CN104357338A - 淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用，发酵方法包括：制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；将淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，振荡培养；将发酵液过滤，得到微菌核沉淀。产生的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有抗逆耐储、货架期长和持续控害的特点；微菌核发酵周期短，生产成本低、工艺可控性强，所用原料易于获取。微菌核可以用作制备新型杀虫真菌制剂的活性成分。

Description

淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用

技术领域

本发明属于生物制剂领域，具体涉及淡紫拟青霉微菌核的发酵方法及其应用。

背景技术

南方根结线虫、北方根结线虫及花生根结线虫等植物寄生性线虫，寄生范围广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、胡萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些真菌和细菌性病害，是我国蔬菜安全生产的重大威胁，造成蔬菜作物大量减产和质量下降。目前线虫病害的防控主要依靠化学防治，化学农药的大量施用导致线虫病害土壤环境污染、农产品农药残留严重超标、影响蔬菜农产品安全、威胁人民身体健康；还大量杀伤线虫病害天敌，破坏生态平衡。近年来，以绿僵菌、白僵菌为代表的真菌生物农药是国际上微生物农药研究的热点之一，具有使用安全、不污染环境、可扩散流行和线虫病害不易产生抗药性等优点。淡紫拟青霉属于丝状真菌之一，是一种世界性广泛分布的线虫寄生真菌，可以寄生多种线虫，包括根结线虫、胞囊线虫等。但与目前大量使用的绿僵菌、白僵菌制剂相比，淡紫拟青霉传统的孢子菌剂液固两相生产周期长达3周以上、导致生产成本偏高；对环境高温抗逆能力差、货架期短，贮运不便，，田间防效不稳，影响了淡紫拟青霉的产业化与实际应用。而液体发酵产生的芽生孢子因不耐储存，致病力低等缺陷，也不能用于植物寄生性线虫病害的实际防控。

寄生真菌主要类群为丝状真菌，通常产生菌丝体和分生孢子，少数种类也可产生厚垣孢子。真菌微菌核是丝状真菌度过高温、低温或干旱等不良环境的休眠繁殖体，是菌丝体互相纠结，菌丝变异分化产生的外层致密坚硬、有色素沉淀，内层髓质化的组织体，能够在一定的湿度和温度条件下，重新萌发进行产孢。有的植物病原真菌如棉花黄萎病菌、油菜核盘菌等的生活史晚期往往在寄主组织内由菌丝体纠集形成菌核或微菌核。而寄生真菌的菌核或微菌核的诱导形成仅在白僵菌、绿僵菌和野村菌有报导，而淡紫拟青霉微菌核诱导形成未见报导。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种可大规模生产的淡紫拟青霉微菌核的液体发酵培养方法及其应用，开发生产成本低、侵染活力高、抗逆性强的淡紫拟青霉新侵染结构体，提供一种防治线虫病害的生防制剂，为杀虫真菌制剂的创制提供高质量的母药，解决淡紫拟青霉菌传统孢子菌剂抗逆能力差、货架期短，贮运不便的共性技术难题。

本发明的目的是这样实现的：

一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，包括以下步骤：

1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；

2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，25～28℃，200～250rpm振荡培养6～8天；

所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：

KH₂PO₄:3.0～5.0g/L、CaCl₂·2H₂O:0.6～1.0g/L、MgSO₄·7H₂O:0.4～0.8g/L、CoCl₂·6H₂O：34～40mg/L、MnSO₄·H2O:14～20mg/L、ZnSO₄·7H₂O:12～16mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.1～0.4g/L；葡萄糖：8～12g/L；酵母膏：4～6g/L；蛋白胨：2.0～3.0g/L；

3)将步骤2振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存。

所述步骤1中制备淡紫拟青霉孢子悬浮液的方法为：将活化的淡紫拟青霉的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在25℃下培养8～10天，用0.1～0.5％Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成孢子悬浮液。

步骤2中所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：

KH₂PO₄:3.5～4.5g/L、CaCl₂·2H₂O:0.7～0.9g/L、MgSO₄·7H₂O:0.5～0.7g/L、CoCl₂·6H₂O：36～38mg/L、MnSO₄·H2O:15～17mg/L、ZnSO₄·7H₂O:13～15mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L；葡萄糖：9～11g/L；酵母膏：4～6g/L；蛋白胨：2.0～3.0g/L。

用上述培养方法获得的真菌微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，所述活性真菌为淡紫拟青霉，所述线虫病害病原物为根结线虫或胞囊线虫。应用方式为：将上述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核35℃干燥24-48小时后与硅藻土或高岭土以及助剂混合后成为微菌核细粒剂，用于防治根结线虫或胞囊线虫。所述助剂为蔗糖酯或黄原胶。

本发明的有益效果是：本发明首次用液体发酵法能稳定大量产生淡紫拟青霉微菌核，产生的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有良好的杀虫活性、抗逆耐储、发酵周期短，生产成本低、货架期长的特点；微菌核作为生物制剂的有效成分，可用于规模化生产新型真菌农药，可以替代分生孢子作为丝状真菌制剂加工的有效成分。该生产过程周期短(5-6d)，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。本发明所用的培养液的配制和液体发酵工序可操作性强，重复性好，所用原料易于获取。

附图说明

图1为振荡培养7天后得到的淡紫拟青霉微菌核显微镜下100倍图。

图2为干燥后的淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上24h时萌发显微400倍图。

图3为淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上7d的萌发情况图。

图4为淡紫拟青霉微菌核在水琼脂上14d的产孢情况图。

具体实施方式

本发明所用的真菌菌株和虫源，如淡紫拟青霉和根结线虫，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如土壤分离或商业途径购买等。

实施例一 淡紫拟青霉微菌核诱导培养液配方优化和诱导过程

1、淡紫拟青霉接种体悬浮液制备：

将淡紫拟青霉菌株(来源于重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心)的分生孢子接种到PDA平板上，在25℃条件下培养12天，用0.1～0.5％Tween-80灭菌液体将平板上的成熟分生孢子洗下，调节分生孢子的浓度，制备成1.0×10⁸孢子/毫升的孢子悬浮液。

2、诱导培养液配方筛选

1)无机盐离子浓度：

以添加KH₂PO₄:4.0g/L、CaCl₂·2H₂O:0.8g/L、MgSO₄·7H₂O:0.6g/L、CoCl₂·6H₂O：37mg/L、MnSO₄·H2O:16mg/L、ZnSO₄·7H₂O:14mg/L作为培养微菌核的无机盐离子。

2)碳、氮源的选择

选择浓度为10g/L的葡萄糖作为碳源，5g/L酵母膏和2.5g/L蛋白胨作为培养基中的氮源。

3)铁离子浓度的选择

以FeSO₄.7H₂O作为最佳的诱导剂，以0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L四个浓度梯度进行铁离子浓度的确定。

4)诱导培养液的配方：

配制诱导培养液，均含如下成分：KH2PO4:4.0g/L、CaCl2·2H2O:0.8g/L、MgSO4·7H2O:0.6g/L、CoCl₂·6H₂O：37mg/L、MnSO₄·H2O:16mg/L、ZnSO₄·7H₂O:14mg/L；葡萄糖：10g/L；酵母膏：5g/L；蛋白胨：2.5g/L。除了上述成分，还加入不同浓度的铁离子。将含上述无机盐离子、碳、氮源的培养液组合成4种不同的液体培养基，分别含有FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，将含有这四个浓度FeSO₄·7H₂O的培养基分别命名为SDA_Ⅰ、SDA_Ⅱ、SDA_Ⅲ、SDA_Ⅳ。将这4种液体培养基分别以100mL的量分装到250mL三角瓶中，pH值为5.4-6.5，进行121℃高温高压灭菌30分钟。

3、培养条件的选择

将前述配制的淡紫拟青霉孢子悬浮液按照5％的接种量接种到前述4种不同的培养基中。在23～28℃，200～250rpm条件下进行摇床培养。在6天时进行显微观察液体培养基中的产微菌核状况。

由于各个培养基中铁离子含量的的不同，淡紫拟青霉菌株能够产生微菌核的数量不同。其中SDA_Ⅰ产微菌核量为0.92×10⁵个/ml，SDA_Ⅱ产微菌核量为1.21×10⁵个/ml，SDA_Ⅲ产微菌核量为1.09×10⁵个/ml，SDA_Ⅳ产微菌核量为0.95×10⁵个/ml。可见SDA_Ⅱ液体培养基产生较多的微菌核，故选择SDA_Ⅱ作为淡紫拟青霉菌株产微菌核的最佳诱导培养液配方，配方即1L培养液中含有：葡萄糖10.0g、酵母膏5.0g、蛋白胨2.5g、KH₂PO₄:4.0g、CaCl₂·2H₂O:0.8g、MgSO₄·7H₂O:0.6g、CoCl₂·6H₂O：37mg、MnSO₄·H2O:16mg、ZnSO₄·7H₂O:14mg。培养条件为温度23～28℃，摇床转速为200～250rpm。

实施例二 淡紫拟青霉微菌核的形态与结构观察

将淡紫拟青霉菌株用SDA_Ⅱ液体培养基，25～28℃，200～250rpm进行摇床培养，显微观察液体培养基中的产微菌核状况：接种后振荡培养1-2天时，分生孢子萌发形成菌丝，菌液颜色未见变化，而培养液粘度及菌体生物量逐渐增加；培养3天后菌液颜色开始变褐色，此时菌悬液中的菌量继续增加，部分菌丝体前端开始膨大，明显加粗；在光学显微镜下观察，发现菌丝开始聚集。培养4天后，发酵菌液褐色继续加深，取样在显微镜下观察，可见由数十个细胞的微菌核休眠结构。微菌核呈深褐色，边缘光滑，中间紧密。培养5-6天时，菌液变得更加粘稠，颜色呈深褐色，微菌核数量剧烈增加，有少量的微菌核周围开始萌发出大量菌丝。7天后微菌核数量不再明显增加，部分微菌核四周形成细长的菌丝(如图1所示)。

实施例三 淡紫拟青霉微菌核的产孢能力分析

将淡紫拟青霉菌株分别用SDA_Ⅰ、SDA_Ⅱ、SDA_Ⅲ、SDA_Ⅳ液体培养基，23～28℃，200～250rpm进行摇床培养，6天后在发酵得到的培养液中分别加入5％的硅藻土，35℃干燥24-48小时后，进行粉碎处理。之后将混合物分别进行过60目标准筛处理，使微菌核与硅藻土分离，分别将微菌核室温密封保存。

取四种培养基培养得到的微菌核各10mg均匀接种在水琼脂平板上，在25℃条件下培养14天后，用0.5％Tween-80灭菌水将平板上的成熟分生孢子洗下，血球计数板计数，发现SDA_Ⅰ组合培养的微菌核每毫克能够产生3.7×10⁵个孢子、SDA_Ⅱ组合培养的微菌核每毫克能够产生3.8×10⁵个孢子、SDA_Ⅲ组合培养的微菌核每毫克能够产生4.7×10⁵个孢子、SDA_Ⅳ组合培养的微菌核每毫克能够产生5.4×10⁵个孢子。

实施例四 淡紫拟青霉微菌核耐热性测定

收集实施例三中过筛处理的新鲜SDA_Ⅱ组合培养的微菌核，称取9份微菌核，每份0.1克，分别放入装有50毫升灭菌水的试管中，共9管。从中随机取3管分别放入35℃、45℃、55℃的水浴锅中，每隔10分钟从试管中取出10毫升的均匀微菌核悬溶液，均匀涂布在水琼脂平板上，共取4次。同时以淡紫拟青霉分生孢子作为对照实验。在25℃条件下恒温培养，在24小时时显微镜下计数300个微菌核，测定每个处理的微菌核的萌发率。

结果发现微菌核和分生孢子在35℃处理的萌发率与未进行热处理的萌发率无显著差异，均在93％以上。而微菌核在45℃处理的后期(即45℃水浴20分钟)萌发率显著下降，为73.42％，40分钟处理后的微菌核萌发率在52.56％，而分生孢子则在10分钟处理时表现出萌发率下降，为82.54％，40分钟处理的分生孢子萌发率为23.56％。55℃条件下处理的微菌核的萌发率显著下降，10分钟的为78.56％，而40分钟后的萌发率仅为32.15％，分生孢子下降更为严重，10分钟处理的为56.42％，40分钟处理的仅为12.05％。说明微菌核的耐热性明显好于分生孢子。

实施例五 淡紫拟青霉微菌核抗紫外能力分析

收集实施例三中过筛处理的新鲜SDA_Ⅱ组合培养的微菌核，称取0.5克微菌核，放入装有100毫升灭菌水的试管中，从中取出10毫升微菌核悬浮液均匀的涂布在水琼脂平板上，在UV-B紫外灯下，照射0，1，2，3小时。取出紫外照射的平板于25℃培养箱中避光培养24小时，然后用刀片划取一块培养基，于显微镜下计数300个微菌核，统计萌发率，实验重复3次，并以淡紫拟青霉的分生孢子作为对照。结果显示随着照射时间的增加，分生孢子和微菌核的萌发率均降低，但微菌核的萌发率下降幅度比分生孢子缓慢，0小时时，分生孢子与微菌核的萌发率均大于90％。紫外灯1小时照射，分生孢子的萌发率为75.42％，而微菌核的萌发率为83.26％；2h照射后，分生孢子的萌发率减为55.24％，而微菌核的萌发率为73.28％；3h照射后，分生孢子的萌发率减为32.35％，而微菌核的萌发率为64.56％。由此可见，淡紫拟青霉微菌核抗紫外能力分析明显好于分生孢子。

实施例六 淡紫拟青霉微菌核贮存能力分析

将实施例三中过筛处理的新鲜SDA_Ⅱ组合培养的微菌核密封放置在室温条件下，每隔三个月从中取部分微菌核，平铺在水琼脂平板上，在25℃条件下恒温培养，分别在24小时和48小时时取样在光学显微镜下测定萌发率，结果显示6个月的微菌核仍保持90％以上的萌发率，而放置1年的微菌核在48小时时仍保持82.78％的萌发率，可见淡紫拟青霉微菌核具有良好的耐贮存能力。

实施例七 淡紫拟青霉微菌核防治番茄根结线虫

以南方根结线虫Meloidogyne incognita作为试虫测定淡紫拟青霉的毒力：取重庆大学蔬菜实验地感染南方根结线虫的番茄病根，洗净后剪切取为2-4cm根段，然后放入装有1升1％次氯酸钠的溶液中进行高速匀浆搅拌3min，将碎片分别在75μm和26μm网筛上过滤，并用无菌水冲洗多次，收集26μm筛网的物质，并用无菌水定容至100mL。取0.5mL卵悬浮液，无菌水稀释1倍，于立体解剖镜下计数卵的数目，重复3次，计算每毫升卵悬浮液所含卵数目，将制备好的卵悬液放于4℃冰箱备用。

取田间土壤，过2mm目筛后与沙子按照1:1比例混合，在121℃下高温灭菌20分钟。冷却后，将实施例三中过筛处理的新鲜SDA_Ⅱ组合培养的微菌核以5％、10％、15％的比例(质量比)与土壤混匀，置入直径12cm的花盆中，花盆中移植3-4叶期的长势一致的根结线虫感病品种番茄，每盆一株，按照2000个卵/100cm³的土壤比，均匀接种制备好的根结线虫卵液，以清水作为阴性对照。植株在25-28℃下生长，每周向各花盆喷一次等量植物营养液，每个处理重复6次。2个月后，以测定每个处理的根结指数，来判定防治效果，并且计数根上卵囊数。数据结果显示，与阴性对照相比，三个浓度处理的微菌核毒土均能有效的减少根上的卵囊数，防治效果均达90％以上。

实施例八 制备淡紫拟青霉微菌核细粒剂

将实施例三中过筛处理的新鲜SDA_Ⅱ组合培养的微菌核，35℃干燥24-48小时后与硅藻土或高岭土以及少量蔗糖酯或黄原胶混合后即为微菌核细粒剂，可用于防治根结线虫，混合比例按重量比为微菌核﹕硅藻土或高岭土﹕蔗糖酯或黄原胶＝8-10﹕85-88﹕2-5。该制剂具有抗逆性强、耐储存的优点，又由于其主要杀虫活性成分为菌丝体纠结形成的厚壁休眠结构，生产成本降低，生产周期缩短，本发明对于需光好氧、产孢难的丝状真菌的规模化生产具有重要的创新意义。

实施例九 淡紫拟青霉微菌核活力观察

将实施例八制备的微菌核细粒剂，涂布在水琼脂培养基平板上进行再水化，放置于25℃培养箱中进行培养，24小时微菌核开始长有细长菌丝(如图2所示)，在接种7天时萌发后的微菌核开始产孢(如图3所示)，接种14天时微菌核大量产孢(如图4所示)，说明微菌核细粒剂具有良好的活力。

Claims (8)

1.一种淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)制备淡紫拟青霉孢子悬浮液；

2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的淡紫拟青霉孢子悬浮液加入诱导培养液中，25～28℃，200～250 rpm振荡培养6～8天；

所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：

KH₂PO₄:3.0～5.0 g/L、CaCl₂·2H₂O:0.6～1.0g/L、MgSO₄·7H₂O:0.4～0.8g/L、CoCl₂·6H₂O：34～40mg/L、MnSO₄·H2O:14～20mg/L、ZnSO₄·7H₂O:12～16mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.1～0.4g/L；葡萄糖：8～12g/L；酵母膏：4～6g/L；蛋白胨：2.0～3.0g/L；

3)将步骤2振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核和菌体，干燥，保存。

2.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于：步骤1中所述制备淡紫拟青霉孢子悬浮液的方法为：将活化的淡紫拟青霉的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在25℃下培养8～10天，用0.1～0.5％Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成孢子悬浮液。

3.根据权利要求1所述的淡紫拟青霉微菌核的发酵方法，其特征在于：步骤2中所述诱导培养液单位体积内所含有的各种原料干物质重量如下：

KH₂PO₄:3.5～4.5g/L、CaCl₂·2H₂O:0.7～0.9g/L、MgSO₄·7H₂O:0.5～0.7g/L、CoCl₂·6H₂O：36～38mg/L、MnSO₄·H2O:15～17mg/L、ZnSO₄·7H₂O:13～15mg/L；FeSO₄·7H₂O 0.1～0.3g/L；葡萄糖：9～11g/L；酵母膏：4～6g/L；蛋白胨：2.0～3.0g/L。

4.用上述权利要求1-3之一所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核在防治线虫病害中的应用。

5.用上述权利要求1-3之一所述培养方法获得的真菌微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，其特征在于：所述活性真菌为淡紫拟青霉，所述线虫病害病原物为根结线虫或胞囊线虫。

6.根据权利要求5所述的微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，其特征在于：应用方式为：将权利要求1-3之一所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核干燥后与硅藻土或高岭土以及助剂按重量比为微菌核；硅藻土或高岭土﹕助剂＝8-10﹕85-88﹕2-5混合后成为微菌核细粒剂，用于防治根结线虫或胞囊线虫。

7.根据权利要求5所述的微菌核在制备防治线虫病害的生防制剂中的应用，其特征在于：所述助剂为蔗糖酯或黄原胶。

8.一种防治线虫病害的生防制剂，其特征在于：包含通过上述权利要求1-3之一所述培养方法获得的淡紫拟青霉微菌核和辅料。