇，

11）用移液器将无菌水轻滴加在切片组织上，保持1min，然后用吸水纸在切片边缘吸走无菌水；

9、封片和观察

在切片组织上滴加甘油1滴，盖上盖玻片，在可见光下观察明场下的组织结构，在蓝光激发下观察暗场下的特殊组织结构（见图1）。

在明场下观察，发现体壁完整，体腔内部的肌肉组织、神经组织等分布其间，尤其是占身体比例非常大的消化道结构清晰完整，甚至一对腹足也空间结构正常（见图1a）；在蓝光激发下，能够观察到各器官组织被激发的自发绿色荧光水平（见图1b）。

Claims

1.一种昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）组织固定：

取昆虫虫体浸于组织固定液中，抽真空并保持负压10～30分钟，再于4℃下静置10～14小时；

（2）组织脱水：

（3）组织透明：

取组织脱水后的虫体，室温下在组织透明剂中浸泡5～9小时；

（4）浸蜡、包埋与切片：

（5）展片与粘片：

（6）脱蜡和组织复水：

取组织透明剂滴加在切片组织上，保持至少20分钟后吸走，重复至少3次，再依次滴加浓度梯度为100%、95%、85%、70%、50%、30%的乙醇溶液和水，每个梯度的处理时间为1～5分钟。

2.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（1）中的组织固定液为：取100mL PBS缓冲液，调节缓冲液pH值至10.5～11.5，加热至65～75℃，加入多聚甲醛至终浓度为4%，待溶解完全后冷却，调节溶液pH值至6.5～7.5，再加入30μL吐温-20或吐温X-100，冷却至4℃备用。

3.根据权利要求2所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述的的PBS缓冲液的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L，pH值为5～7。

4.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（1）中负压的压力值为-1.0KPa。

5.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（2）中组织脱水步骤为：

1）4℃条件下，50%乙醇中保持1h，

2）4℃条件下，60%乙醇中保持1h，

3）4℃条件下，70%乙醇中保持1h，

4）4℃条件下，90%乙醇中保持1h，

5）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

6）4℃条件下，无水乙醇中保持1h，

7）4℃条件下，无水乙醇中保持1h。

6.根据权利要求5所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（2）中乙醇用量与虫体的体积比为20:1。

7.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（3）中组织透明步骤为：

1）室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5～2小时；

2）室温条件下，组织透明剂中浸泡1.5～2小时；

3）室温条件下，组织透明剂中浸泡2～3小时。

8.根据权利要求7所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述的组织透明剂为Histo-Clear。

9.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（4）中浸蜡步骤为：

1）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

2）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

3）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时，

4）浸入液体石蜡，65℃浸泡2小时。

10.根据权利要求1所述的昆虫幼虫石蜡切片方法，其特征在于：所述步骤（6）中脱蜡和组织复水步骤为：

1）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走，

2）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走，

3）将组织透明剂滴加在切片组织上，保持20min后吸走，

4）将无水乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

5）将无水乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

6）将95%乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

7）将85%乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

8）将70%乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

9）将50%乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

10）将30%乙醇滴加在切片组织上，保持1min后吸走，

11）将无菌水滴加在切片组织上，保持1min后吸走。