CN105695344B - 棒束孢微菌核的培养方法及其应用 - Google Patents

棒束孢微菌核的培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种棒束孢微菌核的培养方法及其应用，发酵方法包括：1)制备棒束孢孢子接种体；2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的棒束孢孢子接种体加入诱导培养液中振荡培养6～8天；3)发酵液过滤，弃去上清液，得到微菌核沉淀，干燥，保存。还公开了棒束孢微菌核在防治粉虱类害虫中的应用以及一种防治粉虱类害虫的生防制剂。本发明方法生产的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有抗逆耐储、货架期长和持续控害的特点；微菌核发酵周期短，生产成本低、工艺可控性强，所用原料易于获取。微菌核可以用作制备新型杀虫真菌制剂的活性成分。

Description

棒束孢微菌核的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体涉及棒束孢微菌核的培养方法及其在防治害虫方面的应用。
背景技术
粉虱类刺吸式口器的害虫常群集于叶片、嫩茎、花蕾、顶芽等部位，刺吸汁液，使叶片皱缩、卷曲、畸形，严重时引起枝叶枯萎甚至整株死亡，危害于多种农作物、果木、蔬菜等。目前刺吸式口器害虫防控主要依靠化学防治，化学农药的大量施用导致害虫抗药性产生，并且污染生态环境、影响蔬菜农产品安全、威胁人民身体健康；还大量杀伤害虫天敌，破坏生态平衡。
棒束孢(Isaria)是一类能够寄生于多种害虫的虫生真菌，能穿透害虫体表进入体内，在害虫体内繁殖消耗寄主营养使害虫致死，能造成害虫局域内的流行性病发生；同时具有不污染环境、无残留、对人畜无害、害虫不会产生抗药性等优点，已经越来越广泛地应用到害虫的生物防治。由于液体发酵产生的芽生孢子有不耐储存，致病力低等缺陷，不适宜作为杀虫制剂的有效成分。目前利用棒束孢进行生物防治的有效成分为分生孢子，是通过液固两相发酵工艺进行生产的，但棒束孢产孢需要光照刺激，生产周期长、并且分生孢子抗逆能力差、货架期短，导致生产成本偏高，田间防效不稳，影响了棒束孢的产业化与实际应用。
寄生真菌主要类群为丝状真菌，通常产生菌丝体和分生孢子，少数种类也可产生厚垣孢子。真菌微菌核是丝状真菌度过高温、低温或干旱等不良环境的休眠繁殖体，是菌丝体互相纠结，菌丝变异分化产生的外层致密坚硬、有色素沉淀，内层髓质化的组织体，能够在一定的湿度和温度条件下，重新萌发进行产孢。目前已证实虫生真菌液体诱导产生的微菌核能够作为一种分生孢子的替代有效成分，应用于生物防治。目前寄生真菌的菌核或微菌核的诱导形成仅在白僵菌、绿僵菌和野村菌有报导，而棒束孢微菌核诱导形成未见报导。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种可规模化生产棒束孢微菌核的培养方法及其应用，开发生产成本低、侵染活力高、抗逆性强的棒束孢新侵染结构体，提供一种防治害虫的生防制剂，为杀虫真菌制剂的创制提供高质量的母药或原粉，解决目前没有有效的棒束孢微菌核的培养方法，和传统孢子菌剂抗逆能力差、货架期短，贮运不便的共性技术难题。
本发明的目的是这样实现的：
一种棒束孢微菌核的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)制备棒束孢孢子接种体；
2)微菌核诱导培养：将步骤1中制备的棒束孢孢子接种体加入诱导培养液中振荡培养6～8天；
所述诱导培养液中含有的原料及其含量如下：
KH2PO4：3.0～5.0g/L、CaCl2·2H2O：0.6～1.0g/L、MgSO4·7H2O：0.4～0.8g/L、CoCl2·6H2O：34～40mg/L、MnSO4·H2O：14～20mg/L、ZnSO4·7H2O：12～16mg/L、FeSO4·7H2O：0.1～0.4g/L、维生素K3：0.0096-0.0172g/L、二甲亚砜溶液：0.05-0.1mL/L、葡萄糖：12～40g/L、酵母膏：4～6g/L、蛋白胨：2.0～3.0g/L；
3)将步骤2)振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到沉淀微菌核，干燥，保存。
步骤1)中所述制备棒束孢孢子接种体的方法为：将活化的棒束孢的孢子或菌丝体接种于PDA平板培养基上，在22～25℃下培养10～14天，用0.1～0.5％Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成孢子悬浮液，接种到1/4SDA液体培养基中培养24-36h，即得到用于微菌核诱导培养的接种体。
步骤2)中所述棒束孢孢子接种体加入诱导培养液中后的培养条件为25～28℃，200～250rpm振荡培养。
作为优选地，步骤2)中所述诱导培养液中含有的原料及其含量如下：KH2PO4：3.5～4.5g/L、CaCl2·2H2O：0.7～0.9g/L、MgSO4·7H2O：0.5～0.7g/L、CoCl2·6H2O：36～38mg/L、MnSO4·H2O：15～17mg/L、ZnSO4·7H2O：13～15mg/L、FeSO4·7H2O：0.15～0.35g/L、维生素K3：0.0096-0.0172g/L、二甲亚砜溶液：0.05-0.1mL/L、葡萄糖：17～35g/L、酵母膏：4.5～5.5g/L、蛋白胨：2.0～3.0g/L。
本发明的另一目的在于提供一种上述培养方法获得的棒束孢微菌核在防治粉虱类害虫中的应用。应用方式为：将上述培养方法获得的棒束孢微菌核干燥后与硅藻土或高岭土以及助剂按重量比为微菌核；硅藻土或高岭土﹕助剂＝8-10﹕85-88﹕2-5混合后成为微菌核细粒剂，用于防治粉虱类害虫。
作为优选地，所述助剂为蔗糖酯或黄原胶。
本发明的另一目的在于提供一种防治粉虱类害虫的生防制剂，包含通过上述培养方法获得的棒束孢微菌核和辅料。
本发明的有益效果是：本发明首次用液体发酵法能稳定大量产生棒束孢微菌核，产生的微菌核能够适应高温、干旱、强紫外等外界不良环境，具有良好的杀虫活性、抗逆耐储、发酵周期短，生产成本低、货架期长的特点；微菌核作为生物制剂的有效成分，可用于规模化生产新型真菌农药，可以替代分生孢子作为丝状真菌制剂加工的有效成分。该生产过程周期短，成本低廉，生产过程中无污染性废料产生，十分环保。本发明所用的培养液的配制和液体发酵工序可操作性强，重复性好，所用原料易于获取。
附图说明
图1为振荡培养7天后得到的棒束孢微菌核显微镜下100倍图。
图2为干燥后的棒束孢微菌核在水琼脂上24h时萌发显微100倍图。
图3为棒束孢微菌核在水琼脂上14d的产孢情况图。
具体实施方式
本发明所用的真菌菌株和虫源，如棒束孢和粉虱，均属于公知公用的实验材料，可通过常规的途径获得，如土壤分离或商业途径购买等。
实施例一 棒束孢微菌核诱导培养液配方优化和诱导过程
1、棒束孢接种体制备：
将玫烟色棒束孢CQIF101菌株(来源于重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心)的分生孢子接种到PDA平板上，在25℃条件下光照培养(16小时光：8小时黑暗)12天，用0.1～0.5％Tween-80灭菌液体将平板上的成熟分生孢子洗下，调节分生孢子的浓度，制备成1.0×108孢子/毫升的孢子悬浮液，接种到1/4SDA液体培养基中，在温度为25℃，摇床转速为250rpm条件下培养24-36h，即得到用于微菌核诱导培养的接种体。
2、诱导培养液配方筛选
1)无机营养成分浓度：
以添加KH2PO4:3.0～5.0g/L、CaCl2·2H2O:0.6～1.0g/L、MgSO4·7H2O:0.4～0.8g/L、CoCl2·6H2O：34～40mg/L、MnSO4·H2O:14～20mg/L、ZnSO4·7H2O:12～16mg/L作为培养微菌核的无机营养成分。
2)碳、氮源的选择
选择浓度为12～40g/L的葡萄糖作为碳源，4～6g/L酵母膏和2.0～3.0g/L蛋白胨作为培养基中的氮源。
3)铁离子浓度的选择
以FeSO4·7H2O作为诱导剂之一，以0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L四个浓度梯度进行铁离子浓度的确定。
对诱导培养液中无机营养成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、FeSO4·7H2O按不同浓度梯度进行组合，筛选最佳培养液组分。在实验中进行了大量排列组合，制作了多份培养液进行实验，将各种液体培养基分别以100mL的量分装到250mL三角瓶中，pH值为5.5-6.5，进行121℃高温高压灭菌30分钟。将前述制备好的接种体按照5％的接种量接种到不同的培养液中，在温度为25～28℃，摇床转速为200～250rpm条件下进行摇床培养，每种培养液设3个重复，在6天时进行显微观察液体培养基中产微菌核状况，计算每种培养液的平均产量。其中有代表性的培养液的微菌核产量结果如表1所示：
表1培养液不同浓度组分微菌核产量表
可见培养液中无机营养成分、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨不同浓度对微菌核产量影响差异不大，铁离子浓度影响差异大，可见FeSO4·7H2O浓度为0.2和0.3g/L时，微菌核产量显著高于FeSO4·7H2O浓度为0.1和0.4g/L的培养液。
以样品8的培养液成分来筛选另一个主要诱导因子维生素K3的最佳浓度，将维生素K3溶解在二甲亚砜溶液中加入培养液中。维生素K3不同的浓度梯度为0.0096g/L、0.0100g/L、0.0140g/L、0.0172g/L、0.0200g/L、0.0256g/L，按照维生素K30.0096～0.0256g溶解在0.08mL(0.05～0.1mL均可)的二甲亚砜溶液中溶解维生素K3，然后将溶液进行过滤除菌后，加入培养液中混匀即可。然后按照前述方法对培养液灭菌、接种棒束孢接种体，进行摇床培养，每种培养液设3个重复，在6天时进行显微观察液体培养基中产微菌核状况，计算每种培养液的平均产量(每ml培养液中微菌核的个数)，结果见表2所示：
表2不同维生素K3浓度培养液微菌核产量
由表2可知，维生素K3的浓度为0.0096～0.0172g/L时，相对于没加维生素K3的原培养液样品8，微菌核产量有明显提高，但是当维生素K3的浓度大于0.0200g/L时，微菌核产量反而下降。
实施例二 棒束孢微菌核的形态与结构观察
在实施一中将棒束孢菌株按照液体诱导方法进行培养时，显微观察液体培养基中的产微菌核状况：培养3天后开始产生较小的微菌核结构，边缘光滑，中间致密，呈红褐色。培养3-4天时，发酵菌液颜色更加加深，微菌核数量继续增加，有少量的微菌核周围开始萌发出大量菌丝。培养5-6天后，微菌核的数量基本不再增加，有大量的微菌核周围萌发出细长的菌丝。7天后微菌核数量不再明显增加，部分微菌核四周形成细长的菌丝(如图1所示)。
实施例三 棒束孢微菌核的产孢分析
将棒束孢菌株按照实施例一中的液体培养诱导方法进行培养，培养液为实施例一中的样品2、5、8、11培养液中分别加入维生素K3 0.0010g/L，得到培养液I、II、III、Ⅳ。
6天后发酵得的培养液加入5％的硅藻土，35℃干燥24-48小时后，进行粉碎处理。之后将混合物进行过60目标准筛处理，使微菌核与硅藻土分离，将微菌核进行密封保存，取20mg收获的微菌核均匀接种在水琼脂平板上，在25℃条件下培养14天后，用0.5％Tween-80灭菌水将平板上的成熟分生孢子洗下，血球计数板计数，发现每毫克培养液I组合培养的微菌核能够产生8.3×105孢子、每毫克培养液II组合培养的微菌核能够产生1.23×105孢子、每毫克培养液III组合培养的微菌核能够产生1.18×105孢子、每毫克培养液Ⅳ组合培养的微菌核能够产生6.8×105孢子。
实施例四 棒束孢微菌核耐热性测定
收集过筛处理的新鲜的实施例三中培养液II组合培养的微菌核，分别称取0.1克微菌核，放入装有50毫升灭菌水的试管中，共9管。从中随机取3管分别放入35℃、45℃、55℃的水浴锅中，每隔10分钟从中取出10毫升的均匀微菌核悬溶液，均匀涂布在水琼脂平板上，共取4次。在25℃条件下恒温培养，24小时时显微镜下计数300个微菌核，测定每个处理的微菌核的萌发率，同时以棒束孢分生孢子作为对照实验。结果发现：1)微菌核和分生孢子在35℃处理与未处理的萌发率无显著差异，均在92％以上。2)微菌核在45℃处理的后期(即30分钟)萌发率显著下降，为78.35％，40分钟处理后的微菌核萌发率仅在45.24％，而分生孢子则在10分钟处理时表现出萌发率下降，为84.28％，40分钟处理的分生孢子萌发率为19.66％。3)55℃条件下处理的微菌核的萌发率显著下降，10分钟的为80.18％，而40分钟后的萌发率仅为18.35％，分生孢子下降更为严重，10分钟处理的为48.26％，40分钟处理的仅为9.15％。说明微菌核较分生孢子具有更好的耐热性。
实施例五 棒束孢微菌核贮存能力分析
将过筛收集的实施例三中的培养液II组合培养的棒束孢微菌核密封放置在室温条件下，每隔三个月从中取部分微菌核，平铺在水琼脂平板上，在25℃条件下恒温培养，分别在24小时和48小时时取样在光学显微镜下测定萌发率，结果显示6个月的微菌核仍保持90％以上的萌发率，而密封室温放置1年的微菌核在48小时时仍保持81.65％的萌发率。说明微菌核有很好的耐贮存性能，适合于作为防治害虫的生物农药使用，具有很好的市场应用价值。
实施例六 几株棒束孢菌株液体诱导微菌核的培养
将来源不同的几株棒束孢菌株CQIF102、CQIF103、CQIF104(来源于重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心)分别按上述方法进行分生孢子接种体悬浮液制备，接种于实施例三中的培养液II组合诱导培养基中，在温度为25～28℃，摇床转速为200～250rpm条件下进行微菌核的诱导培养，6天后，其微菌核的产量分别为CQIF102：0.75×105个/ml、CQIF103：1.21×105个/ml、CQIF104：1.02×105个/ml。说明对于不同的棒束孢菌株该培养液组分均能得到高微菌核产量。
实施例七 制备棒束孢微菌核细粒剂
将实施例三中过筛处理的培养液II组合培养的微菌核，35℃干燥24-48小时后与硅藻土或高岭土以及少量蔗糖酯或黄原胶混合后即为微菌核细粒剂，可用于防治粉虱等害虫，混合比例按重量比为微菌核﹕硅藻土或高岭土﹕蔗糖酯或黄原胶＝8-10﹕85-88﹕2-5。该制剂具有抗逆性强、耐储存的优点，又由于其主要杀虫活性成分为菌丝体纠结形成的厚壁休眠结构，生产成本降低，生产周期缩短，本发明对于需光好氧、产孢难的丝状真菌的规模化生产具有重要的创新意义。
实施例八 棒束孢微菌核活力观察
将实施例七制备的微菌核细粒剂，涂布在水琼脂培养基平板上进行再水化，放置于25℃培养箱中进行培养，24小时微菌核开始长有细长菌丝(如图2所示)，在接种7天时萌发后的微菌核开始产孢，接种14天时微菌核大量产孢(如图3所示)，说明微菌核细粒剂具有良好的活力。

Claims (1)

1.一种棒束孢微菌核的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）制备棒束孢孢子接种体：将活化的棒束孢的孢子或菌丝体接
种于PDA平板培养基上，在22～25℃下培养10～14天，用0.1～0.5% Tween-80将平板上的分生孢子洗下，制备成1.0×108孢子/毫升的孢子悬浮液，按照5%的接种量接种到1/4SDA液体培养基中培养24-36h，即得到用于微菌核诱导培养的接种体；
2）微菌核诱导培养：将步骤1）中制备的棒束孢孢子接种体加入诱导培养液中，25～28℃，200～250 rpm摇床振荡培养6～8天；
所述诱导培养液中含有的原料及其含量如下：
KH2PO4：3.5～4.5 g/L、CaCl2·2H2O：0.7～0.9g/L、MgSO4·7H2O：0.5～0.7g/L、CoCl2·6H2O：36～38 mg/L、MnSO4·H2O：15～17mg/L、ZnSO4·7H2O：13～15mg/L、FeSO4·7H2O：0.15～0.35 g/L、维生素K3：0.0096-0.0172g/L、二甲亚砜溶液：0.05-0.1mL/L、葡萄糖：17～35g/L、酵母膏：4.5～5.5 g/L、蛋白胨：2.0～3.0g/L；
将步骤2)振荡培养得到的发酵液过滤，弃去上清液，得到微
菌核沉淀，干燥，保存。
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