CN114480245B - 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用 - Google Patents

一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114480245B
CN114480245B CN202210053325.0A CN202210053325A CN114480245B CN 114480245 B CN114480245 B CN 114480245B CN 202210053325 A CN202210053325 A CN 202210053325A CN 114480245 B CN114480245 B CN 114480245B
Authority
CN
China
Prior art keywords
penicillium
sclerotium
culture
fermentation
solid fermentation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210053325.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480245A (zh
Inventor
颜健
宋嘉仪
齐是
黎平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN202210053325.0A priority Critical patent/CN114480245B/zh
Publication of CN114480245A publication Critical patent/CN114480245A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480245B publication Critical patent/CN114480245B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/36—Penicillium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用。该方法包括如下步骤：(1)将菌核青霉接种到PDA培养基平板上进行活化培养；(2)将活化后的菌核青霉菌株的气生菌丝加入到表面活性剂溶液中，混匀后接种到PDB液体培养基中进行发酵培养，得到菌核青霉发酵液；(3)将菌核青霉发酵液倒入装有固体发酵培养基干培养料的可密封培养袋中，于密封、25～27℃条件下发酵培养3～5天；然后将可密封培养袋的封口打开，继续发酵培养5～7天，得到菌核青霉孢子；最后悬浮固体发酵培养基并过滤离心、冷干可获得菌核青霉孢子粉。本发明方法操作简便，通过闭口与敞口的调整诱导菌核青霉迅速产生大量孢子，适合规模化生产及应用。

Description

一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，特别涉及一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用。
背景技术
生物农药一般是指自然界中存在的生物活体，如细菌、真菌、病毒等微生物或其产生的具有防治农业病、虫、草、鼠害作用的生物活性物质。相比化学农药对环境的污染与对农业生态系统平衡的破坏，生物农药具有以下三点明显优势：第一，选择性强，只作用于病虫害，对人、畜及农作物安全；第二，病虫害不易对其产生抗性；第三，生产方便，许多农副产品都可以作为原料，且采用普通发酵设备就能生产。随着生态农业和有机农业市场的不断发展，国内外愈发重视生物农药的研制和使用。
菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)属子囊菌门(Ascomycota)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌目(Eurotiales)，毛刷囊菌科(Trichocomaceae)，青霉属(Penicillium)，其菌落呈橘红色，分生孢子梗有横隔，顶端生有扫帚状分生孢子头，进行无性繁殖，产生近椭圆形分生孢子，孢子颜色为灰绿色。该菌于1935年首次从空气中分离得到，在环境中广泛存在，包括海洋、河流、土壤等。它可以提高作物的生物利用度，延缓衰老进程，促进植物生长，还可以强烈抑制植物寄生线虫与青枯菌，并对植物安全，是一种有效的生防真菌。
孢子粉剂是生物农药的重要形式，有助于推广应用，固体发酵符合上述要求，它指在没有或者只有少量自由水的存在下，在满足微生物生长代谢需求且具备一定湿度的固态营养基质中，进行一种或多种微生物发酵的过程。与传统的深层液体发酵工艺相比，固态发酵具有培养基含水量低，所需反应器体积小，产物浓度高，产品纯化费用低，无废水排放，污染物较少(属于清洁生产技术)，所需能耗少，培养基来源广泛等优势。但采用现有的常规固体发酵方法，存在孢子产量低、生产周期长，难以规模化生产的缺陷。因此，菌核青霉亟待一种操作简便、能控制杂菌污染、可保证孢子质量及产量、生产周期较短、成本较低的生产方法。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种菌核青霉固体发酵产孢方法。
本发明的另一目的在于提供所述菌核青霉固体发酵产孢方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种菌核青霉固体发酵产孢方法，包括如下步骤：
(1)菌核青霉的活化
将菌核青霉接种到PDA培养基平板上，于10～40℃条件下进行活化培养；
(2)液体发酵培养
将步骤(1)中活化后的菌核青霉菌株的气生菌丝加入到表面活性剂溶液中混合均匀，然后接种到PDB液体培养基中，于100～220rpm，20～30℃条件下进行发酵培养，得到菌核青霉发酵液；
(3)固体发酵培养和孢子诱导
将步骤(2)中得到的菌核青霉发酵液倒入装有固体发酵培养基干培养料的可密封培养袋中，于密封、25～27℃条件下发酵培养3～5天(闭口培养)，使菌丝长满固体发酵培养基；然后将可密封培养袋的封口打开，继续发酵培养5～7天(后期敞口培养)，发酵期间每天揉搓菌块，防止成团，得到菌核青霉孢子；其中所述的固体发酵培养基干培养料为大米、玉米、小麦、糙米、稻壳、麦壳和微生物菌肥中的至少一种。
步骤(1)中所述的活化培养的温度优选为20～30℃；更优选为25～27℃。
步骤(1)中所述的菌核青霉优选为菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)SCAUMCX01。
步骤(1)中所述的PDA培养基的配方如下：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0。
步骤(1)中所述的活化培养的时间优选为5～7天。
步骤(2)中所述的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80中的至少一种；菌落上有时会产生孢子，虽然菌核青霉孢子亲水，但为了混合更均匀，可加入表面活性剂；优选为Tween80。
步骤(2)中所述的表面活性剂溶液的浓度优选为体积百分比1‰。
步骤(2)中所述的表面活性剂溶液的用量为按每克菌核青霉菌株的气生菌丝0.8～1mL表面活性剂溶液计算。
步骤(2)中所述的混合均匀可采用剧烈振荡的方式混合均匀。
步骤(2)中所述的PDB液体培养基的配方如下：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，补充蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0。
步骤(2)中所述的发酵培养的转速优选为150r/min。
步骤(2)中所述的发酵培养的温度优选为25～27℃。
步骤(2)中所述的发酵培养的时间优选为3天以上。
步骤(3)中所述的固体发酵培养基干培养料优选为大米。
步骤(3)中所述的固体发酵培养基干培养料的用量为按每克固体发酵培养基干培养料配比0.15～0.35mL菌核青霉发酵液计算；优选为每个可密封培养袋的固体发酵培养基干培养料的重量≤600g，发酵液按0.15～0.35mL/g添加。
步骤(3)中所述的可密封培养袋优选为食用菌培养袋。
步骤(3)中所述的装有固体发酵培养基干培养料的可密封培养袋为经过灭菌处理后的可密封培养袋；优选为通过如下步骤获得：将固体发酵培养基干培养料装入可密封培养袋中，121℃灭菌20min，冷却，得到装有固体发酵培养基干培养料的可密封培养袋。
步骤(3)中所述的发酵培养可在泡沫箱、培养箱或培养室等中静置培养。
步骤(3)中所述的闭口培养3～5天：过早结束闭口，固体发酵培养基还未被菌核青霉菌落完全占据，没有形成种群优势，容易被杂菌污染；时间太长也没有必要，会拖慢生产周期；敞口培养5～7天：过早收获，孢子产量还未达到峰值，损失产量；过晚收获，孢子会因成熟时间过久，活力下降，且易产生杂菌污染。
步骤(3)中所述的发酵培养(闭口培养)的时间优选为5天。
步骤(3)中所述的继续发酵培养(敞口培养)的时间优选为6天。
所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，在步骤(3)之后，还包括如下步骤：
(4)分离菌核青霉孢子粉
将步骤(3)中得到的菌核青霉孢子(孢子与固体发酵培养基的混合物)加入到表面活性剂溶液中，搅拌悬浮孢子，过滤，离心、取沉淀，冷冻干燥，得菌核青霉孢子粉。
步骤(4)中所述的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80中的至少一种；优选为Tween80。
步骤(4)中所述的表面活性剂溶液的浓度优选为体积百分比1‰。
步骤(4)中所述的表面活性剂溶液的用量为按每60～120g孢子与固体发酵培养基的混合物配比1L表面活性剂溶液计算；优选为每60g孢子与固体发酵培养基的混合物配比1L表面活性剂溶液计算。
步骤(4)中所述的过滤为采用纱布进行过滤；优选为采用双层纱布进行过滤。
步骤(4)中所述的离心的条件优选为：5000g离心30s。
所述的菌核青霉固体发酵产孢方法在制备菌核青霉孢子或孢子粉中的应用。
所述的菌核青霉固体发酵产孢方法在制备生物农药制剂中的应用。
所述的生物农药包括菌核青霉孢子粉剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用液固双相法生产菌核青霉分生孢子粉，具体为：将菌核青霉菌株置于固体培养基平板上，培养，活化；然后将菌核青霉液体发酵培养，制备种子液；将固体发酵培养基装入容器并灭菌，冷却后，将种子液接种到固体发酵培养基中搅拌均匀后闭口静置培养，直至菌丝覆盖固体培养基；然后将菌核青霉敞口培养，诱导菌核青霉迅速产生大量孢子(定期揉搓，防止产生菌块)；悬浮固体发酵培养基并过滤离心、冷干获取菌核青霉孢子粉。
(2)本发明产孢周期为18～20天，通过闭口与敞口的调整，诱导菌核青霉迅速产生大量孢子，相较于全程闭口固体发酵，该方法悬浮离心冷干后所得孢子重量可提升2～3倍，血球计数板所测孢子数量可提升9倍左右。
(3)本发明使用发酵液为固体培养阶段提供湿度，省略固体发酵培养基前期浸水的传统做法，提高生产效率，后期敞口发酵，诱导菌核青霉迅速产生大量孢子，避免持续闭口发酵的传统做法对该菌株产孢的抑制作用，该方法操作简便，适合规模化生产及应用。
附图说明
图1是菌核青霉SCAUMCX01PDA平板活化示意图；其中，A为平板正面；B为平板反面。
图2是本发明设计的液体培养方式示意图。
图3是闭口培养和敞口培养、及培养后的固体发酵产物加水所得孢子悬浮液的效果示意图；其中，A为闭口培养5天的效果示意图，之后将第一排(上排)5袋继续闭口，作为对照组，第二排(下排)5袋敞口培养，作为处理组；B为A中敞口6天后，对照组(上排)与处理组(下排)的效果示意图；C为处理组、对照组每袋取30g固体发酵产物，加入500mL纯水搅拌所得孢子悬浮液的效果示意图。
图4是固体发酵培养基显微观察到的菌核青霉SCAUMCX01的孢子情况图；其中，A为固体发酵培养基显微观察到的菌核青霉SCAUMCX01有隔分生孢子梗与扫帚状分生孢子头；B为固体发酵培养基显微观察到的菌核青霉SCAUMCX01有近椭圆形分生孢子。
图5是固体发酵生产的新鲜孢子涂板培养示意图；其中，A为PDA培养基平板A；B为PDA培养基平板B。
图6是菌核青霉SCAUMCX01分离后-80℃储藏3个月的孢子(对应处理组敞口1)涂板培养示意图；其中，A为平板正面；B为平板反面。
图7是全程闭口培养(对照组)及前期闭口、后期敞口培养(处理组)的孢子产量对比柱状图(每袋固体发酵干料为200g)。
图8是菌核青霉SCAUMCX01在各类固体发酵培养基中的效果对比图(条件均为5g材料，0.5mL菌液，培养20d)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均自常规生化试剂厂家购买得到，未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。
本发明实施例中涉及的菌核青霉来源于马齿苋菌核青霉(Penicilliumsclerotiorum)SCAUMCX01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60249，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年10月11日。该菌株已在中国专利(申请号：201711279355.9，名称：马齿苋菌核青霉及其在制备抗青枯菌药物中的应用)中公开。
本发明实施例中涉及的培养基的组分及配比如下：
PDA培养基的组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
PDB液体培养基的组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，补充蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例1菌核青霉固体发酵产孢
一种菌核青霉固体发酵产孢方法，包括以下步骤：
1、菌核青霉SCAUMCX01的活化
使用无菌牙签接种菌核青霉SCAUMCX01菌株至PDA培养基平板上，于25～27℃条件下培养5～7d进行活化；平板活化示意图如图1所示。
2、菌核青霉SCAUMCX01的液体发酵培养
使用药匙刮下平板表面已活化的菌核青霉SCAUMCX01菌株的气生菌丝(使用90mm培养皿，每板气生菌丝约为45mg)，加入到装有40mL浓度为1‰(体积百分比)的Tween80溶液的50mL离心管中，剧烈振荡混匀，然后全部接种于装有1L PDB液体培养基的2L三角瓶(带挡板)，于150r/min，25～27℃条件下振荡培养3d，备用；液体培养方式示意图如图2所示。
3、菌核青霉SCAUMCX01的固体发酵培养
将固体发酵培养基干培养料大米(本实验采用常规市售大米，为节约成本起见，也可以换成常规市售散装大米或陈米)放入食用菌培养袋，每袋200g，装取10袋(200g固体发酵干培养基，发酵液可按0.15～0.35mL/g添加)。121℃灭菌20min后，置于超净工作台上紫外照射，并打开吹风冷却，之后每袋倒入50mL菌核青霉SCAUMCX01发酵液，混合均匀，双套环封口，于25～27℃条件下，在培养箱中静置培养3～5天(本实验培养了5天)，使菌丝长满固体发酵培养基；其中，静置培养3天后，每天揉搓菌块，防止成团。
4、菌核青霉SCAUMCX01的孢子诱导
从上述固体发酵培养的食用菌培养袋中取5袋，去除菌袋双套环，敞口培养，作为处理组，其余5袋，保持闭口培养状态，作为对照组。继续发酵5～7天(本实验培养了6天)，期间每天揉搓菌块，防止成团。孢子诱导效果示意图如图3A和3B所示。
5、菌核青霉SCAUMCX01孢子分离、测产
称量各袋固体发酵培养基质量(即菌袋内所有物质(培养基、菌丝、孢子)的总质量)，之后每袋取30g，按60g/L的比例，与500mL浓度为1‰(体积百分比)的Tween80溶液混合，搅拌悬浮孢子(图3C)，双层纱布过滤，量取各袋孢子悬浮液体积。取2mL孢子悬浮液母液，加入18mL纯水，制得10×稀释液，如此依此稀释为100×，1000×稀释液，选择合适浓度进行血球计数板计数。各袋孢子悬浮液使用唯一对应离心管，标记各离心管并称取质量，5000g/30s离心悬浮液取沉淀，冷冻干燥3d(冷阱温度-50℃，上层存放的样品温度25～30℃)得孢子粉，称量离心管及孢子粉总质量。三次重复。
显微镜下观察孢子情况，观察结果如图4所示：可以看到菌核青霉SCAUMCX01有隔分生孢子梗与扫帚状分生孢子头(图4A)，以及有近椭圆形分生孢子(图4B)。
测产结果如图7和表1所示：结果显示，处理组(前期闭口、后期敞口培养)悬浮、离心、冷干后所得孢子平均重量为对照组(全程闭口培养)的2.585倍，血球计数板所测孢子平均数量为对照组的8.908倍，重量与数量的不一致与悬浮液中含有一定比例的淀粉颗粒有关。经Welch T检验，孢子重量p值为0.004959，孢子数量p值为0.00148，差异具有统计意义。其中，
本实验血球计数法使用汤麦式血球计数板(另有希利格式)，1个大方格容积为0.1mm3，包含25个中方格，其计数区域为其中5个中方格。计数测产时，获得的原始数据为5个中方格内的孢子数。为确保严谨，对同一孢子悬浮液样品三次取样检测，作为三组技术重复，将结果命名为“5个中方格技术重复1～3”(表1)。
表1 实施例对比试验中对照组、处理组测产原始数据
6、固体发酵生产的新鲜孢子的萌发情况
取步骤4中处理组(敞口1)中收获的新鲜孢子(直接取敞口1中少量固体发酵产物(附着大量孢子的米粒))在超净工作台分别放置于2个PDA培养基平板A和B上，盖盖后用手晃动，翻滚固体培养基颗粒，使孢子均匀涂布于平板上。在生化培养箱26℃培养3天。结果如图5所示：平板A、B均长满菌核青霉橙红色菌落(图5A和5B分别对应于平板A、B)。
7、-80℃储藏3个月的孢子的萌发情况
在超净工作台上，从步骤6中的PDA培养基平板上分离悬浮菌液，离心冷干获得孢子粉，放入-80℃储藏。然后将-80℃储藏3个月后处理组(敞口1)分离得到的冷干冻存孢子粉5mg均匀涂布于PDA平板上。在生化培养箱26℃培养4天后，板上长满菌核青霉橙红色菌落。结果如图6所示：图6A为平板正面，图6B为平板反面。
实施例2菌核青霉SCAUMCX01在各类固体发酵培养基中的效果对比
按实施例1步骤1和2的方法进行菌核青霉SCAUMCX01的活化和液体发酵培养，然后再进行固体发酵培养，具体步骤如下：
1)准备好适量的以下材料：超纯水、PDB培养基(PDB培养液，购于广东环凯微生物科技有限公司)、大米、玉米粒(玉米)、小麦、糙米、稻壳、麦壳。每种材料的用量是5g。
2)上述共8种材料，每个材料三组重复，将24个50ml锥形瓶进行标号。
3)称取上述材料每种5g放入对应的50ml锥形瓶中，加入5ml超纯水，将上述放好的材料用封口膜封好，一共24个50ml锥形瓶。
4)然后将步骤2)～4)中获得的共24个锥形瓶、移液枪头和离心管放入灭菌锅中121摄氏度下灭菌20min。
5)将超净工作台喷好酒精，放入移液枪和实验专用框，紫外线照射20min。取出灭菌的材料，关掉超净工作台紫外线，开吹风功能，戴好手套喷点酒精，放入材料待冷至30摄氏度。
6)取出备好的菌核青霉菌液，分别加入到24个50ml锥形瓶中，每个0.5ml。重新封好封口膜时要在酒精灯上烤一下瓶口。将24个锥形瓶放入28.5摄氏度培养箱培养，收拾好超净工作台离开。
7)20天后将以上材料重新拿到超净工作台上(如图8)，加入无水乙醇10ml，超声取样1.5ml样品液，放入负40摄氏度冰箱备测。过滤好采用测样，分析数据。
8)Pencolide的测定及数据分析方法：因为pencolide是菌核青霉中的活性物质之一，所以样品中Pencolide含量来反应菌核青霉在各种培养基质中的生产状况(表2)。本实验采用的数据测量法是LC-MS法，该方法中液相色谱-串联质谱采用外标-标准曲线法定量测定：色谱柱为Waters BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)；柱温为40℃；流速为0.3m L/min；进样体积为4μL。离子源为电喷雾离子源(ESI)；扫描方式为正离子模式；离子源温度为550℃；CUR为35psi；IS为5 500V；GS1为60psi；GS2为50psi。检测方式为多重反应监测MRM模式。本实验采用spss10.0软件进行数据分析，计算显著性与标准差。
表2 不同培养基质中活性物质pencolide的含量(ppb)
基质 均值±标准误
大米 65897.99±407.13
玉米 57690.76±285.90
糙米 40080.39±295.47
PDB 21736.12±1398.03
小麦 34710.64±170.90
稻壳 151.67±0.42
麦壳 129.58±0.59
水 30.18±0.50
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌核青霉的活化
将菌核青霉接种到PDA培养基平板上，于10～40℃条件下进行活化培养；
（2）液体发酵培养
将步骤（1）中活化后的菌核青霉菌株的气生菌丝加入到表面活性剂溶液中混合均匀，然后接种到PDB液体培养基中，于100～220rpm，20～30℃条件下进行发酵培养，得到菌核青霉发酵液；
（3）固体发酵培养和孢子诱导
将步骤（2）中得到的菌核青霉发酵液倒入装有固体发酵培养基干培养料的可密封培养袋中，于密封、25～27℃条件下发酵培养3～5天，使菌丝长满固体发酵培养基；然后将可密封培养袋的封口打开，继续发酵培养5～7天，发酵期间每天揉搓菌块，防止成团，得到菌核青霉孢子；其中所述的固体发酵培养基干培养料为大米、玉米、小麦和糙米中的至少一种；
步骤（1）中所述的菌核青霉为菌核青霉（Penicillium sclerotiorum）SCAUMCX01，保藏编号为GDMCC No.60249；
步骤（3）中所述的固体发酵培养基干培养料的用量为按每克固体发酵培养基干培养料配比0.15～0.35 mL菌核青霉发酵液计算。
2.根据权利要求1所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于：
步骤（3）中所述的固体发酵培养基干培养料为大米；
步骤（3）中所述的发酵培养的时间为5天；
步骤（3）中所述的继续发酵培养的时间为6天。
3.根据权利要求1所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于：
步骤（2）中所述的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80中的至少一种；
步骤（2）中所述的表面活性剂溶液的浓度为体积百分比1‰；
步骤（2）中所述的表面活性剂溶液的用量为按每克菌核青霉菌株的气生菌丝0.8～1mL表面活性剂溶液计算。
4.根据权利要求1所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的活化培养的温度为20～30℃；
步骤（1）中所述的活化培养的时间为5～7天；
步骤（2）中所述的发酵培养的转速为150r/min；
步骤（2）中所述的发酵培养的温度为25～27℃；
步骤（2）中所述的发酵培养的时间为3天以上；
步骤（3）中所述的可密封培养袋为食用菌培养袋。
5.根据权利要求1所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于，在步骤（3）之后还包括如下步骤：
（4）分离菌核青霉孢子粉
将步骤（3）中得到的菌核青霉孢子加入到表面活性剂溶液中，搅拌悬浮孢子，过滤，离心、取沉淀，冷冻干燥，得菌核青霉孢子粉。
6.根据权利要求5所述的菌核青霉固体发酵产孢方法，其特征在于：
步骤（4）中所述的表面活性剂为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80中的至少一种；
步骤（4）中所述的表面活性剂溶液的浓度为体积百分比1‰；
步骤（4）中所述的过滤为采用纱布进行过滤；
步骤（4）中所述的离心的条件为：5000g离心30s。
7.权利要求1～6任一项所述的菌核青霉固体发酵产孢方法在制备菌核青霉孢子或孢子粉中的应用。
8.权利要求1～6任一项所述的菌核青霉固体发酵产孢方法制备的菌核青霉孢子或孢子粉在制备生物农药制剂中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的生物农药为菌核青霉孢子粉剂。
CN202210053325.0A 2022-01-18 2022-01-18 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用 Active CN114480245B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210053325.0A CN114480245B (zh) 2022-01-18 2022-01-18 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210053325.0A CN114480245B (zh) 2022-01-18 2022-01-18 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480245A CN114480245A (zh) 2022-05-13
CN114480245B true CN114480245B (zh) 2023-09-05

Family

ID=81511603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210053325.0A Active CN114480245B (zh) 2022-01-18 2022-01-18 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480245B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1563348A (zh) * 2004-04-16 2005-01-12 浙江省农业科学院 蝉拟青霉新菌株apc－20及其人工培养发酵方法
CN1614003A (zh) * 2004-10-30 2005-05-11 浙江省农业科学院 蝉拟青霉新菌株的人工培养及其镇痛化合物的提取与利用
CN102286385A (zh) * 2011-09-19 2011-12-21 福建省林业科学研究院 一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法
CN103320327A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 华中农业大学 一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用
CN105039414A (zh) * 2015-03-25 2015-11-11 中国农业科学院烟草研究所 一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法
CN105695346A (zh) * 2016-04-25 2016-06-22 北京市农林科学院 一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用
CN109355205A (zh) * 2018-11-28 2019-02-19 华南农业大学 菌核青霉在制备植物生长调节剂或诱导剂中的应用
CN109370913A (zh) * 2018-11-15 2019-02-22 云南农业大学 一种玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法
CN113215003A (zh) * 2021-06-02 2021-08-06 鹤壁市禾盛生物科技有限公司 一种淡紫拟青霉的固体发酵培养方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1563348A (zh) * 2004-04-16 2005-01-12 浙江省农业科学院 蝉拟青霉新菌株apc－20及其人工培养发酵方法
CN1614003A (zh) * 2004-10-30 2005-05-11 浙江省农业科学院 蝉拟青霉新菌株的人工培养及其镇痛化合物的提取与利用
CN102286385A (zh) * 2011-09-19 2011-12-21 福建省林业科学研究院 一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法
CN103320327A (zh) * 2012-03-20 2013-09-25 华中农业大学 一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用
CN105039414A (zh) * 2015-03-25 2015-11-11 中国农业科学院烟草研究所 一种防治烟草黑胫病的青霉菌发酵液及其制备方法
CN105695346A (zh) * 2016-04-25 2016-06-22 北京市农林科学院 一株毒杀植物寄生线虫的菌核青霉及其制备方法和应用
CN109370913A (zh) * 2018-11-15 2019-02-22 云南农业大学 一种玫烟色棒束孢wswl21837菌株孢子粉生产方法
CN109355205A (zh) * 2018-11-28 2019-02-19 华南农业大学 菌核青霉在制备植物生长调节剂或诱导剂中的应用
CN113215003A (zh) * 2021-06-02 2021-08-06 鹤壁市禾盛生物科技有限公司 一种淡紫拟青霉的固体发酵培养方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480245A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109609387B (zh) 一种松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola的快速培养方法
CN102864114B (zh) 一种恩拉霉素高产菌株及其制备方法和应用
CN108220172A (zh) 高产虫草素的蛹虫草突变株及应用
CN109082396B (zh) 一种dsf群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用
CN102286378B (zh) 一种抑制黄曲霉生长及降解黄曲霉毒素的复合益生菌及其应用
CN110396485B (zh) 产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用
CN106865804B (zh) 一种中生菌素母药清洁生产方法
CN111378595B (zh) 一种伯克氏农业生防菌株Ba1及其用途
CN106520595B (zh) 一种节杆菌及其在生物防治番茄青枯病方面的应用
CN114480245B (zh) 一种菌核青霉固体发酵产孢方法及其应用
CN114196580B (zh) 一种淡紫灰链霉菌海南变种菌株及利用其制备中生菌素制品的方法
CN114317670A (zh) 一种筛选培养基及其制备方法和应用
CN113322192B (zh) 一种黄精内生真菌抑制大肠杆菌剂及其制备方法和应用
CN115651846A (zh) 一种木霉菌剂、生物有机肥及其制备方法及应用
CN115806913A (zh) 野尻链霉菌（Streptomyces nojiriensis）菌株9-13及应用
CN110591921A (zh) 一种木霉菌液体发酵的厚垣孢子及其制备方法
CN112094755B (zh) 一种草酸青霉hy181-2、制备方法及其用途
CN115747130A (zh) 一种促进莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基及其制剂和应用
CN106085880B (zh) 一种黑粉菌的分离方法及所用培养基
CN1163617C (zh) 一种发酵法生产阿维菌素的新工艺
CN112457997B (zh) 一种木霉菌固体发酵的方法
CN109401990B (zh) 一株具有抑菌活性的酿酒酵母菌hkb-36及其应用
CN114214205B (zh) 牛樟芝共生真菌AcEF007及其分离方法
CN114507607B (zh) 一株淡水真菌及其次级代谢产物和应用
CN114703069B (zh) 一种黑附球菌发酵产物、制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Yan Jian

Inventor after: Song Jiayi

Inventor after: Qi Shi

Inventor after: Li Ping

Inventor before: Yan Jian

Inventor before: Qi Shi

Inventor before: Song Jiayi

Inventor before: Li Ping

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant