CN105039414B

CN105039414B - 一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法

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Publication number: CN105039414B
Application number: CN201510153971.4A
Authority: CN
Inventors: 时焦; 王海波; 徐宜民; 雒振宁; 韦建玉
Original assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Current assignee: Tobacco Research Institute of CAAS
Priority date: 2015-03-25
Filing date: 2015-03-25
Publication date: 2018-11-20
Anticipated expiration: 2035-03-25
Also published as: CN105039414A

Abstract

本发明公开了一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法，其中，以马德里青霉菌(Penicillium madriti)QMYCS‑2菌株作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9856；以马铃薯液体培养基制备防治烟草黑胫病的青霉菌QMYCS‑2菌株发酵液，马铃薯液体培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10‑20g、水1000mL，自然pH。用黑胫病菌接种健康的5‑6片真叶期的烟株，接种后24h施用清水稀释10倍、50倍和100倍(V/V)的马德里青霉菌QMYCS‑2菌株发酵液，每株施用50mL，结果发现本发明发酵液对烟草黑胫病有很好的控制作用，防治效果高达76.92‑93.18％。

Description

一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法

技术领域：

本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法。

背景技术：

烟草黑胫病是烟草最具毁灭性的病害之一。烟草黑胫病又称烟草疫病，烟农称为″黑杆疯″、″黑根″、″乌头病″，是由Phytophthora parasitica varnicotianae引起的，该病可造成烟株快速死亡，全世界各主要产烟区均有不同程度的发生，发病率一般为5％～15％，重病区发病率可达30％以上，能给烟草生产造成毁灭性的打击，是世界性的烟草重要病害。近年来，随着烟草连作种植年限的延长，全国各烟区病情日趋严重。由于生产上栽培烟草品种对黑胫病抗性较差或综合抗性不足，黑胫病的防治目前仍然依赖于化学防治。防治烟草黑胫病的主要农药为甲霜灵锰锌和霜霉威，药剂种类较为单一，且均已有十几年甚至几十年的使用历史，病菌对化学农药产生抗药性，导致防治效果下降，防治成本增加，环境污染加剧。此外，随着人们对环境与健康的日益重视，减少农药使用，促进安全优质烟叶生产，对改善农业生态环境具有重要意义。生物防治对环境友好，在某些情况下防治效果优于化学药剂，特别是在病害发病高峰期常伴随高温多雨，化学药剂难以发挥作用。因此开发、研究具有抗烟草黑胫病的生防菌及其培养物是必要的。

例如中国专利申请201110231990.6公开了一种针对烟草黑胫病的生防细菌及用量的筛选方法，该方法包括以下步骤：a、在培养皿内滤纸上培养无菌烟苗，b、在步骤a的基础上，向培养皿中添加具有生防潜能的细菌培养液；c、待烟苗和具生防潜能的细菌菌悬液一起培养24小时后，向培养皿中添加烟草黑胫病菌的游动孢子悬浮液；d、在c步骤基础上，给予烟苗正常生长条件，7天后通过观察烟苗的发病情况来检测添加的具生防潜力细菌的防治效果，筛选出能够防治烟草黑胫病的生防细菌。再如中国专利申请 201210159083X公开了一种兼抗烟草黑胫病和青枯病的生防菌株Trb3，为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，所述菌株Trb3制备菌剂的方法是，将所述菌株Trb3在LB培养液28℃，180rpm振荡培养36-40小时，然后6000 rpm离心10分钟，用灭菌水进行稀释配制成菌剂，Trb3菌株菌剂在烟草移栽前蘸根或移栽时灌根使用，移栽后在烟草黑胫病和青枯病即将进入发病期时灌根使用。又如中国专利申请2012100216079公开了一种烟草黑胫病病菌液固复合体系培养方法及培养物应用，该法培养获得的固体物可用于烟草黑胫病的人工接种物，也可用于制备带烟草黑胫病病菌病土的添加物，以便测定烟草品种对黑胫病的抗感性、筛选防治烟草黑胫病的药剂或生防菌、天然产物。其培养步骤包括(A)病菌分离，从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力测定，获得病菌；(B)平板培养，将病菌接种于培养基平板上，24～30℃下培养5～7天；(C)液体培养，将平板菌丝接种于培养液中，24～30℃、150转/分钟振荡培养5～7天；(D)固体培养，将液体菌丝接种于固体培养基，24～30℃培养8～12天。又如，中国专利申请 2007103000874公开了一种防治烟草黑胫病的菌株及菌剂，菌株采用淡紫拟青霉ZY-19-2，其菌剂为通过原种发酵工艺制成菌剂，以0.8-2.0％的胶体几丁质为碳源，发酵初始pH值为5.5-7.0，以0.8-1.5％蛋白胨为氮源，0.1％吐温80作为表面活性剂，发酵时间为48-72h，接种量为0.8-2％，摇床转速100-180r/min。

目前，生防菌剂的开发成为近期研究的热点，多为细菌类生防菌，其中芽孢杆菌、假单胞菌、链霉菌等细菌类生防因子研究应用较多。也有个别利用真菌的，其中木霉真菌研究利用较多。最近有人利用拟青霉属的真菌，例如 2007103000874的专利申请。而利用青霉属真菌作为生防菌的研究很少见报道，用于人类病害防治的重要抗生素之一青霉素来源于青霉属的真菌，因此开展青霉菌属真菌对黑胫病菌的控制研究具有很重要的现实意义。青霉属真菌的种类较多，例如，产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)，桔青霉菌(Penicillium citrinum)，指状青霉(Penicillium dititatum)，散枝青霉(Penicilliumdivaricatum)，扩展青霉(Penicillium expansum)，粒状青霉(Penicillium granu/atum)，马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei)，特异青霉菌(Penicillium notatum)，产紫青霉(Penicillium purpurogenum)，娄地青霉(Penicillium roqueforti)，尖孢青霉(Penicillium spiculisporum)，变异青霉(Penicillium varians)，马德里青霉菌(Penicillium madriti)等等。

淡紫拟青霉与马德里青霉菌的区别为：

淡紫拟青霉在分类地位上属于拟青霉菌属，学名为：Penicilliopsis，拟青霉菌属真菌是虫生真菌的重要类群，其中许多是害虫的控制因子，用于害虫的生物防治研究的较多。淡紫拟青霉属于内寄生性真菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能够寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、胞囊线虫、茎线虫等植物线虫病的危害。

马德里青霉在分类地位上属于青霉菌属，学名为：Penicillium，青霉菌属的真菌多营腐生生活，生长在腐烂的水果、蔬菜、肉类和各种潮湿的有机物上。有些也会引起桔子、橙子变质。有关马德里青霉菌的研究国内尚未见详细报道，在国外的数据库中只查到1篇文献，其中仅一句话叙述，将其应用于棉花红腐病的生物防治。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种对人畜与环境安全性好，对烟草黑胫病防治效果好的防治烟草黑胫病的青霉QMYCS-2菌株发酵液及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种防治烟草黑胫病的青霉QMYCS-2菌株发酵液及其制备方法，其中，

以马德里青霉菌QMYCS-2作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC NO.9856；

以马铃薯液体培养基、燕麦片液体培养基或查彼液体培养基制备防治烟草黑胫病的马德里青霉QMYCS-2菌株发酵液，所述马德里青霉QMYCS-2菌株是菌种保藏号为CGMCCNO.9856的保藏菌株；

所述马铃薯液体培养基为：马铃薯200g、葡萄糖10-20g、蒸馏水1000ml，自然pH；

所述燕麦片液体培养基为：30g燕麦片，1000mL水，自然pH，

所述查彼液体培养基为：NaNO₃2g，K₂HPO₄1g，KCl0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄0.01g，蔗糖30g，水1000ml，pH自然。

防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法，其中，包括如下步骤：

A、以马德里青霉菌QMYCS-2菌株作为生防菌株，此菌株于2014年11月 14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为 CGMCC NO.9856；

B、在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；

C、从燕麦片培养基上培养4d的马德里青霉菌QMYCS-2菌株的菌落边缘取直径为5mm菌饼，将该菌饼接种于含100mL马铃薯液体培养基、容量为250mL的三角瓶中，28℃，180rpm振荡培养15-20d；

D、纱布过滤除去菌丝体，再经8000r/分钟离心5分钟，镜检无细胞，获得发酵液；

E、用生物测定的方法确定发酵液活性；

F、确定发酵液具有生物活性后，用清水将发酵液稀释10倍、50倍和100 倍(V/V)；用于防治烟草黑胫病。

步骤B在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；燕麦片琼脂培养基：30g燕麦片，琼脂15～20g，1000mL水，自然pH。

步骤E用生物测定的方法确定发酵液活性，具体为：取经0.2μm细菌过滤器灭菌的发酵液与燕麦片琼脂培养基按1∶10(V/V)混合，然后取18mL 倒入直径85mm的无菌培养皿内。在该培养皿的中央接种直径为5mm的黑胫病菌菌饼，该黑胫病菌菌饼取自燕麦片琼脂培养基上培养4d的烟草黑胫病菌菌落边缘。接种后将培养皿置于28℃黑暗恒温培养箱中培养，每24h 后十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长的抑制率，抑制率达到60％认为发酵液有生物活性。

进一步的，所述生防菌株的筛选方法为：

1、菌种鉴定：在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，水1000mL，自然pH)上菌落圆形，先长出白色菌丝，而后中央变绿，即分生孢子梗和分生孢子，分生孢子梗从菌丝垂直生出，有的聚成孢梗束，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分支1次或多次，对称或不对称，顶层为小梗，以切离法生出分生孢子，分生孢子串呈不分支的链状，单个孢子球形或卵园形，无色或绿色，初步认为生防菌株QMYCS-2属于马德里青霉菌。

2、通过对生防菌株QMYCS-2的16S rDNA序列分析，获得了567bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中，进行Blast搜索，其中同源性最高的是马德里青霉菌(Penicilliummadriti)，选择与生防菌株QMYCS-2同源性高的序列进行系统发育学分析，结果，QMYCS-2菌株与马德里青霉菌 (Penicillium madriti)同源性较高。依据此结果，再根据菌体形态和培养性状，可以将生防菌株QMYCS-2归入青霉菌属。

QMYCS-2菌株16S rDNA序列表：567bp

AAGGATCATTACTGAGTGAGGGCCCTCTGGGTCCAACCTCCCACCCGTGTTTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTTACGGCCGCCGGGGGGCTCACGCTCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCCTCGAACTCTGTCTGAAGATTGTAGTCTGAGTGGAATTATAAATTATTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCAATCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGATCAACCAAACTTTTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGCCGGAGGAA

3、首先在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，水1000mL，自然pH)上培养烟草黑胫病菌，培养4d后从菌落边缘用打孔器打取直径为5 mm的菌饼用于对峙培养，然后将菌饼移至含燕麦片琼脂培养基的培养皿中，在距培养皿中心两侧30mm处分别接种上述青霉菌QMYCS-2菌饼或者烟草黑胫病菌菌饼1块，两个菌饼处于同一培养皿的直径线上。试验设3个处理，处理1为青霉菌与烟草黑胫病菌的对峙培养，处理2为对照1，2块直径5mm的烟草黑胫病菌菌饼对峙培养，处理3为对照2，将1块直径5mm 的黑胫病菌菌饼置于培养皿中心单独培养。菌饼接种于培养皿中后置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养24h，测量菌落半径，并计算抑制率。

抑制率(％)＝【对照菌落半径(对照2)-处理菌落半径)】/对照菌落半径(对照2)×100％

相对抑制率(％)＝【拮抗菌抑制率-病原菌自身抑制率(对照1)】/病原菌自身抑制率(对照1)×100％

4、将所述生防菌株QMYCS-2在液体马铃薯培养基中，28℃180rpm振荡培养15d-20d，然后用双层纱布过滤，取滤液，作为青霉菌QMYCS-2的发酵液原液。

5、选择5-6片真叶期健康无病的盆栽烟苗，品种为红花大金元和小黄金 1025，对其接种强致病力的黑胫病菌。共设5个处理，处理1为清水对照，浇施50mL清水；处理2为稀释100倍的马德里青霉菌QMYCS-2菌株发酵液，每盆浇施50mL；处理3为稀释50倍的马德里青霉菌QMYCS-2菌株发酵液，每盆浇施50mL；处理4为稀释100倍的马德里青霉菌QMYCS-2 菌株发酵液，每盆浇施50mL；处理5为甲霜灵锰锌800倍液(生产上常用防治烟草黑胫病的药剂)每盆浇施50mL，作药剂对照。接种黑胫病菌后 24h进行浇施上述发酵液或药剂等。待试验烟苗发病后按照GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法调查1次，10天后再调查1次，计算病情指数与防治效果。筛选得出结论，马德里青霉菌QMYCS-2菌株发酵液具有抗烟草黑胫病的良好效果。

本发明的优点为，制备方便的马德里青霉菌发酵液，其对人畜与环境安全性好，对烟草黑胫病的防病效果好。用黑胫病菌接种健康的5-6片真叶期的烟株，接种后24h施用稀释10倍、50倍和100倍的马德里青霉菌QMYCS-2 菌株发酵液，每株施用50mL，结果发现发酵液对烟草黑胫病有很好的控制作用，防治效果达到76.92-93.18％。

附图说明：

图1是基于分离菌株QMYCS-2和来自青霉属不同种的ITS序列构建的N-J 系统进化树。

图2QMYCS-2菌的显微照片(目镜×物镜＝16×10)。

图3QMYCS-2菌的显微照片(目镜×物镜＝16×40)。

图4马德里青霉QMYCS-2菌株在燕麦片培养基上的生长菌落。

图5青霉菌QMYCS-2对烟草黑胫病菌的抑制效果。

具体实施方式：

防治烟草黑胫病的青霉QMYCS-2发酵液，其中，

以马德里青霉菌QMYCS-2作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.9856；

以马铃薯液体培养基、燕麦片液体培养基或查彼液体培养基制备防治烟草黑胫病的马德里青霉QMYCS-2菌株发酵液，所述马德里青霉QMYCS-2菌株为菌种保藏号为CGMCCNO.9856所保藏的菌株；

所述燕麦片液体培养基为：30g燕麦片，1000mL水，自然pH，

防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法，包括如下步骤：

B、在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；

E、用生物测定的方法确定发酵液活性；

进一步的，所述生防菌株的筛选方法为：

1、菌种鉴定：在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，去离子水1000 mL，自然pH)上菌落圆形，先长出白色菌丝，而后中央变绿，即分生孢子梗和分生孢子，分生孢子梗从菌丝垂直生出，有的聚成孢梗束，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分支1次或多次，对称或不对称，顶层为小梗，以切离法生出分生孢子，分生孢子串呈不分支的链状，单个孢子球形或卵园形，无色或绿色，初步认为生防菌株QMYCS-2属于马德里青霉菌。

QMYCS-2菌株16S rDNA序列表：567bp

3、首先在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，水1000mL，自然pH)上培养烟草黑胫病菌，培养4d后从菌落边缘用打孔器打取直径为5 mm的菌饼用于对峙培养，同时在马铃薯固体培养基上培养QMYCS-2菌，培养7d后在菌落边缘用打孔器取直径为5mm的菌饼用于对峙培养，然后将菌饼移至含燕麦片琼脂培养基的培养皿中，在距培养皿中心两侧30mm 处分别接种上述青霉菌QMYCS-2菌饼或者烟草黑胫病菌饼1块，两个菌饼处于同一直线上。试验设4个处理，处理1为青霉菌与烟草黑胫病菌的对峙培养，处理2为对照1烟草黑胫病菌自身对峙培养，处理3为对照2，将1 块黑胫病菌菌饼置于培养皿中心单独培养。接种后置于28℃恒温培养箱中黑暗培养24h，测量菌落半径，并计算抑制率。

抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径×100％

相对抑制率(％)＝(拮抗菌抑制率-病原菌自身抑制率)/病原菌自身抑制率×100％

4、将所述生防菌株QMYCS-2在液体马铃薯培养基中28℃，180rpm振荡培养15d-20d，然后用双层纱布过滤，取滤液，作为青霉菌QMYCS-2的发酵液原液。

5、选择5-6片真叶期健康无病的盆栽烟苗，品种为红花大金元和小黄金 1025，对其接种强致病力的黑胫病菌。共设4个处理，处理1为清水对照，浇施50mL清水；处理2为稀释100倍的马德里青霉菌(QMYCS-2)发酵液，每盆浇施50mL；处理3为稀释50倍的马德里青霉菌(QMYCS-2) 发酵液，每盆浇施50mL；处理4为稀释10倍的马德里青霉菌(QMYCS-2) 发酵液，每盆浇施50mL；处理5为：甲霜灵锰锌800倍液(生产上常用防治烟草黑胫病的药剂)每盆浇施50mL，作药剂对照。接种黑胫病菌后24 h进行浇施发酵液或药剂等。待试验烟苗发病后按照GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法调查1次，10天后再调查1次，计算病情指数与防治效果。筛选得出结论，马德里青霉菌(QMYCS-2)发酵液具有抗烟草黑胫病的良好效果。

下面结合附图，对发明进行说明。图1是生防菌株QMYCS-2的系统发育分析。图2QMYCS-2菌的显微照片(目镜×物镜＝16×10)。图3QMYCS-2 菌的显微照片(目镜×物镜＝16×40)图4马德里青霉QMYCS-2菌株在燕麦片培养基上的生长菌落。图5青霉菌QMYCS-2菌株对烟草黑胫病菌的抑制效果。

本发明鉴定其抗黑胫病的过程如下：

一、菌种鉴定

一株抗烟草黑胫病的生防菌，为马德里青霉菌(Penicillium madriti)，在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，水1000mL，自然pH)上菌落圆形，先长出白色菌丝，而后中央变绿，即分生孢子梗和分生孢子，分生孢子梗从菌丝垂直生出，有的聚成孢梗束，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，分支1次或多次，对称或不对称，顶层为小梗，以切离法生出分生孢子，分生孢子串呈不分支的链状，单个孢子球形或卵园形，无色或绿色(图2-4)，初步认为生防菌株QMYCS-2属于马德里青霉菌。

通过对生防菌株QMYCS-2的16S rDNA序列分析，获得了567bp的序列，在GenBank核酸序列数据库中，进行Blast搜索，其中同源性最高的是马德里青霉菌(Penicilliummadriti)，选择与生防菌株QMYCS-2同源性高的序列进行系统发育学分析，结果如图1所示，QMYCS-2菌株与马德里青霉菌(Penicillium madriti)同源性较高。依据此结果，再根据菌体形态和培养性状，可以将生防菌株QMYCS-2归入青霉菌属。

QMYCS-2菌株16S rDNA序列表：567bp

二、生防菌株QMYCS-2菌株对烟草黑胫病菌的抑菌效果

1)生防菌株QMYCS-2菌株对烟草黑胫病菌的抑菌效果

生防菌QMYCS-2菌株对烟草黑胫病菌的抑菌效果研究，采用了平板对峙培养法。首先在燕麦片琼脂培养基(燕麦片30g，琼脂15g，水1000mL，自然pH)上培养烟草黑胫病菌，培养4d后从菌落边缘用打孔器打取直径为5mm的菌饼用于对峙培养，然后将菌饼移至含燕麦片琼脂培养基的培养皿中，在距培养皿中心两侧30mm处分别接种上述青霉菌QMYCS-2菌饼或者烟草黑胫病菌饼1块，两个菌饼处于同一培养皿直径线上。试验设3个处理，处理1为青霉菌与烟草黑胫病菌的对峙培养，处理2为对照1烟草黑胫病菌自身对峙培养，处理3为对照2，将1块黑胫病菌菌饼置于培养皿中心单独培养。接种后置于28℃恒温培养箱中黑暗培养24h，测量菌落半径，并计算抑制率(表1，图5)。

相对抑制率(％)＝(拮抗菌抑制率-病原菌自身抑制率)/病原菌自身抑制率×100％。

表1 QMYCS-2菌株发酵液对烟草黑胫病菌生长的抑制效果(24h)

三、生防菌QMYCS-2菌株发酵液的制备

生防菌株QMYCS-2用于制备生防菌剂QMYCS-2菌株发酵液的方法如下：

B、在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；

C、将直径为5mm在燕麦片培养基上培养的马德里青霉菌QMYCS-2菌株的菌饼接种于含100mL马铃薯液体培养基、容量为250mL的三角瓶中， 28℃，180rpm振荡培养15-20d；

E、用生物测定的方法确定发酵液活性；

F、确定发酵液具有生物活性后，用清水将发酵液稀释10倍、50和100倍 (V/V)倍；用于防治烟草黑胫病。

四、QMYCS-2菌株三种发酵液对烟草黑胫病菌的作用比较

1.QMYCS-2菌株马铃薯液体发酵液：从燕麦片固体培养基上培养4d的 QMYCS-2菌株菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，将该菌饼接种于含100 mL马铃薯液体培养基、容量为250mL的三角瓶中，28℃，180rpm振荡培养15-20d；纱布过滤除去菌丝体，再经8000r/分钟离心5分钟，镜检无细胞，获得发酵液。

2.QMYCS-2菌株燕麦片发酵液：从燕麦片固体培养基上培养4d的QMYCS-2菌株菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，将该菌饼接种于含100 mL燕麦片液体培养基、容量为250mL的三角瓶中，28℃，180rpm振荡培养15-20d；纱布过滤除去菌丝体，再经8000r/分钟离心5分钟，镜检无细胞，获得发酵液。

3.QMYCS-2菌株查彼发酵液：从燕麦片固体培养基上培养4d的 QMYCS-2菌株菌落边缘打取直径为5mm的菌饼，将该菌饼接种于含100 mL查彼液体培养基、容量为250mL的三角瓶中，28℃，180rpm振荡培养15-20d；纱布过滤除去菌丝体，再经8000r/分钟离心5分钟，镜检无细胞，获得发酵液。

用0.2μm的细菌过滤器灭菌上述3种发酵液，将上述3种发酵液按不同的浓度加入到燕麦片琼脂培养基中，并将10mL混合后的培养基倒入直径 85mm的培养皿中制作平板。同时设向燕麦片琼脂培养基中加等量无菌水作对照和加常用药剂(甲霜锰锌可湿性粉剂，有效含量72％)作另一对照。从燕麦片琼脂培养基上培养4d的烟草黑胫病菌菌落边缘打取直径为5mm 的菌饼，接种到上述平板中央，接种后置于28℃黑暗恒温培养箱中培养，每 24h十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长的抑制率(表2)。

表2 QMYCS-2菌株三种发酵液对烟草黑胫病菌的抑制作用

注：以上浓度为加入到燕麦片培养基后最终稀释浓度；对照中加入无菌水后菌丝生长与空白对照无差异。表中数据为5次平均值。

五、生防菌剂QMYCS-2对烟草黑胫病的防效

选择5-6片真叶期健康无病的盆栽烟苗，品种为红花大金元和小黄金1025，对其接种强致病力的黑胫病菌。共设4个处理，处理1为清水对照，浇施 50mL清水，处理2为稀释100倍的马德里青霉菌(QMYCS-2)菌株发酵液，处理3为稀释50倍的马德里青霉菌(QMYCS-2)菌株发酵液，处理4 为稀释10倍的马德里青霉菌(QMYCS-2)菌株发酵液，每盆浇施50mL，接种黑胫病菌后24h进行浇施。待试验烟苗发病后按照GB/T 23222-2008 烟草病虫害分级及调查方法调查1次，10天后再调查1次，计算病情指数与防治效果(表3-4)。

表3 QMYCS-2菌株发酵液防治黑胫病试验结果

注：烤烟品种为红花大金元

表4 QMYCS-2菌株发酵液防治黑胫病试验结果

注：烤烟品种为小黄金1025

比较试验

本专利生防菌株来抗烟草黑胫病与2007103000874公开了一种防治烟草黑胫病的菌株及菌剂进行对照比较，目前有关青霉属真菌作为生防菌的研究很少，国内尚未见报道，国外文献只能查到1篇文章的摘要，摘要中简单叙述马德里青霉菌对引起棉花红腐病的病菌(Fusarium moniliforme)具有抑制作用。我们查到国内授权的发明专利2007103000874利用了淡紫拟青霉菌防治烟草黒胫病菌，前面已叙述了拟青霉菌与青霉菌的差别。2007103000874专利叙述淡紫拟青霉菌防治烟草黒胫病菌的效果是较对照减少50％，本专利所述的马德里青霉菌对烟草黑胫病的防治效果达到 76.92-93.18％。同时2007103000874专利叙述淡紫拟青霉菌发酵液的制备需要需要较昂贵的化学试剂，如胶体几丁质、蛋白胨和吐温等。该项专利只需要比较容易获得的马铃薯制作培养基，制作工艺简单。

Claims

1.一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法，其特征在于，

以马德里青霉QMYCS-2菌株作为生防菌，此菌株于2014年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9856；

所述燕麦片液体培养基为：30g燕麦片，1000mL水，自然pH，

所述查彼液体培养基为：NaNO₃2g，K₂HPO₄1g，KCl 0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄0.01g，蔗糖30g，水1000ml，自然pH；

QMYCS-2菌株16S rDNA序列表：567bp：

2.一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、以马德里青霉菌QMYCS-2菌株作为生防菌株，此菌株于2014年11月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.9856；

B、在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；

E、用生物测定的方法确定发酵液活性；

F、确定发酵液具有生物活性后，用清水将发酵液稀释10倍、50倍和100倍(V/V)；用于防治烟草黑胫病。

3.根据权利要求2所述一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法，其特征在于，步骤B在燕麦片琼脂培养基上培养马德里青霉菌QMYCS-2菌株；燕麦片琼脂培养基：30g燕麦片，琼脂15～20g，1000mL水，自然pH。

4.根据权利要求2所述一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液的制备方法，步骤E用生物测定的方法确定发酵液活性，具体为：取经0.2μm细菌过滤器灭菌的发酵液与燕麦片琼脂培养基按1∶10(V/V)混合，然后取18mL倒入直径85mm的无菌培养皿内。在该培养皿的中央接种直径为5mm的黑胫病菌菌饼，该黑胫病菌菌饼取自燕麦片琼脂培养基上培养4d的烟草黑胫病菌菌落边缘。接种后将培养皿置于28℃黑暗恒温培养箱中培养，每24h后十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长的抑制率，抑制率达到60％认为发酵液有生物活性。