JP7394394B2 - トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 - Google Patents
トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7394394B2 JP7394394B2 JP2020521073A JP2020521073A JP7394394B2 JP 7394394 B2 JP7394394 B2 JP 7394394B2 JP 2020521073 A JP2020521073 A JP 2020521073A JP 2020521073 A JP2020521073 A JP 2020521073A JP 7394394 B2 JP7394394 B2 JP 7394394B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- tomato
- fungi
- detection device
- pathogenic
- culture solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 title claims description 97
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 title claims description 97
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 title claims description 61
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 54
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 48
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 45
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 40
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 claims description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 22
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 18
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 18
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 18
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims description 17
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 15
- 241001322464 Pseudocercospora fuligena Species 0.000 claims description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 14
- 241000222291 Passalora fulva Species 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 241001460073 Trichoderma asperellum Species 0.000 claims description 10
- 241000404567 Penicillium olsonii Species 0.000 claims description 9
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 9
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 9
- 241001245667 Ectophoma multirostrata Species 0.000 claims description 8
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 7
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 6
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 4
- 241001503951 Phoma Species 0.000 claims description 4
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000001508 potassium citrate Substances 0.000 claims description 3
- 229960002635 potassium citrate Drugs 0.000 claims description 3
- QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K potassium citrate (anhydrous) Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O QEEAPRPFLLJWCF-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 235000011082 potassium citrates Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000393033 Biscogniauxia Species 0.000 claims 1
- 241001345484 Biscogniauxia maritima Species 0.000 claims 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 13
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920000139 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 7
- 239000005020 polyethylene terephthalate Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- -1 polyethylene terephthalate Polymers 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 5
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- FHDQNOXQSTVAIC-UHFFFAOYSA-M 1-butyl-3-methylimidazol-3-ium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCN1C=C[N+](C)=C1 FHDQNOXQSTVAIC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000208843 Arctium Species 0.000 description 2
- 235000003130 Arctium lappa Nutrition 0.000 description 2
- 235000008078 Arctium minus Nutrition 0.000 description 2
- 101000962469 Homo sapiens Transcription factor MafF Proteins 0.000 description 2
- 241000233654 Oomycetes Species 0.000 description 2
- 241000948155 Phytophthora sojae Species 0.000 description 2
- 102100039187 Transcription factor MafF Human genes 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000004362 fungal culture Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 101100519421 Homo sapiens PDZD11 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102100025661 PDZ domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000003518 caustics Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 description 1
- 230000000663 chemotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229930013032 isoflavonoid Natural products 0.000 description 1
- 150000003817 isoflavonoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000012891 isoflavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 1
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56961—Plant cells or fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
Description
本発明は、トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた選択的検出方法に関する。
植物病原性真菌については、植物侵入性に係る性質として、植物表面に付着器を形成して付着後、気孔組織等細孔を探してそこから菌糸を植物体中に伸ばす、あるいは菌糸から植物細胞壁分解酵素（セルラーゼ、ペクチナーゼ）を分泌するなどの特徴がある。
これらを利用して、例えば、特許文献１では、微多孔膜支持体を用いた真菌計量方法を開示している。また、非特許文献１では、植物病原性卵菌の１種であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅの偽菌糸が、水平に成長するより下方向にあたかも潜ろうとすること、及び３μｍの孔を有するＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）膜を貫通することを開示している。
また、この性質に着目し、本発明者らは既に、植物病原性卵菌類の判定方法を提案している（特許文献２）。
Ｐａｕｌ Ｆ． Ｍｏｒｒｉｓ．ｅｔ．ａｌ． "Ｃｈｅｍｏｔｒｏｐｉｃ ａｎｄ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ Ｈｙｐｈａｅ ｔｏ Ｓｏｙｂｅａｎ Ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ａｎｄ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ"，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８）１１７：１１７１－１１７８
Ｎｏｂｏｒｕ Ｓｈｉｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．， "Ｍｉｎｅａｌ Ｓａｌｔ Ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ｉｎ ｖｉｔｒｏ"， Ａｎｎ． Ｐｈｙｔｏｐａｔｈ． Ｓｏｃ． Ｊａｐａｎ ５３： １９１－１９７ （１９８７）
本発明の対象植物であるトマトでは、真菌による病害の比率が高く、その原因となる病原性真菌は、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ ）の３種で大半を占めると言われている。これら病原性真菌について、灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）は多犯性で他の植物でも感染するが、すすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、及び葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）は、トマトのみの感染例しかなく、植物特異性が高い病原性真菌である。本発明らは、これらトマトに特異的ともいえる病原性真菌について、実際のトマトの葉にどのような菌が居るか不明である段階、すなわち、発症前段階においてトマト病原性真菌を検知することが必要と考え検討を行った。
一方、特許文献２に記載されているような本発明者らの使用する選択的真菌検出の基本技術である人工細胞壁を用いた病原性真菌の選別技術は、植物病原菌ならばトマト病原性真菌に限らず検出する可能性がある。つまり、仮に他の植物の病原性真菌がトマトの葉に付着していると、これをトマト病原性真菌として検出してしまう恐れがある。トマト栽培は種ではなく苗からの栽培が大半で、苗圃場では、他の植物との混栽や、同じ施設における複数の植物での使いまわしなどで、トマト病原性真菌以外の植物病原性真菌のトマト苗への付着可能性は否定できない。また、実際の栽培現場、ビニールハウス等の栽培施設においても、前記の苗圃場と同じく、トマト以外の植物の病原性真菌のトマト苗への付着可能性がある。これを放置すると、トマト病原性真菌以外の植物病原性真菌が、人工細胞壁を用いた病原性真菌の選別技術において擬陽性を提示するおそれがあり、無用の投薬、苗更新など栽培に多大な不都合が生じる場合がある。
この擬陽性発生可能性について、研究・調査を行ったところ、実際に、トマト病原性真菌以外の真菌で、検討途上の人工細胞壁を用いた検出方法において、擬陽性を提示する真菌に遭遇した。それは、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌の４種類であり、これらを検知しないための検討が必要になった。
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、その目的は、トマト病原性真菌の選択的検出装置および検出方法を提供することである。
本発明者等は、鋭意検討した結果、下記構成の検出装置によって上記課題を解消し得ることを見出し、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることによって本発明を完成した。
すなわち、本発明の一つの局面に関するトマト病原性真菌の検出装置は、人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、前記培養液貯留部において、培養液が１５～３０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記培養液のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。
本発明によれば、簡易かつ安全に、トマト病原性真菌を選択的に検出できる装置および方法を提供することができる。本発明によって、トマト病原性真菌による発症前段階で菌の存在を検知することができ、その際には、トマト以外の植物病原菌による擬陽性の提示を回避できるため、産業利用上非常に有用である。
以下、本発明に係る実施形態について具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
本実施形態に係る、トマト病原性真菌を検出する装置１は、図１に示すように、人工細胞壁２と、前記人工細胞壁２の上部に設けられた試験試料液投入部３と、前記人工細胞壁２の下部に設けられた培養液貯留部４とを有し、前記培養液貯留部４において、培養液５が１５～３０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記培養液のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。
試験試料液投入部３は試験試料液を投入するための容器であるが、当該容器は上端にフランジを具備していることが望ましい。そして、試験試料液投入部３の底面は、人工細胞壁２で形成されている。
人工細胞壁２は、図２に示すように、貫通孔２２を有する基板２１と、前記基板２１の片面に設けられたセルロース膜２３とを少なくとも備えていることが好ましい。このような人工細胞壁を使用することによって、標的とするトマト病原性真菌を選択的に検出することがより容易になる。
前記貫通孔２２は、基板２１の表側の面から裏側の面まで貫通しており、当該貫通孔の孔径は２～７μｍ（断面積４．５～３８．５μｍ２）であることが好ましい。孔径が前記範囲であることによって、標的の病原性真菌をより確実に選択的に検出することができる。
また、標的の病原性真菌をより確実に選択的に検出するためには、セルロース膜２３の厚みも調整することが好ましい。具体的には、セルロース膜２３の厚みは、０．５～２μｍであることが好ましい。
本実施形態の人工細胞壁２において、基板２１の貫通孔２２の孔径およびセルロース膜２３の膜厚を上記範囲のように調整することによって、トマト非病原性真菌は、セルロース膜２３を貫通しないものが多いため、トマト非病原性真菌の一部をこの段階で排除することができると考えられる。一方、本実施形態で標的とするトマト病原性真菌は選択的に基板の裏面に現れる。
また、前記基板２１の厚みは特に限定されないが、一例として５～１５０μｍ程度であることが好ましい。
図１に示されるように、試験試料液投入部３の内部には試験試料液が供給される。この試験試料液がトマト病原性真菌を含有している場合、基板２１の表側の面上にトマト病原性真菌が存在することになる。
本実施形態において、試験試料液は、主にトマトの葉に付着した真菌を含む液（菌回収液）であり、標的の病原性真菌を含んでいる可能性のある液体であれば特に限定はされない。例えば、トマトの葉を洗浄するために使用した後の液体やトマトの葉を浸漬した液体であり、水、生理食塩水、界面活性剤配合水（Ｔｗｅｅｎ８０ ０．０１～０．１％）などが挙げられる。
本実施形態の検出装置が標的とするトマト病原性真菌は、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることが好ましい。
また、本実施形態の検出装置は、トマト葉に存在する場合があるが、トマト非病原性真菌である真菌、例えば、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌を検出しないことが好ましい。より具体的には、前記トマト非病原性真菌は、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍである。
なお、本明細書において、用語「トマト病原性」とは、トマトに対して病原性を有していることを意味する。用語「トマト非病原性」とは、トマトに対して病原性を有していないことを意味する。真菌が病原性を有しているとしても、トマトに対して病原性を有していないのであれば、その真菌は「トマト非病原性」である。言い換えれば、真菌がトマトに対して悪影響を与えないのであれば、その真菌は「トマト非病原性」である。用語「トマト非病原性」に含まれる接頭語「非」は、「トマト」を修飾せず、接頭語「非」は「病原性」を修飾する。
本実施形態の検出装置において、前記人工細胞壁２の下部に設けられた培養液貯留部４には、培養液５が入れられている。培養液５としては、真菌が培養できる培養液であれば特に限定はされず、一般的な培地や培養液を使用できる。例えば、一般的な真菌培養用培地であるポテトデキストロース培地、サブローデキストロース培地等が使用可能である。なお、真菌の培養を加速するために、培養液貯留部４だけでなく、前記試験試料液にも培養液を添加してもよい。
本実施形態では、この培養液５のｐＨが５～５．５であり、かつ、培養液５が１５～３０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含んでいることが重要である。このような構成により、病原性真菌の検出において擬陽性を示す妨害菌（トマト非病原性真菌）を排除することができ、標的のトマト病原性真菌を選択的に検出することが可能となる。
前記培養液５のｐＨが５未満であったり、５．５を超えたりすると、トマト病原性真菌の検出を妨害するトマト非病原性真菌を全て排除することができないおそれがある。また、前記培養液５に含まれるクエン酸塩緩衝液の濃度が１５ｍＭ未満となると、トマト病原性真菌の検出を妨害するトマト非病原性真菌を全て排除することができないおそれがある。一方で、前記クエン酸塩緩衝液の濃度が５０ｍＭを超えると、標的とするマト病原性真菌の一部または全部までも排除してしまうおそれがある。
前記クエン酸塩は、特に限定はされないが、クエン酸一価塩であることが好ましく、より具体的には、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムなどであることが好ましい。
さらに、前記試験試料液において、ＥＣ（電気伝導度）は、通常、２～４ｍＳ／ｃｍ程度であることが好ましい。
本実施形態の検出装置では、一定の培養期間を経た後、前記人工細胞壁２のセルロース膜２３の裏面に、トマト病原性真菌が現れているかどうかを観察することによって、試料中におけるトマト病原性真菌の存否を検出する。観察の手段は特に限定はされないが、例えば、図３に示すように、顕微鏡６を人工細胞壁２の下部に配置して、当該顕微鏡６によって光学的に観察することができる。
真菌の培養期間は特に限定はされないが、７２時間以上であることが好ましい。また、培養温度については、２０～２８℃程度とすることが好ましい。
さらに、本発明には、上述したような検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含む、トマト病原性真菌の検出方法が包含される。
本実施形態のトマト病原性真菌の検出方法は、上述した検出装置を用いる限り、その他の工程については特に限定はされないが、例えば、前記検出装置の試験試料液投入部３に試験試料液を投入する工程、試験試料液を検出装置内で静置する工程（培養する工程）、静置後、前記検出装置の人工細胞壁２（セルロース膜２３）の裏面を観察する工程、および、前記セルロース膜２３の裏面に真菌が観察された場合、前記試験試料液はトマト病原性真菌を含んでいると判定する工程を含む。
本明細書は、上述したように様々な態様の技術を開示しているが、そのうち主な技術を以下に纏める。
本発明の一つの局面に係るトマト病原性真菌の検出装置は、人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、前記培養液貯留部において、培養液が１５～３０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、及び、前記培養液のｐＨが５～５．５であることを特徴とする。
このような構成により、簡易かつ安全に、トマト病原性真菌を選択的に検出できる装置および方法を提供することができる。
さらに、前記検出装置において、前記人工細胞壁が、孔径２～７μｍの貫通孔を有し、かつ厚み５～１５０μｍの基板と、当該基板の片面に設けられた厚み０．５～２μｍのセルロース膜とを少なくとも備えることが好ましい。これにより、上述した効果をより確実に得ることができると考えられる。
また、前記検出装置において、前記クエン酸塩が、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムから選択される少なくとも一つであることが好ましい。これにより、上述した効果をより確実に得ることができると考えられる。
さらに、前記検出装置において、検出対象とするトマト病原性真菌が、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることが好ましい。そのような場合に、上述した効果をより発揮できると考えられる。
また、前記検出装置が、トマト葉に存在する場合があるが、トマト非病原性真菌である、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ属真菌、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属真菌、Ｐｈｏｍａ属真菌、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属真菌を検出しないことが好ましい。そのような場合に、上述した効果をより発揮できると考えられる。
前記トマト非病原性真菌が、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍであることがより好ましい。
本発明のさらなる局面に係るトマト病原性真菌の検出方法は、上記検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含むことを特徴とする。
以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
［真菌類の調製］
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマト灰色カビ病の病原性真菌であるＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａが、ポテトデキストロース寒天培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で１週間静置された。Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａは岐阜大学応用生物科学部に所属する清水准教授より与えられた。その後、十分に菌糸が生育したＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地をブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、胞子形成を促した。前記処理を行ったＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマト灰色カビ病の病原性真菌であるＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａが、ポテトデキストロース寒天培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ）に接種された。次いで、培地は摂氏２５度の温度下で１週間静置された。Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａは岐阜大学応用生物科学部に所属する清水准教授より与えられた。その後、十分に菌糸が生育したＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地をブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、胞子形成を促した。前記処理を行ったＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマトすすカビ病の病原性真菌であるＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２８度の温度下で１週間静置された。Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．３０６７２８）。その後、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ菌糸は、ポテトデキストロース寒天培地からゴボウ粉末寒天培地に移植され、さらに、１～２週間、摂氏２８度の温度下で静置され、再度菌糸が十分生育した後、菌糸表面を白金耳、筆等で擦るなどの機械的ストレスを与え、その後、ブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、再度胞子形成を促した。前記処理を行ったＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ培養ゴボウ粉末寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
トマト病原菌の一つで、トマトすすカビ病の病原性真菌であるＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２８度の温度下で１週間静置された。Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．３０６７２８）。その後、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ菌糸は、ポテトデキストロース寒天培地からゴボウ粉末寒天培地に移植され、さらに、１～２週間、摂氏２８度の温度下で静置され、再度菌糸が十分生育した後、菌糸表面を白金耳、筆等で擦るなどの機械的ストレスを与え、その後、ブラックライト照射下に４日間以上放置後、室温環境に２週間以上放置し、再度胞子形成を促した。前記処理を行ったＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ培養ゴボウ粉末寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａの培養）
トマト病原菌の一つで、トマト葉カビ病の病原性真菌であるＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２３度の温度下で１～２週間静置された。Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．７２６７４４）。その後、十分に菌糸が生育したＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
トマト病原菌の一つで、トマト葉カビ病の病原性真菌であるＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａが、ポテトデキストロース寒天培地に接種された。次いで、培地は摂氏２３度の温度下で１～２週間静置された。Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａは国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 遺伝資源センターより分譲を受けた（ＭＡＦＦ Ｎｏ．７２６７４４）。その後、十分に菌糸が生育したＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの培養）
トマト病原菌ではないが、トマト葉に存在した、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍを、トマト葉から採取し、分離後、ポテトデキストロース寒天培地に接種した。分離源のトマトは複数の場所から採取した。分離方法は、清澄な樹脂容器または樹脂袋中に採取したトマト葉数枚を０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を含む生理食塩水からなる菌回収液とともに投入し、１分間攪拌して葉に付着した菌を菌回収液へ移し、この菌回収液を希釈して、ストレプトマイシン硫酸塩（Ｗａｋｏ）１００ｍｇ／Ｌを含むポテトデキストロース寒天培地に、平板寒天塗抹法で塗布後、摂氏２５度で数日培養して出現した真菌コロニーから分離した。同定は、（一般財団法人）日本食品分析センター多摩研究所に依頼した。前記の単離後ポテトデキストロース寒天培地に接種されたＢｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍは、摂氏２５度の温度下で１週間静置された。その後、十分に菌糸が生育した、あるいは胞子形成が十分になされた、これら４菌種培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
トマト病原菌ではないが、トマト葉に存在した、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍを、トマト葉から採取し、分離後、ポテトデキストロース寒天培地に接種した。分離源のトマトは複数の場所から採取した。分離方法は、清澄な樹脂容器または樹脂袋中に採取したトマト葉数枚を０．１％の界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を含む生理食塩水からなる菌回収液とともに投入し、１分間攪拌して葉に付着した菌を菌回収液へ移し、この菌回収液を希釈して、ストレプトマイシン硫酸塩（Ｗａｋｏ）１００ｍｇ／Ｌを含むポテトデキストロース寒天培地に、平板寒天塗抹法で塗布後、摂氏２５度で数日培養して出現した真菌コロニーから分離した。同定は、（一般財団法人）日本食品分析センター多摩研究所に依頼した。前記の単離後ポテトデキストロース寒天培地に接種されたＢｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍは、摂氏２５度の温度下で１週間静置された。その後、十分に菌糸が生育した、あるいは胞子形成が十分になされた、これら４菌種培養ポテトデキストロース寒天培地に滅菌純水を数ｍｌ滴下し、白金耳、筆等で菌糸表面を擦り、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を得た。
［人工細胞壁の調製］
検出装置における人工細胞壁は次のように用意された。
検出装置における人工細胞壁は次のように用意された。
まず、セルロース（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ、商品名：Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ－１０１）がイオン液体に溶解され、１％の濃度を有するセルロース溶液が調製された。イオン液体は、１－Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）であった。該セルロース溶液は、摂氏６０度に加温され、次に、セルロース溶液が、底面にポリエチレンテレフタラートフィルムを有する容器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、商品名：Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＰＩＳＰ １２Ｒ ４８）の裏面にスピンコート法により３０秒間、２０００ｒｐｍの回転速度で塗布された。前記ポリエチレンテレフタラートフィルムは、図２の人工細胞壁における基板２１として機能し、３μｍの直径を有する複数の貫通孔をランダムに有していた。このようにして、ポリエチレンテレフタラートフィルムの裏側の面に、０．５マイクロメートルの厚みを有するセルロース膜が形成された。
この底面のポリエチレンテレフタラートフィルム裏面にセルロース膜が形成された容器は、エタノール中で１２時間、室温で静置された。このようにして、１－Ｂｕｔｙｌ－３－ｍｅｔｈｙｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅは、エタノールに置換・除去された後、最後に真空デシケーター内で乾燥された。このようにして、本実施例・比較例で供試する人工細胞壁が得られた。
［トマト病原性真菌の検出装置の調製］
前記の人工細胞壁とした、底面のポリエチレンテレフタラートフィルム（基板）裏面にセルロース膜が形成された容器を培地容器（培養液貯留部）に重ね、トマト病原性真菌の検出装置とした。培地容器は２４ウェル平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、商品名：２４ Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ）であり、培地容器と人工細胞壁形成容器の間に、液体の培地（培養液）６００μＬが、人工細胞壁形成容器の裏面が接するように充填された。該液体の培地は、希薄ポテトデキストロース液体培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ２．４ｇ／Ｌ 水溶液）であった。
前記の人工細胞壁とした、底面のポリエチレンテレフタラートフィルム（基板）裏面にセルロース膜が形成された容器を培地容器（培養液貯留部）に重ね、トマト病原性真菌の検出装置とした。培地容器は２４ウェル平底培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、商品名：２４ Ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｔｕｒｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｆｌａｔ Ｂｏｔｔｏｍ）であり、培地容器と人工細胞壁形成容器の間に、液体の培地（培養液）６００μＬが、人工細胞壁形成容器の裏面が接するように充填された。該液体の培地は、希薄ポテトデキストロース液体培地（ＤｉｆｃｏＴＭ Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏｔｈ ２．４ｇ／Ｌ 水溶液）であった。
［実施例１］
前記人工細胞壁形成容器の内部に、２００個の、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの菌糸片と胞子を含む、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を別々に添加し、滅菌精製水を、上記で得られた破砕菌糸・胞子混合懸濁液との合計体積が２００μＬになるよう添加し、試験試料液を得た。
前記人工細胞壁形成容器の内部に、２００個の、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの菌糸片と胞子を含む、破砕菌糸・胞子混合懸濁液を別々に添加し、滅菌精製水を、上記で得られた破砕菌糸・胞子混合懸濁液との合計体積が２００μＬになるよう添加し、試験試料液を得た。
また、上記で調製した検出装置の培養液に、クエン酸ナトリウム緩衝液を濃度が２０ｍＭとなるように調整して添加した。添加後の培養液貯留部の内部のクエン酸ナトリウム緩衝液含有希薄ポテトデキストロース液体培地（培養液）は、ｐＨ５．３、ＥＣ３．１ｍＳ／ｃｍであった。
そして、前記の７種の真菌が添加された試験試料液を、前記検出装置に配置し、当該検出装置を、摂氏２５度の温度で７２時間静置した。その後、前記人工細胞壁を貫通して、その裏面に観察される菌糸の数が、光学顕微鏡を介した目視により数えられた。光学顕微鏡での観察写真の一例（トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ））を図４に示す。
［比較例１］
培養液にクエン酸ナトリウム緩衝液を添加せず、希薄ポテトデキストロース液体培地をそのまま用いた以外は、実施例１と同様にして試験を行った。
培養液にクエン酸ナトリウム緩衝液を添加せず、希薄ポテトデキストロース液体培地をそのまま用いた以外は、実施例１と同様にして試験を行った。
［比較例２］
上記で調製した検出装置の培養液に、クエン酸ナトリウム緩衝液を濃度が１０ｍＭとなるように調整して添加した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。培養液のｐＨは５．４、ＥＣは１．７ｍＳ／ｃｍであった。
上記で調製した検出装置の培養液に、クエン酸ナトリウム緩衝液を濃度が１０ｍＭとなるように調整して添加した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。培養液のｐＨは５．４、ＥＣは１．７ｍＳ／ｃｍであった。
［比較例３］
上記で調製した検出装置の培養液に、クエン酸ナトリウム緩衝液を濃度が６０ｍＭとなるように調整して添加した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。培養液のｐＨは５．５、ＥＣは１２ｍＳ／ｃｍであった。
上記で調製した検出装置の培養液に、クエン酸ナトリウム緩衝液を濃度が６０ｍＭとなるように調整して添加した以外は、実施例１と同様にして試験を行った。培養液のｐＨは５．５、ＥＣは１２ｍＳ／ｃｍであった。
［考察］
比較例１の結果を図５に、比較例２の結果を図６に、比較例３の結果を図７に、実施例１の結果を図８にそれぞれ示す。
比較例１の結果を図５に、比較例２の結果を図６に、比較例３の結果を図７に、実施例１の結果を図８にそれぞれ示す。
培養液にクエン酸ナトリウム緩衝液を添加しなかった比較例１（図５）において、トマト葉に存在する場合があるが、検知から排除すべきトマト非病原性真菌である、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの４種と、検知すべきトマト病原性真菌のＰｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａの３種とが、全て差がない状態で人工細胞壁貫通菌糸が観察され、本比較例ではトマト病原性真菌の選択的検出ができなかった。
また比較例２（図６）においても、トマト非病原性真菌の１種のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍが、検知すべきトマト病原性真菌のＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ ，Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａの３種と差がない状態で人工細胞壁貫通菌糸が観察され、比較例２においてもすべての妨害菌を排除することができず、トマト病原性真菌の選択的検出ができなかった。
さらに、比較例３（図７）では、供試した７菌種すべてで人工細胞壁貫通菌糸が観察されず、検出すべきトマト病原性真菌さえも排除してしまったため、トマト病原性真菌の選択的検出ができなかった。
これに対し、実施例結果である図８においては、トマト病原性真菌であるＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ、及びＰａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ は、トマト葉に存在する場合があるが、検知から排除すべきトマト非病原性真菌、Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ、 Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍの４種より早く人工細胞壁貫通菌糸が観察され、実施例１ではトマト病原性真菌の選択的検出が可能となっていることが確かめられた。
本開示のトマト病原性真菌の検出装置は、擬陽性を示すトマト非病原性真菌を排除して標的のトマト病原性真菌を選択的に検出することができる。このため、本開示の検出装置は、トマトに悪影響を及ぼすトマト病原性真菌の排除や、その他、トマトに関わる農業等の技術分野において好適に利用できる。
１ 検出装置
２ 人工細胞壁
３ 試験試料液投入部
４ 培養液貯留部
５ 培養液
６ 顕微鏡
２１ 基板
２２ 貫通孔
２３ セルロース膜
２ 人工細胞壁
３ 試験試料液投入部
４ 培養液貯留部
５ 培養液
６ 顕微鏡
２１ 基板
２２ 貫通孔
２３ セルロース膜
Claims (6)
- 人工細胞壁と、前記人工細胞壁の上部に設けられた試験試料液投入部と、前記人工細胞壁の下部に設けられた培養液貯留部とを有し、
培養液が前記培養液貯留部に配置され、
前記培養液貯留部において、前記培養液が１５～３０ｍＭのクエン酸塩緩衝液を含むこと、前記培養液のｐＨが５～５．５であること、及び、前記培養液の電気伝導度が２～４ｍＳ／ｃｍであること、並びに、
検出対象とするトマト病原性真菌が、トマト灰色カビ病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）、トマトすすカビ病菌（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｆｕｌｉｇｅｎａ）、トマト葉カビ病菌（Ｐａｓｓａｌｏｒａ ｆｕｌｖａ）から選択される少なくとも一つであることを特徴とする、トマト病原性真菌の検出装置。 - 前記人工細胞壁が、孔径２～７μｍの貫通孔を有し、かつ厚み５～１５０μｍの基板と、当該基板の片面に設けられた厚み０．５～２μｍのセルロース膜とを少なくとも備える、請求項１に記載のトマト病原性真菌の検出装置。
- 前記クエン酸塩緩衝液におけるクエン酸塩が、クエン酸ナトリウムおよびクエン酸カリウムから選択される少なくとも一つである、請求項１または２に記載のトマト病原性真菌の検出装置。
- トマト非病原性真菌である、ビスコグニオークシア（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ）属真菌、ペニシリアム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属真菌、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）属真菌、およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属真菌を検出しない、請求項１～３のいずれかに記載のトマト病原性真菌の検出装置。
- 前記トマト非病原性真菌が、ビスコグニオークシア マーリティマ（Ｂｉｓｃｏｇｎｉａｕｘｉａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、ペニシリアム オルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｏｌｓｏｎｉｉ）、フォーマ マルティーロストラッタ（Ｐｈｏｍａ ｍｕｌｔｉｒｏｓｔｒａｔａ）またはトリコデルマ アスパーレラム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ）である、請求項４に記載のトマト病原性真菌の検出装置。
- 請求項１～５のいずれかに記載の検出装置を用いて、トマト病原性真菌を選択的に検出することを含む、トマト病原性真菌の検出方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018098831 | 2018-05-23 | ||
| JP2018098831 | 2018-05-23 | ||
| PCT/JP2019/015050 WO2019225172A1 (ja) | 2018-05-23 | 2019-04-05 | トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2019225172A1 JPWO2019225172A1 (ja) | 2021-07-08 |
| JP7394394B2 true JP7394394B2 (ja) | 2023-12-08 |
Family
ID=68615567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020521073A Active JP7394394B2 (ja) | 2018-05-23 | 2019-04-05 | トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210024874A1 (ja) |
| JP (1) | JP7394394B2 (ja) |
| CN (1) | CN111836880A (ja) |
| SG (1) | SG11202010655WA (ja) |
| WO (1) | WO2019225172A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111836881A (zh) * | 2018-07-09 | 2020-10-27 | 松下知识产权经营株式会社 | 植物病原性真菌的检测装置、以及使用了该检测装置的检测方法和农药浓度的选择方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017029132A (ja) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法 |
| WO2018011835A1 (ja) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 試験試料が植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1846502A (zh) * | 2006-04-03 | 2006-10-18 | 刘福京 | 一种采用壳寡糖柠檬酸盐愈伤剂防治果树根癌的方法 |
| CN101270383A (zh) * | 2008-05-08 | 2008-09-24 | 新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种番茄酱主要腐败微生物的检验方法 |
| JP5441092B2 (ja) * | 2008-09-30 | 2014-03-12 | 四国電力株式会社 | バークホルデリア属細菌、それを用いた植物病害防除剤および防除方法 |
| US20160264932A1 (en) * | 2013-09-20 | 2016-09-15 | Youichi MIZUTA | Method for preparing culture medium for culturing plant tissue, method for culturing plant tissue, sterilizing agent, microbicidal agent, and culture medium composition for culturing plant tissue |
| CN107937490A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-04-20 | 福建农林大学 | 一种非对称pcr的试纸条检测植物病原菌的方法及试剂盒 |
| CN111836879A (zh) * | 2018-05-23 | 2020-10-27 | 松下知识产权经营株式会社 | 番茄病原性真菌的检测装置和使用该装置的检测方法 |
-
2019
- 2019-04-05 CN CN201980018500.9A patent/CN111836880A/zh active Pending
- 2019-04-05 WO PCT/JP2019/015050 patent/WO2019225172A1/ja active Application Filing
- 2019-04-05 SG SG11202010655WA patent/SG11202010655WA/en unknown
- 2019-04-05 JP JP2020521073A patent/JP7394394B2/ja active Active
-
2020
- 2020-10-14 US US17/069,911 patent/US20210024874A1/en active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017029132A (ja) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法 |
| WO2018011835A1 (ja) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | パナソニックＩｐマネジメント株式会社 | 試験試料が植物病原性真菌を含有するかどうかを判定する方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1994, Vol.58, No.4, pp.616-620 |
| Microbial Cell Factories, 2015, Vol.14:63, pp.1-15 |
| 日本農芸化学会誌, 1966, Vol.40, No.4, pp.209-212 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210024874A1 (en) | 2021-01-28 |
| JPWO2019225172A1 (ja) | 2021-07-08 |
| SG11202010655WA (en) | 2020-12-30 |
| WO2019225172A1 (ja) | 2019-11-28 |
| CN111836880A (zh) | 2020-10-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7394393B2 (ja) | トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 | |
| Swain et al. | Biocontrol efficacy of Bacillus subtilis strains isolated from cow dung against postharvest yam (Dioscorea rotundata L.) pathogens | |
| CN105385601B (zh) | 一种蝗虫微孢子虫及其悬浮培养方法和应用 | |
| CN106359454A (zh) | 一种短稳杆菌农药的制备方法 | |
| CN105039414B (zh) | 一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法 | |
| CN106942276A (zh) | 枯草芽孢杆菌bab‑1防治瓜类白粉病的应用 | |
| JP7394394B2 (ja) | トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 | |
| CN106434362B (zh) | 一株抗紫外线的高毒力金龟子绿僵菌诱变菌株MaUV-1及其应用 | |
| JP7281695B2 (ja) | トマト病原性真菌の検出装置およびそれを用いた検出方法 | |
| CN101597574A (zh) | 一株高产孢环链拟青霉菌株及其筛选与应用方法 | |
| JPWO2020012781A1 (ja) | 植物病原性真菌の検出装置、並びに、それを用いた検出方法および農薬濃度の選択方法 | |
| CN110317735A (zh) | 生防寡雄腐霉菌及应用 | |
| CN113956986B (zh) | 提高昆虫生防真菌生长、产孢能力和提高毒力的方法 | |
| CN104830728A (zh) | 一种雷氏普罗威登斯菌 | |
| CN105296396B (zh) | 棉花内生细菌hb3s-13及其在棉花黄萎病防治中的应用 | |
| CN109706082B (zh) | 一株生防巨腔茎点霉菌p2及其应用 | |
| CN103382451B (zh) | 灰色产色链霉菌yn-6及其在防治根肿病中的应用 | |
| CN105886435B (zh) | 一种具有生物抗性和成膜性的复合微生物菌剂及其制备方法以及应用 | |
| CN109837236A (zh) | 高产杆状病毒的福寿螺精巢细胞系及其构建方法和用途 | |
| CN107475123A (zh) | 金线莲内生真菌及其应用 | |
| CN110283756B (zh) | 一种胶状溶杆菌发酵液的制备方法及应用 | |
| CN103070198B (zh) | 一种防治真菌病害代谢产物的制备方法 | |
| CN111117928B (zh) | 一株内生金黄短杆菌ct-a16及其应用 | |
| CN106893678A (zh) | 一种葡萄内生真菌及其防治葡萄灰霉病的应用 | |
| CN105199999A (zh) | 一种深层王祖农氏菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220314 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230221 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230414 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230711 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230905 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231024 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231117 |
|
| R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 7394394 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |