CN106442070B - 一种植物叶片切片的制作方法 - Google Patents
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Abstract
一种植物叶片切片的制作方法，在制片过程中，添加非离子表面活性剂吐温‑20的水溶液。制片所使用的非离子表面活性剂吐温‑20的水溶液，吐温‑20的体积浓度＜0.1%，用量为50μl～100μl。本发明通过添加非离子表面活性剂‑‑吐温‑20的水溶液，能保持材料的活性，以最大限度的减少材料的脱水萎缩；利用激光共聚焦显微镜或其他显微镜观察材料时，能使带标记的荧光菌制成的压片有效观察时间长达18h，并保持2天的荧光，且所观察到的图像中几乎没有植物叶片的自发荧光。本发明的植物叶片切片的制作方法，只需在制片时添加吐温‑20水溶液，特别适于柑橘叶片的切片制作，并且操作方便。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物叶片切片的制作方法，尤其是涉及一种延长切片显微观察时间和减少材料自发荧光干扰的制片方法，属于生物技术领域。
背景技术
在显微观察植物组织细胞时，需要对观察材料进行切片或压片，要求在植物材料的制片过程中不能对观察材料产生任何损伤，特别是在观察病原微生物侵染寄主时，要求微生物保持正常的生活力，不能混淆制片造成的植物组织损伤与病原侵染造成的损伤，因此，保证寄主与微生物不受损伤的制片方法对观察病原的侵染过程很重要。
目前，常用的切片方法是石蜡切片，但是在制片过程中要进行化学处理，对细胞组织和病原微生物会产生伤害。相比石蜡切片，冷冻切片机制作切片时不需要对叶片做其他化学处理，可将植物组织的损伤降到最低，也不会对病原微生物造成伤害；另外，冷冻切片机的速冻功能可使叶片快速冷冻，取样后立即制成切片可使叶片保持其在冷冻时最原始的状态，同时也能将菌在叶片中的形态和位置保持在最原始的状态。但是，冷冻切片在成片解冻后容易快速干片，使组织变形，导致观察的时间迅速减短，同时，植物切片容易产生活性氧，出现自发荧光，干扰对荧光标记的病原微生物的观察，影响所观察的实验图片的质量。因此需要对制片技术进行改进，以减轻植物材料的受损，不影响植物和病原微生物的活力，减轻自发荧光影响并延长切片的显微观察时间。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，尤其是克服现有技术冷冻切片成片解冻后容易快速干片、产生自发荧光的不足，提供一种植物叶片切片的制作方法，可增大叶片表面活性，延长切片观察时间，保证观察时材料的湿润，将自发荧光降到最低。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种植物叶片切片的制作方法，在制片过程中，添加非离子表面活性剂吐温-20的水溶液。
进一步，制片所使用的非离子表面活性剂吐温-20的水溶液，吐温-20的体积浓度＜0.1%，优选为0.03%～0.06%（研究表明,非离子表面活性剂吐温-20的体积浓度在＜0.1%时，为受试对象的安全浓度），用量为50μl～100μl。
具体制片方法为：取适量植物材料于载玻片上，滴加非离子表面活性剂吐温-20的水溶液，用盖玻片和封口膜封片。
研究表明，非离子表面活性剂的毒性低，用量小，具有增溶、乳化、润湿等作用，对于保持菌和植物组织的活力具有重要作用。未经表面活性剂处理的切片中，植物组织易失水，出现褐化和皱缩现象。本发明通过添加非离子表面活性剂--吐温-20的水溶液，能保持材料的活性，以最大限度的减少材料的脱水萎缩；利用激光共聚焦显微镜或其他显微镜观察材料时，能使带标记的荧光菌制成的压片有效观察时间长达18h，并保持2天的荧光，且所观察到的图像中几乎没有植物叶片的自发荧光。
本发明的植物叶片切片的制作方法，只需在制片时添加吐温-20水溶液，特别适于柑橘叶片的切片制作，并且操作方便。
附图说明
图1、图2为实施例1中10×物镜下用0.03%的表面活性剂处理后的切片；图3、图4为实施例1中10×物镜下未经表面活性剂处理的切片；
图3中左图除侵染菌种的荧光外，其余部分的荧光为植物受损后的自发荧光（图中椭圆标记处）；图4中 黑色部分（箭头指示处）为植物组织失水后褐化的形态，并出现叶片组织的皱缩（图中矩形标记处）。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
柑橘溃疡病（Citrus bacterial canker disease，CBCD）是一种影响全球柑橘产业发展的重大病害,其病原菌为柑橘黄单胞杆菌柑橘变种(Xanthomonas citri susp.citri，Xcc）。溃疡病菌在寄主表面成功附着后,为了能够致病,必须侵入植物组织。因此，病原菌入侵寄主的过程是致病的关键环节，观察溃疡病菌在柑橘寄主中的侵染和定殖过程，对溃疡病的防治和抗病品种的选育都具有重要意义。为观察溃疡病菌在柑橘寄主中的侵染和定殖过程，需要将植物叶片制成切片从纵切和横面观察溃疡病在叶片中的位置。
本实施例是将溃疡病菌液接种于冰糖橙叶片表面上，取接种后的冰糖橙叶片制成切片，用激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察溃疡病菌在叶片组织的分布。具体包括以下步骤：
1）病原菌接种：将浓度为108 cfu/ml的EGFP（即eGFP）标记的溃疡病菌菌液点菌接种5 μl于冰糖橙活体叶片上。
所述EGFP标记的溃疡病菌，其获得方法，参见CN102559843A，发明名称为“一种柑橘溃疡病菌侵染过程实时观察方法”。
2）切片的制备：用解剖刀取2mm × 2 mm大小的正方形叶盘于冷冻切片机速冻圆盘上，滴加适量的胶水，使叶盘直立包埋于胶水中迅速置于冷冻切片机厢中速冻。定型后，用冷冻切片机切成厚度为7 µm的切片置于载玻片上，添加50 µl 体积浓度为0.03%的非离子表面活性剂--吐温-20的水溶液，用盖玻片和封口膜封片。
3）CLSM观察荧光标记的细菌 用ZEISS CLSM 710的倒置显微镜加I3 滤镜（BP450-490，DM510，LP515）通光照射样品，用 10 × 0.40、20 × 0.70 和 63 × Oil 物镜观察。对选定位点用 488 nm 激光激发，在 500 nm ～ 530 nm 波段检测荧光，在 600 nm ～800 nm 间调整带宽检测样品的自发荧光。调节通道设定值的大小到最佳，拍照保存。
切片观察结果如附图所示，经过吐温-20处理的切片中没有出现明显的皱缩，基本没有褐化，叶片依旧保持湿润状态（图1、图2）；未添加吐温-20的切片中，冰糖橙叶片组织因失水导致细胞皱缩，严重褐化（图4）；添加吐温-20能最大限度地降低叶片的自发荧光，在图中除了荧光菌的荧光外，几乎没有检测到其他荧光（图1）；而未经处理的切片由于植物材料失水引起的损伤，产生了大量的自发荧光（图3）。实验证明本发明的添加吐温-20可延长切片观察时间至18h，而未添加吐温-20的切片只能维持约4h，本发明方法能大幅延长观察时间。而且本发明只需在制片时添加适量的吐温-20，操作方便，明显改进切片的观察效果。
Claims (3)
1.一种植物叶片切片的制作方法，其特征在于，取植物冷冻切片于载玻片上，滴加非离子表面活性剂吐温-20的水溶液，用盖玻片和封口膜封片；吐温-20的体积浓度＜0.1%。
2.根据权利要求1所述的植物叶片切片的制作方法，其特征在于，所述吐温-20的体积浓度为0.03%～0.06%。
3.根据权利要求1或2所述的植物叶片切片的制作方法，其特征在于，所述吐温-20的水溶液用量为50μl～100μl。
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