CN103320327A - 一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用，其步骤：A、淡紫拟青霉PL461的活化：将淡紫拟青霉PL461菌株置于PDA培养基平板上，培养，活化；B、淡紫拟青霉PL461的液体发酵培养：将活化的淡紫拟青霉PL461菌株转入装有PDB和Czapek’s液体培养基的三角瓶中，振荡培养，备用；C、淡紫拟青霉PL461的固体发酵培养：将固体发酵培养基干培养料米糠、玉米粉和水按照体积比混合均匀，装入食用菌培养袋，灭菌，冷却后，采用培养皿发酵法将淡紫拟青霉PL461的发酵菌液接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀后转入培养皿，培养，备用；D、将固相培养物按照配方和方法制成淡紫拟青霉菌剂。对线虫卵具有明显致死作用，设备简单，大大降低了生产成本，适宜于淡紫拟青霉的规模化生产。

Description

一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉，还涉及一种淡紫拟青霉的培养方法，同时还涉及一种淡紫拟青霉在防治禾谷孢囊线虫病药物中的应用。

背景技术

小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)主要侵染旱地禾本科植物，引起的禾谷孢囊线虫病(Cereal Cyst Nematode，简称CCN)自1874年在德国首先发现以来，现已广泛分布于5大洲超过40个小麦生产国发生并带来了危害，我国受禾谷孢囊线虫危害的小麦面积也已超过300万公顷。由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种质资源，禾谷孢囊线虫病仍然是农业生产中的世界性难题。目前多采用化学杀线虫剂防治该病，如用35％呋喃丹种衣剂、10％克线磷颗粒剂或神农丹，控制其初浸染于早期，防病效果较为理想。由于杀线虫剂的长期大面积使用，给人畜造成毒害作用，同时在土壤中难以降解使线虫产生抗药性等。同时需要关注的是食品安全和环境污染问题，食品安全问题往往是国际农产品贸易壁垒中的筹码，要参与国际竞争，也必需贯彻绿色植保。因此，农药防治应十分慎重，生产上急切需要建立安全持久的防控技术体系。利用真菌防治植物线虫病害是安全持久的防控技术体系的重要组成部分。

淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)属半知菌亚门(Deuteromyeotina)、丝孢纲(HypHomyeetes)、丝孢目(HypHomycetales)、丛梗孢科(Monilaeeae)、拟青霉属(Paecilomyces)，该属主要特征是分生孢子梗呈瓶状或近球形(瓶梗)，在菌丝端或短枝上轮生，分生孢子单孢链状，至今该属报道有近50个种，皆为昆虫病原菌和线虫病原菌。由于淡紫拟青霉是多种植物线虫的寄生真菌，使其成为是一种有效的生防真菌。

同时由于淡紫拟青霉菌剂具有不污染环境、生产原料来源丰富、对人畜无害、靶标生物不容易产生抗药性等优点，其制剂的研究与生产备受世人的关注。菲律宾亚州技术中心已将淡紫拟青霉商品化，以“BIOCON”出售这种真菌制剂，在秘鲁、美国、巴基斯坦用于防治马铃薯线虫效果显著。我国也采用液体、固体发酵技术工业化生产商品制剂，在黑龙江、云南、江苏等地防治大豆孢囊线虫和南方根结线虫效果显著，并筛选淡紫拟青霉菌优良菌株进行开发利用，生产商品制剂。但是自然筛选的菌株寄生率不高，剂型开发效果不好，生防机制等还不清楚，菌剂的防效果偏低，限制了该菌的开发利用。因此，高效生产淡紫拟青霉菌剂并提高淡紫拟青霉在田间的定殖与防效是商业化应用的关键。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)。以野生型淡紫拟青霉36-1菌株为出发菌株，通过紫外诱变获得耐药性稳定、产孢量大的突变株PL461，并连续继代培养10代进行耐受性驯化，即为目的菌株，申请人将其命名为淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461(保藏号CCTCC NO.M2012049，本说明书中的PL461皆指淡紫拟青霉PL461)。本发明筛选的淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461菌株对禾谷孢囊线虫胚胎时期卵和含幼虫的混合卵粒接种第10天，寄生率高达61.01％，并维持在此寄生水平，可以作为禾谷孢囊线虫病的防治和微生物菌剂的候选菌株。本发明的微生物菌剂对禾谷孢囊线虫等植物线虫病害具有良好的生防效果。

本发明的另一个目的是在于提供了一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)的培养方法。该方法以干培养料米糠、玉米粉和水为固体培养基，装入食用菌培养袋，灭菌后接种菌液发酵培养，再采用小型颗粒机造粒，实现了淡紫拟青霉的规模化生产，其工艺简单，操作易行。

本发明的再一个目的是在于提供了一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)在制备治疗或预防禾谷孢囊线虫病药物中的应用。筛选一株对小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)引起的禾谷孢囊线虫病(Cereal Cyst Nematode，简称CCN)具有显著生物防治效果的真菌菌株，并通过液、固双相发酵培养方法进行规模化生产，将其开发为多种作物线虫病害生物防治的微生物菌剂。该菌剂为白色圆柱状物，直径为1mm，长度为0.3～2.5cm，含有效成分为12％，含水量为1.57％，崩解性为2min36s，堆积密度为0.337g/ml，粒度为25～35目筛，含98.74％颗粒剂，货架期大于半年。该菌剂可以有效控制禾谷孢囊线虫的危害。申请人进行田间试验表明在收获期土壤中，应用100kg/ha的该菌剂处理的土壤中小麦孢囊数量减少59.82％，孢囊数量明显减少，防效明显高于化学药剂神农丹。为了实现以上目的，本发明采用如下技术措施：

一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461的获得：

以野生型淡紫拟青霉36-1菌株(付艳平，1998年，华中农业大学学报)为出发菌株，一种分离筛选的对禾谷孢囊线虫病有防治作用的淡紫拟青霉菌，通过紫外诱变获得目的菌株，申请人将其命名为淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461。该淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461于2012年3月9日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO.M2012049，分类命名：淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461。

一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)的培养方法，其步骤是：

1、淡紫拟青霉PL461的活化：将淡紫拟青霉PL461菌株置于PDA培养基平板上，于26～28℃条件下培养5～9d，活化；

2、淡紫拟青霉PL461的液体发酵培养：将活化的淡紫拟青霉PL461菌株取直径为1cm分别接种于装有100ml PDB和Czapek’s液体培养基的250ml的三角瓶中，于160r/min，25～27℃条件下振荡培养，备用；

3、淡紫拟青霉PL461的固体发酵培养：将固体发酵培养基干培养料米糠、玉米粉和水按照体积比为3∶3∶4混合均匀，装入食用菌培养袋，121℃灭菌1～2h，冷却后，采用培养皿发酵法将步骤2的淡紫拟青霉PL461的发酵菌液接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀后，每个培养皿(直径为15cm)装入70～80g培养物转入直径为15cm的培养皿，26～28℃下培养5～9d，备用；

4、将步骤3中固相培养物按照以下配方和方法制成淡紫拟青霉菌剂：

颗粒菌剂PLC：60g培养物，7.5％(质量体积比，下同)明胶240ml，0.5ml吐温20，200g硅藻土。200g硅藻土加60g培养物，混均匀，过筛，再加7.5％明胶240ml捏合均匀，通过颗粒机造粒，颗粒剂在自然室温下风干。常温(20～25℃)避光条件下，可放置半年以上。

其中：所述的PDA培养基的组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的PDB培养基组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min。

所述的Czapek’s培养基组分及配比为：NaNO₃2g，K₂HPO₄1g，KCl 0.5g，MgSO₄0.5g，FeSO₄0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000ml。

通过液、固发酵培养方法制备的培养物，再按以上步骤3中的配方制成的淡紫拟青霉颗粒菌剂PLC。该菌剂于2012年3月9日已在武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号CCTCC NO.M2012049，分类命名：淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461。

淡紫拟青霉PL461的菌学特征：

淡紫拟青霉PL461在含多菌灵终浓度为30.0μg/ml的PSA平板上生长时，菌落隆起表面均呈淡紫色，富生粉质状的分生孢子。随着培养时间的延长，菌落表面颜色渐变为深紫色；背面中心炒米黄色，边缘渐白色。PL461菌株日平均生长速度为5.06mm；以数量级为10⁶个/ml的孢子液均匀涂布平板的产孢量为4.84×10⁷个/皿；菌株处理8h后孢子开始萌发；处理10h，PL461为78.98％，萌发率较高；12～13小时后，萌发逐渐完全，萌发率接近100％。

一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)在制备治疗或预防禾谷孢囊线虫病药物中的应用：其步骤是：

将活化的淡紫拟青霉PL461接种到装有PDB和Czapek’s液体培养基的250ml的三角瓶中振荡培养。再将PL461液体发酵菌液接种到灭菌的固体发酵培养基(米糠、玉米粉和水按照体积比为3∶3∶4混合均匀)上培养，搅拌均匀后定量转入培养皿培养7d；最后将固相培养物按照一定配方和方法(60g培养物，7.5％明胶240ml，0.5ml吐温20，200g硅藻土。200g硅藻土加60g培养物，混均匀，过筛；再加7.5％明胶240ml捏合均匀，通过颗粒机造粒，颗粒在自然室温下风干。)制成淡紫拟青霉菌剂PLC。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明筛选的淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461菌株可以明显寄生禾谷孢囊线虫卵及孢囊，对线虫卵具有明显致死作用，具有广泛的潜在开发价值；

2、采用本发明的淡紫拟青霉菌剂可以有效防治禾谷孢囊线虫病。100kg/ha淡紫拟青霉颗粒菌剂PLC处理小麦苗期和生长后期(抽穗至扬花期)的防效分别为57.25％和40.22％，收获后，土壤中孢囊数量减少59.82％，与神农丹相比，防效明显最好。

3、采用本发明的淡紫拟青霉液、固双相发酵培养法，液体发酵培养中，PDB和Czapek’s两种液体发酵培养基培养效果较优。用于固体发酵时，PDB液体培养，固相发酵12d孢子量可达7.28×10⁹个/g；Czapek’s液体培养，固相发酵12d孢子量可达6.99×10⁹个/g。而在其他液体培养基中菌丝球大小、菌丝球数量、菌丝球干重、液体种子的澄清度等影响产孢的综合指标均不如PDB和Czapek’s培养基。

4、通过对淡紫拟青霉颗粒菌剂的不同载体、粘合剂等组份进行筛选，筛选出对淡紫拟青霉影响较小的助剂，硅藻土或膨润土为载体，明胶或黄原胶为粘合剂，一定浓度的吐温80或木质素磺酸钠为分散剂，羧甲基淀粉钠作为崩解剂，氯化钙作为助崩解剂，按照一定的比例，用颗粒机造粒。淡紫拟青霉颗粒菌剂PLC在室温条件下，可放置半年以上，其初始菌落形成单位为8.33×10⁷cfu/g，半年后为7.43×10⁷cfu/g，其数量级保持在10⁷。

5、采用本发明的淡紫拟青霉液、固双相发酵培养法，设备简单，只需食用菌培养袋、小型颗粒机和能控温的培养室即可满足生产的需要，无需其他固体发酵方法所需的高压灭菌设备和固态反应器等专用设备。因此大大降低了生产成本，适宜于淡紫拟青霉的规模化生产。

附图说明

图1为一种显示筛选的淡紫拟青霉PL461菌株对禾谷孢囊线虫卵的寄生与致死作用的示意图，表明淡紫拟青霉PL461侵入禾谷孢囊线虫卵内，并造成卵粒内含物溃解。

图2为一种显示筛选的淡紫拟青霉PL461菌株对禾谷孢囊线虫孢囊的寄生的示意图，表明淡紫拟青霉PL461在禾谷孢囊线虫孢囊表面寄生并生长。

图3为一种采用的淡紫拟青霉PL461菌剂液、固发酵情况示意图，图3A为一种本发明设计的液体培养方式示意图；图3B为一种本发明设计的固体培养方式示意图；图3C为一种培养终期形成的含有淡紫拟青霉PL461菌剂的培养物PLC。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。在下面的实施例中，申请人在室内进行淡紫拟青霉菌株PL461对禾谷孢囊线虫卵及孢囊的寄生与致死作用等系统验证试验，同时将制备的微生物菌剂进行禾谷孢囊线虫病的田间防治试验，以确定其对禾谷孢囊线虫病的控制作用；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规培养与分离方法得到。

实施例1：

一种淡紫拟青霉(P.lilacinus)的液、固双相发酵培养方法

其步骤是：

1、淡紫拟青霉PL461菌株的获得

以野生型淡紫拟青霉36-1菌株为出发菌株，该菌株由付艳平、王明祖于1998年《华中农业大学学报》中报道。该菌株通过紫外诱变获得耐药性稳定、产孢量大的突变株PL461，并连续继代培养10代进行耐受性驯化，即为目的菌株，申请人将其命名为淡紫拟青霉(P.lilacinus)PL461。实验表明突变株PL461对禾谷孢囊线虫胚胎时期卵和含幼虫的混合卵粒接种第10天，寄生率高达61.01％，可以作为禾谷孢囊线虫病得防治和微生物菌剂的候选菌株。

2、菌株保藏：本发明的淡紫拟青霉PL461菌株的保藏，按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。

3、淡紫拟青霉PL461的活化：将淡紫拟青霉PL461菌株置于PDA培养基平板上，于26～28℃条件下培养5～9d，活化；

4、淡紫拟青霉PL461的液体发酵培养：将活化的淡紫拟青霉PL461菌株取直径为1cm分别接种于装有100ml PDB和Czapek’s液体培养基的250ml的三角瓶中，于160r/min，26～28℃℃条件下振荡培养，备用；

5、淡紫拟青霉PL461的固体发酵培养：将固体发酵培养基干培养料米糠、玉米粉和水按照体积比为3∶3∶4混合均匀，装入食用菌培养袋，121℃灭菌1～2h，冷却后，采用培养皿发酵法将步骤2的淡紫拟青霉PL461的发酵菌液接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀后定量转入直径为15cm的培养皿，26～28℃下培养5～9d，备用；

6、将步骤5中固相培养物按照以下配方和方法制成淡紫拟青霉菌剂：

颗粒菌剂PLC：60g培养物，7.5％(质量体积比)明胶240ml，0.5ml吐温20，200g硅藻土。200g硅藻土加60g培养物，混均匀，过筛，再加7.5％(质量体积比)明胶240ml捏合均匀，通过颗粒机造粒，颗粒在自然室温下风干。常温(20～25℃)避光条件下，可放置半年以上。

其中：所述的PDA培养基的组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的PDB培养基组分及配比为：马铃薯200g，葡萄糖15～20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min；

所述的Czapek’s培养基组分及配比为：NaNO₃ 2g，K₂HPO₄ 1g，KCl 0.5g，MgSO₄ 0.5g，FeSO₄ 0.01g，蔗糖30g，琼脂15～20g，补充蒸馏水至1000ml。

实施例2：淡紫拟青霉PL461菌株对禾谷孢囊线虫卵及孢囊寄生与致死作用

1、试验和线虫的准备：

本实施例以本申请人筛选的淡紫拟青霉PL461菌株为试验菌株。从湖北襄阳采集的小麦病土样中分离禾谷孢囊线虫孢囊并收集线虫卵粒，表面消毒后作为试验线虫。

淡紫拟青霉PL461菌株的活化条件：26～28℃PDA培养基(配方参考实施例1)平板上，培养5～9d后配制成孢子浓度为7×10⁹孢子液。

禾谷孢囊线虫卵粒及孢囊的收集与分离：采用漂浮筒分离法(参考Kim D G，1994年的分离方法)从湖北襄阳的小麦病土中分离孢囊，采用35％蔗糖离心法收集线虫卵粒(参考杨卫星，2008年收集方法)，备用。

2、实验方法：

淡紫拟青霉PL461对禾谷孢囊线虫卵粒的寄生：取无菌双凹片加60μL WA培养基(配方：琼脂15～18g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30min)于凹片上，冷却凝固后，滴加PL461孢子悬浮液于培养基正中央，于PL461边缘放置已表面消毒的含有不同发育时期(胚胎发育期和卵内幼虫发育期)的线虫卵粒，每个双凹片约有20个线虫卵粒，共接50个双凹片，以只接线虫卵于WA平板为空白对照。26±1℃下黑暗保湿培养，每d挑取卵粒于载玻片无菌水滴中，光学显微镜下观察卵粒被寄生的情况，寄生测定采用乳酸甘油溶液(配方：85％乳酸：99.5％甘油：蒸馏水，按照体积比为2∶2∶1)处理，处理约1min后被侵染的卵透明，未被侵染的卵仍为深色(D G Kim，1994)，拍照并统计寄生率。

淡紫拟青霉PL461对健康褐色孢囊的寄生：将无菌玻璃纸置于1％WA(配方同上)平板上，在平板中央滴加5ul PL461孢子悬浮液，封口培养5d，在其菌落边缘放置已表面消毒的褐色孢囊，封口26±1℃下黑暗培养，每d于显微镜下观察孢囊寄生情况，清洗孢囊外表菌丝和孢子并挤破孢囊，将卵粒进行乳酸甘油和乳酸酚棉兰(配方：乳酸20ml，甘油40ml，苯酚20g，去离子水20ml，混匀以上成分后再加入50mg棉兰染料，再混匀。)处理，重复三次。以未接孢子液的孢囊为对照。在接种后第10d，移除玻璃纸进行扫描电镜样品制备，扫描观察。

实验结果表明，本发明的淡紫拟青霉PL461对禾谷孢囊线虫卵(图1)及孢囊(图2)具有明显的致死及寄生作用。

实施例3：利用淡紫拟青霉PL461菌剂防治禾谷孢囊线虫病的田间试验

为了验证本发明生产的淡紫拟青霉PL461菌剂的防病效果，申请人选择湖北省襄阳市牛首镇小麦发病严重且均匀的地块，根据耕作制度、栽培品种、土壤质地、肥水条件和气象条件，将其分为18个小区，每个小区10m²，进行禾谷孢囊线虫病得田间防治试验。

1、试验药剂：

淡紫拟青霉PL461菌剂：取实施例1中发酵终期的含淡紫拟青霉PL461菌剂PLC的培养物适量，使用量分四种处理：25kg/ha、50kg/ha、75kg/ha和100kg/ha；(ha为面积单位：公顷)

5％涕灭威(又名神农丹，由山东华阳农药化工集团有限公司生产)：使用量为10kg/ha及不施药为对照。

2、试验设计：试验共分18个小区，每小区面积3m×3.5m，随机排列，各重复3次。示范面积总共约180m²。试验设计如下：

处理1：四种不同使用量的淡紫拟青霉PLC菌剂25kg/ha、50kg/ha、75kg/ha和100kg/ha，分别与一定量细干沙土混匀，在小麦播种后撒于播种沟中，然后覆盖土壤，3m×3.5m。

处理2：使用量为10kg/ha的5％涕灭威(神农丹)与一定量细干沙土混匀，在小麦播种后撒于播种沟中，然后覆盖土壤，试验面积3m×3.5m，每个处理重复3次。

对照：不施药的小区为对照，试验面积为3m×3.5m。

3、试验地点的条件：

(1)试验地点选湖北襄阳市牛首镇种植小麦发病严重且均匀的地块，前茬作物为玉米，土质为沙壤土，肥力中等；

(2)试验的小麦品种：供试品种为郑麦9023白(由河南省农科院小麦所许为钢博士主持选育的强筋优质小麦新品种，已通过河南省、湖北省、安徽省和江苏省品种审定)是中度感病品种，按照常规方法播种；

(3)调查取样方法：分小麦苗期和生长后期(抽穗至扬花期)两个时间调查并统计孢囊数量；

①小麦苗期病情调查：每个小区进行随机十点取样，每点取10株，染色调查根内幼虫数，染色方法详见刘维志(1998)，计算病株率和病情指数；

②小麦生长后期(抽穗至扬花期)调查：取样方法与苗期调查一样，将小麦根部洗净后调查每株根部白雌虫数量，同时，收集根围土壤300g，风干后分离该植株根围土壤中的孢囊，合计根系与根围孢囊数，计算病株率和病情指数。

③发病率、病情指数与防效计算方法：

病情指数＝∑(各级发病株数×各病级数)/(调查总株数×最高病情指数)×100

相对防效(％)＝(对照组病情指数一处理组病情指数)/对照组病情指数

发病率＝染病的小麦株数/调查的小麦总株数

4、结果分析：

表1本发明淡紫拟青霉PLC菌剂不同用量对小麦苗期禾谷孢囊线虫病的防效

表2本发明淡紫拟青霉PLC菌剂不同用量对小麦生长后期禾谷孢囊线虫病的防效

表3本发明淡紫拟青霉PLC菌剂不同处理收获期土壤中小麦禾谷孢囊线虫的孢囊数量

说明：防治效果出现的差异是各小区间禾谷孢囊线虫病的自然发生程度的差异

本发明的淡紫拟青霉PL461菌剂PLC在湖北省襄阳市牛首镇18个小区的防治试验结果表明，淡紫拟青霉PL461颗粒菌剂PLC可以有效控制禾谷孢囊线虫的危害。在苗期，施用100kg/ha的PL461菌剂防效为57.25％比神农丹的防效高。在小麦生长后期(抽穗至扬花期)，用量为100kg/ha的PLC防效达40.22％，高于神农丹。同时在收获期土壤中，100kg/ha的PLC处理的土壤中小麦孢囊数量减少59.82％，孢囊数量明显减少。

田间试验结果表明本发明制备淡紫拟青霉PL461菌剂PLC是一株具有良好的生防价值的杀线菌剂，该菌剂对禾谷孢囊线虫病及其他的线虫病害具有较好的防治作用，显示其具有良好的开发应用前景。

Claims (3)

1.一种淡紫拟青霉，其特征在于，淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）PL461，其保藏号为CCTCC NO：M2012049。

2.权利要求1所述的一种淡紫拟青霉的培养方法，其步骤是：

A、淡紫拟青霉PL461的活化：将淡紫拟青霉PL461菌株置于PDA培养基平板上，于26～28℃条件下培养5～9 d，活化；

B、淡紫拟青霉PL461的液体发酵培养：将活化的淡紫拟青霉PL461菌株取直径为1 cm分别接种于装有100 ml PDB和Czapek’s液体培养基的250 ml的三角瓶中，于160 r/min，26～28℃条件下振荡培养，备用；

C、淡紫拟青霉PL461的固体发酵培养：将固体发酵培养基干培养料米糠、玉米粉和水按照体积比为3:3:4混合均匀，装入食用菌培养袋，121℃灭菌1～2h，冷却后，采用培养皿发酵法将步骤B的淡紫拟青霉PL461的发酵菌液接种到固体发酵培养基中，再次搅拌均匀后定量（70～80g/皿）转入直径为15cm的培养皿，26～28℃下培养5～9d，备用；

D、将步骤C中固相培养物按照以下配方和方法制成淡紫拟青霉菌剂：颗粒菌剂PLC：60 g培养物，7.5％质量体积比明胶240 ml，0.5 ml吐温20，200g硅藻土，200g硅藻土加60 g培养物，混均匀，过筛，再加7.5％（质量体积比）明胶240 ml捏合均匀，通过颗粒机造粒，颗粒剂在自然室温下风干；20～25℃避光条件下，放置；

所述的PDA培养基的组分及配比为：马铃薯200 g，葡萄糖15～20 g，琼脂15~20 g，补充蒸馏水至1000 ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30 min；

所述的PDB培养基组分及配比为：马铃薯200 g，葡萄糖15～20g，补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0，在121℃高压蒸汽灭菌30 min；

所述的Czapek’s培养基组分及配比为：NaNO₃ 2 g ，K₂HPO₄ 1 g，KCl 0.5 g，MgSO₄ 0.5 g，FeSO₄ 0.01g，蔗糖30 g，琼脂15~20g，补充蒸馏水至1000 ml。

3.权利要求1所述的一种淡紫拟青霉在制备治疗或预防禾谷孢囊线虫病药物中的应用。

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