CN115466736B - 一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂及其制备方法 - Google Patents

一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂的制备方法。将淡紫拟青霉菌粉与海藻酸钠水溶液混合，加入膨化鸡羽毛粉和生物炭搅拌，混合均匀后，送入喷雾干燥塔中，料液在离心雾化盘上雾化成小液滴，通过喷嘴喷入CaCl2水溶液中，固化后将海藻酸钙微球滤出，无菌水冲洗去除多余的CaCl2，然后将收集的微胶囊加入壳聚糖溶液中进行二次包衣，收集微胶囊风干，获得淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂。本发明采用喷雾法结合钙离子固化法对淡紫拟青霉菌剂进行包埋，从而制成羽碳双基双层微胶囊，本发明采用的微胶囊包埋法条件温和且效率较高。

Description

一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂及其制备方法。
背景技术：
淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)是一种广泛分布于土壤和植物根系的习居菌，被认为是最有前途的防治植物线虫病的生物介质。淡紫拟青霉能够寄生包括根结线虫、胞囊线虫在内的多种植物寄生线虫的卵、幼虫及成虫，侵染过程中通过菌丝机械压力和分泌的胞外酶(如几丁质酶、丝氨酸蛋白酶)联合作用，使线虫和虫体破裂而死，而且在代谢过程中能够产生具有杀线虫活性的物质，抑制线虫卵的孵化，并强烈抑杀二龄幼虫从而控制作物线虫病害。此外，淡紫拟青霉还能产生促进植物生长的生物活性物质。因此，淡紫拟青霉在植物线虫病的生物防治上具有巨大的潜力。
淡紫拟青霉在生物防治上虽然表现出巨大的潜力，同时市场需求量大，但产品货架期短是限制其工业化的主要因素，淡紫拟青霉菌剂产品在室温条件下保藏6个月会使活菌数下降2-8个数量级，有的甚至活菌数下降至零。此外，非芽孢类的生防菌剂抗逆性差，在自然环境中容易失活，导致其防效极不稳定。因此，采取有效措施延长淡紫拟青霉在产品中活菌存活时间、提高其在自然界中的抗逆性、增加其在土壤中的定殖率，对其发挥生物防治效果具有重要意义。
发明内容：
本发明之目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种能提高淡紫拟青霉稳定性、延长产品货架期、增加其在土壤中定殖效果的淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂及其制备方法。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
将淡紫拟青霉菌粉与海藻酸钠水溶液混合，加入膨化鸡羽毛粉和生物炭搅拌，混合均匀后，送入喷雾干燥塔中，料液在离心雾化盘上雾化成小液滴，通过喷嘴喷入CaCl2水溶液中，固化后将海藻酸钙微球滤出，无菌水冲洗去除多余的CaCl2，然后将收集的微胶囊加入壳聚糖溶液中进行二次包衣，收集微胶囊风干，获得淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂。
优选地，所述淡紫拟青霉为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，该菌于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO.60596。
进一步，所述淡紫拟青霉菌粉的制备方法，具体步骤如下：将淡紫拟青霉斜面菌种接种到PDA平板上划线，28℃生化培养箱中培养72h，待长出单菌落后，将活化的淡紫拟青霉接种于PDA液体培养基，置于28℃，180rpm的恒温振荡器中培养72-84h，得到种子液，以质量比5％的接种量将种子液接种于固体发酵培养基的曲盘中，置于28℃的无菌培养室中培养5-7d，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥24-48h，再将干燥后的物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉菌粉。
优选地，所述的海藻酸钠水溶液的浓度是质量分数3～4％，所述的淡紫拟青霉菌粉和海藻酸钠溶液混合比例为1-4：100，所述的膨化鸡羽毛粉和生物炭的添加量是海藻酸钠溶液和菌粉总质量的8％。
优选地，所述羽毛粉为过100目筛的膨化鸡羽毛粉。
进一步，所述膨化鸡羽毛粉的制备方法，具体步骤如下，将鸡羽毛进行除杂，清水洗干净，然后烘干，调整鸡羽毛水分为18％-22％，加入DSE-30双螺杆挤压膨化机中，设置转速为180-220r/min，温度为155-170℃，压力为0.6-0.8MPa，冷却后进行粉碎，获得膨化鸡羽毛粉。
优选地，所述生物炭为过100目筛玉米秸秆生物炭。
进一步，所述玉米秸秆生物炭的制备方法，具体步骤如下；将玉米秸秆在马弗炉中500℃加热6h，同时持续通入氮气，加热完成后，在干燥环境中冷却并粉碎，获得玉米秸秆生物炭。
优选地，所述喷雾干燥塔的进料流量为2-4L/h。
优选地，所述CaCl2浓度为质量分数1％-4％。
优选地，所述壳聚糖浓度为质量分数0.4％-1％。
优选地，所述的海藻酸钠水溶液中海藻酸钠质量分数为3.183％、菌粉与海藻酸钠水溶液的质量比1.71:100、膨化羽毛粉用量为质量分数4％，生物炭用量为质量分数4％，CaCl2的浓度为质量分数3％，壳聚糖浓度为质量分数0.858％。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明采用喷雾法结合钙离子固化法对淡紫拟青霉菌剂进行包埋，从而制成羽碳双基双层微胶囊，避免了传统微胶囊制备方法中的一些缺陷，如单纯采用喷雾干燥法，物料液滴要与高温气体进行短暂接触，对于淡紫拟青霉这类稳定性不好、易失活的菌株，也会造成部分菌剂失活。而单独采用钙离子固化法，虽不会导致菌剂失活，但注射器挤压效率过低，不适合工业化生产。本发明采用的微胶囊包埋法条件温和且效率较高。
2、实验发现，本发明提供的淡紫拟青霉M-1的羽碳双基双层微胶囊，不管是在4℃下存储还是在室温下存储，菌株稳定性均优于粉剂淡紫拟青霉。在4℃下存储，羽碳双基双层微胶囊菌剂存储12个月后，仍然保持85％以上的活菌数。室温下存储12个月，仍然保存20％以上活菌数，活菌数下降没有超过一个数量级。
3、本发明提供的淡紫拟青霉M-1的羽碳双基双层微胶囊含有膨化鸡羽毛粉和生物炭能增强微胶囊的机械强度、通透性及传质性能，增强对淡紫拟青霉的保护性能。此外，膨化鸡羽毛粉不容易被普通微生物分解，但能被淡紫拟青霉M-1作为碳氮源分解利用。实验表明，添加了膨化羽毛粉制成的羽碳双基双层微胶囊比没有膨化羽毛粉的炭基双层微胶囊具有更优异的土壤定殖效果。
附图说明:
图1是海藻酸钠质量分数对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图2是菌粉与海藻酸钠溶液的质量比对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图3是膨化羽毛粉质量分数对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图4是Cacl2浓度对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图5是进料流量对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图6是壳聚糖浓度对淡紫拟青霉包埋率及相对孢子萌发率的影响；
图7是不同剂型及温度下淡紫拟青霉存储过程中有效活菌数变化；
图8是不同剂型淡紫拟青霉在土壤中定殖效果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)M-1于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市先烈中路100号59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo：60596，公开于专利CN202110861550.2，发明名称：一株淡紫拟青霉M-1及其应用中。
实施例1淡紫拟青霉M-1羽碳双基双层微胶囊制备及工艺优化
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌种：淡紫拟青霉M-1(Paecilomyces lilacinus M-1)
1.1.2试剂
硫酸铵、尿素等试剂均为国产分析纯(AR)；葡萄糖、蛋白胨、琼脂均为生化试剂(BR)，均购于广东环凯生物科技有限公司。
1.1.3溶液
解囊液的配制：解囊液：将NaHCO3溶于0.1mol/L PBS(phosphate buffersolution,磷酸盐缓冲液，pH＝7.0)中(NaHCO3的终浓度为0.2mol/L)，过滤除菌。
固化液的配置：固化液的配制：质量分数3％氯化钙溶液，用1mol/L盐酸调节pH值至6.5，灭菌备用。
1.1.4培养基
试管斜面培养基：PDA合成培养基。
一级液体培养基：马铃薯浸出粉300.0g/L，葡萄糖20g/L，溶剂为水，pH自然。配制方法是将各成分混合均匀。
OHIO-agar：葡萄糖5g/L，酵母提取物2g/L，NaNO3 1g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KH2PO41g/L，牛胆粉1g/L，丙酸钠1g/L，琼脂粉18g/L，溶剂为水。配制方法是将各成分混合均匀。
1.2仪器
恒温振荡器(HZQ-X300C)；生化培养箱(SHP-080)；恒温水浴锅；蒸汽灭菌锅；超净工作台；S23C型pH计；压力蒸汽灭菌锅；喷雾干燥塔；自动化种曲机(ZPG 550)；恒温干燥箱；双螺杆挤压膨化机(DSE-30)。
1.3方法
1.3.1淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊的制备
1.3.1.1淡紫拟青霉菌粉制备
将淡紫拟青霉M-1斜面菌种接种到PDA平板上划线，28℃生化培养箱中培养72h，待长出单菌落后，将活化的淡紫拟青霉接种于PDA液体培养基，置于28℃，180rpm的恒温振荡器中培养72h，得到种子液，以5％的接种量将种子液接种于装有2kg的固体发酵培养基(先将麸皮：玉米粉按质量比为1:1混合，再添加麸皮和玉米粉总质量5％的蔗糖，0.1％的尿素和0.1％的硫酸铵，混合均匀灭菌即得)的曲盘中，置于28℃的无菌培养室中培养5-7d，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥24-48h，再将干燥后的物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉菌粉。
1.3.1.2淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊的制备
将海藻酸钠与无菌水混合，与40℃-60℃下加热并不断搅拌使其融化，得到海藻酸钠水溶液备用。将适量菌粉与上述海藻酸钠溶液混合，并加入总量(海藻酸钠溶液+菌粉的总质量)为8％的膨化鸡羽毛粉和生物炭混合物缓慢搅拌，混合均匀后，用蠕动泵将含有菌粉、羽毛粉和生物炭的海藻酸钠悬浮液送入喷雾干燥塔中，料液在高速旋转的离心雾化盘上雾化成小液滴，通过喷嘴喷入一定浓度的CaCl2水溶液中，在100r/min的搅拌速率下固化30min，随后，将海藻酸钙微球滤出，无菌水冲洗去除多余的CaCl2，然后将收集的微胶囊加入一定浓度的壳聚糖溶液(pH 5.8)，100r/min搅拌20min进行二次包衣，最后，将微胶囊(淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊)收集风干以备用。
1.3.1.3膨化鸡羽毛粉的制备
将鸡羽毛进行除杂，清水洗干净，然后烘干，调整鸡羽毛水分含量为22％，加入DSE-30双螺杆挤压膨化机中，设置转速为200r/min，温度为160℃，压力为0.7MPa，冷却后进行粉碎，获得膨化鸡羽毛粉。
1.3.1.4生物炭制备
将玉米秸秆在马弗炉中500℃加热6h，同时持续通入氮气，加热完成后，在干燥环境中冷却并粉碎，获得玉米秸秆生物炭。
1.3.2微胶囊中菌体的释放以及活菌数测定
准确称取1g微胶囊样品，加入9mL解囊液中，震荡10min至完全解囊。将混合液梯度稀释后涂布与PDA培养基上，28℃培养72h并计数。
1.3.3淡紫拟青霉包埋率的测定
微胶囊的包埋率按照公式(1)计数。
Figure BDA0003915358030000071
其中N是指包埋于微胶囊中的活菌总数，N0是指制备微胶囊时浓缩菌液中的活菌总数。
1.3.4淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊相对孢子萌发率实验
各处理淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊分装在铝箔袋中，室温(平均气温：平均湿度)下避光储藏，储藏3个月后测定活菌数，并计算相对孢子萌发率，各处理重复3次。
Figure BDA0003915358030000081
1.3.5淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊制备工艺优化
1.3.5.1淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊制备工艺优化单因素试验
以相对孢子萌发率为主要评价，以包埋率为辅助评价指标，分别考察海藻酸钠质量分数(1％、2％、3％、4％、5％)、菌粉与海藻酸钠溶液的质量比(1:100、2:100、4:100、6:100、8:100、10:100、12:100)、膨化鸡羽毛粉质量分数(0％、2％、4％、6％、8％，其余为生物炭，羽毛粉和生物炭的总量为8％保持不变)、CaCl2浓度(0.5％、1％、2％、3％、4％、5％，质量分数)、进料流量(0.5L/h、1L/h、2L/h、3L/h、4L/h、5L/h)、壳聚糖浓度(0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％，质量分数)对淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊包埋效果的影响。
1.3.6.2淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊制备工艺响应面优化试验
根据单因素实验结果，以相对孢子萌发率(Y)为响应值，选取对响应值影响显著的海藻酸钠质量分数(A)、菌粉与海藻酸钠溶液的质量比(B)、进料流量(C)和壳聚糖浓度(D)4个因素，进行4因素3水平的响应面分析实验，确定最优的微胶囊制备工艺，设计因素与水平见表1。
Figure BDA0003915358030000082
2结果与分析
2.1淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊制备工艺优化单因素实验结果
2.1.1海藻酸钠质量分数的影响
海藻酸钠是带负电荷的天然高分子多糖，当与Ca2+接触时，海藻酸钠结构中的羧酸根阴离子与钙离子之间交联，结合成“蛋盒”式结构的海藻酸钙，最终形成三维网络状的凝胶，将淡紫拟青霉截留在微胶囊中。海藻酸盐凝胶条件温和，本身对微生物无毒害作用，其浓度会影响微胶囊的机械强度、传质性能等，进而影响包埋入其中微生物的活性。如图1可知，随海藻酸钠浓度的增加，微胶囊的包埋率先增加后减小。在海藻酸钠浓度为2％时，微胶囊的包埋率最大达到90.15％，存放3个月后的微胶囊的相对孢子萌发率为71.34％。随着海藻酸钠浓度的增加，存放3个月后的微胶囊的相对孢子萌发率呈逐渐增加到稳定不变的趋势。在海藻酸钠浓度为3％时，孢子相对萌发率达到稳定值75.34％，此时微胶囊的包埋率为89.64％，与海藻酸钠浓度为2％时的包埋率无显著差异性。因此，确定最优的海藻酸钠质量分数为3％。
2.1.2菌粉与海藻酸钠溶液的质量比的影响
如图2所示，随着菌粉与海藻酸钠溶液的质量比增加，微胶囊的包埋率和相对包子萌发率呈现降低趋势，在质量比为1:100时，微胶囊的包埋率和相对孢子萌发率最大，而当质量比大于2:100时，包埋率和相对孢子萌发率下降趋势快速增大。综合考虑成本因素，确定最优的菌粉与海藻酸钠质量比为2:100。
2.1.3膨化鸡羽毛粉质量分数的影响
如图3所示，在0％-8％之间，随着膨化羽毛粉质量分数的增加，即生物炭质量分数的减少，包埋率呈现逐渐减少趋势，在0～4％的区间内，包埋率降低幅度缓慢，在质量分数为0％时，包埋率达到最大值为91.26％，在质量分数为4％时，包埋率为90.48％，而4％～8％区间内，包埋率降低幅度较大；在0％-8％之间，随着膨化羽毛粉质量分数的增加，相对孢子萌发率呈现先增加后减少趋势，在质量分数为4％时，相对孢子萌发率达到最大值为84.42％。分析原因为，生物炭比膨化羽毛粉具有更大的比表面积以及更好的吸附性能，在制备微胶囊的过程中，生物炭可以在壁材溶液中吸附更多的微生物。在膨化羽毛粉和生物炭总添加量一定的基础上，随着膨化羽毛粉质量分数的增加，生物炭质量分数会随之减少，对微生物的吸附力会下降。因此，确定最优的膨化羽毛粉质量分数为4％。
2.1.4CaCl2浓度的影响
如图4所示，在0.5％-3％之间，随着CaCl2浓度的增加，微胶囊的包埋率呈现先增加后降低的变化趋势。在CaCl2浓度为3％时达到最大值92.34％，此时相对孢子萌发率80.34％。随着CaCl2浓度的增加，相对孢子萌发率呈现先增加然后趋于稳定的变化趋势。在CaCl2浓度达到1％后，相对孢子萌发率达到最大值80.78％，而此时包埋率为87.35。分析原因是，海藻酸钠中的Na+被适量的Ca2+取代形成蛋盒”式结构，但是当CaCl2浓度过低或过高时，导致微胶囊内部的网状结构分布不均，从而表现为对微生物包埋以及保护程度有所差异。综合考虑包埋率和相对孢子萌发率，选择最佳的CaCl2浓度为3％。
2.1.5进料流量的影响
进料流量的大小决定壁材的流化状态，因而是影响喷雾质量和微胶囊颗粒大小及均匀性的重要参数。如图5所示，随着进料流量的增大，在0.5L/h-5L/h的范围内，包埋率和相对种子萌发率呈现先快速增加后缓慢降低的趋势，在进料流量为3L/h时包埋率和相对孢子萌发率达到最大值，分别为88.66％和82.15％。因此，选取最佳的进料流量是3L/h。
2.1.6壳聚糖浓度的影响
由图6可知，在0.2％～1.2％之间，随着壳聚糖浓度的增加，微胶囊的包埋率先增加，在0.8％时达到最大值93.77％，此时微胶囊的相对孢子萌发率为83.66％；随着壳聚糖浓度继续增加，包埋率趋于稳定稍有减小，在壳聚糖浓度1.2％时，包埋率为92.19％，此时微胶囊的相对孢子萌发率为83.98％。原因是：壳聚糖溶液浓度会影响到壳聚糖分子扩散的快慢，进而影响成膜效果，对微胶囊的性能产生影响。壳聚糖浓度增加，壳聚糖分子的扩散推动力增大，结合位点数增加，壳聚糖与海藻酸钠的交联程度也越强，微胶囊膜通透性降低，减少了外环境对微胶囊内菌体的伤害。壳聚糖溶液浓度增加其黏度也会变大，当溶液浓度达到一定程度时其流变性能也会发生改变，壳聚糖分子扩散缓慢，壳聚糖与海藻酸钠的交联作用也相应变弱，微胶囊透氧性增加，从而导致包埋效率稍有减小。壳聚糖浓度在0.8％、1.0％、1.2％之间微胶囊的相对孢子萌发率差异不显著，考虑经济节约因素，选择壳聚糖浓度为0.8％。
2.2Box-Behnken试验设计及结果
根据单因素试验结果，选择对相对孢子萌发率影响较为显著的因素海藻酸钠质量分数(A)、菌粉与海藻酸钠溶液的质量比(B)、进料流量(C)和壳聚糖浓度(D)为变量，以相对孢子萌发率(Y)为响应值进行响应面优化试验，响应面试验结果见表2，方差分析见表3。
表2优化响应面试验设计与结果
Figure BDA0003915358030000111
Figure BDA0003915358030000121
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表3回归模型方差分析
Figure BDA0003915358030000122
Figure BDA0003915358030000131
利用软件Expert Design10.0对表2试验结果进行分析，得到4个影响因素与相对孢子萌发率之间的二次回归方程：Y＝+11.79250000000000+11.24083333333331*A+2.15333333333333*B+13.49250000000001*C+70.79166666666674*D-1.76541666666666*A^2-0.62791666666667*B^2-1.81541666666667*C^2-41.26041666666670*D^2。
2.3模型验证
通过回归模型分析，得到淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊制备的最佳工艺条件：海藻酸钠质量分数(3.183％)、菌粉与海藻酸钠溶液的质量比(1.714:100)、进料流量(3.713L/h)和壳聚糖浓度(0.858％)，为方便操作，将以上数据修正为：海藻酸钠质量分数3.183％、菌粉与海藻酸钠溶液的质量比1.71:100、膨化羽毛粉用量为4％，生物炭用量为4％，CaCl2的浓度为3％，进料流量为3.7L/h、壳聚糖浓度为0.858％，以此条件进行验证试验，3次试验的平均相对孢子萌发率为为86.95％，基本与模型的预测值86.966％相符。
2.4淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊存储过程中有效活菌数的变化
由图7可以看出，淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊菌剂(按2.3模型制备的)在两种温度下存储，有效活菌数降低情况不同，在4℃下存储，微胶囊菌剂存储12个月后，仍然保持85％以上的活菌数。室温下存储12个月，仍然保存20％以上活菌数，活菌数下降没有超过一个数量级。
实施例2淡紫拟青霉M-1羽碳双基双层微胶囊土壤定殖实验
取华南地区酸性红壤土(去除颗粒较粗的土块、砂砾以及其他杂物)，将淡紫拟青霉M-1羽碳双基双层微胶囊(按实施例1的2.3模型制备的)、淡紫拟青霉M-1碳基双层微胶囊(按实施例1的2.3模型制备的，将4％的膨化羽毛+4％的生物炭全部用8％生物炭替换，其余步骤不变)与淡紫拟青霉M-1菌粉(实施例1的步骤1.3.1.1制备的)分别与土壤进行拌匀，使土壤中活孢子数达到大约为1*106CFU/g。将混匀后的土壤样品装入高30cm，直径15cm的花盆中，通过称量，将土壤样品装成重量及松紧度较一致的6盆，分2组进行试验，每组3盆。室温下保存，隔1d，15d，30d，60d，90d和120d取样，测离土壤表层15cm的深度取样，每个处理取约两份10g左右的土样，一份于80℃烘箱防治12h烘干测重，另一份用于分离淡紫拟青霉。10g处理土样加90mL无菌水，充分震荡10min，将混合液梯度稀释后涂布在OHIO-agar培养基上，28℃培养72h并计数。所得值以log10转换为对数表示。
Figure BDA0003915358030000141
由图8可知，将淡紫拟青霉3种类型菌剂施加到土壤中，在0d-30d的期间内，3种类型菌剂形成的菌落数无显著差异，并且呈现增长趋势，即3种类型菌剂在0d-30d的时间内，在土壤中定殖效果差异不大，并且由于菌株的生产繁殖，菌数呈现增加趋势。在30d-90d的期间内，淡紫拟青霉碳基双层微胶囊和淡紫拟青霉菌粉在土壤中的活菌数呈现下降趋势，且淡紫拟青霉菌粉呈现继续下降趋势。以碳基双层微胶囊类型施入土壤90d后，淡紫拟青霉的含量为3.7*104CFU/g，相比刚施入土壤中时淡紫拟青霉1.4*106含量，下降了2个数量级；而菌粉类型施入土壤90d后，淡紫拟青霉的含量为1.2*101CFU/g，相比刚施入土壤中时淡紫拟青霉1.3*106含量，急剧下降了5个数量级，由此可见，采用碳基双层微胶囊对淡紫拟青霉进行包埋，相比菌粉剂型，能很好的增加淡紫拟青霉在土壤的定殖效果。在30d-90d的期间内，淡紫拟青霉羽碳双基双层微胶囊在土壤中活菌数呈现先升高后降低趋势，在50d时，土壤中活菌数达到最高值为5.1*107CFU/g，在90d后，土壤中存在的活菌数降到最低值为2.24*105CFU/g，相比刚施入土壤中时淡紫拟青霉1.4*106含量下降一个数量级，相比碳基双层微胶囊及剂型以及菌粉剂型，分别高出1个数量级和4个数量级。由此可见，添加了膨化羽毛粉制成的羽碳双基双层微胶囊比没有膨化羽毛粉的炭基双层微胶囊具有更优异的土壤定殖效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施内容方式不收上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂的制备方法，其特征在于，将淡紫拟青霉菌粉与海藻酸钠水溶液混合，加入膨化鸡羽毛粉和生物炭搅拌，混合均匀后，送入喷雾干燥塔中，料液在离心雾化盘上雾化成小液滴，通过喷嘴喷入CaCl2水溶液中，固化后将海藻酸钙微球滤出，无菌水冲洗去除多余的CaCl2，然后将收集的微胶囊加入壳聚糖溶液中进行二次包衣，收集微胶囊风干，获得淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂；
所述淡紫拟青霉为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)M-1，该菌于2019年3月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：中国广东省广州市广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC NO.60596；所述淡紫拟青霉菌粉的制备方法，具体步骤如下：将淡紫拟青霉斜面菌种接种到PDA平板上划线，28℃生化培养箱中培养72h，待长出单菌落后，将活化的淡紫拟青霉接种于PDA液体培养基，置于28℃，180rpm的恒温振荡器中培养72-84h，得到种子液，以质量比5％的接种量将种子液接种于固体发酵培养基的曲盘中，置于28℃的无菌培养室中培养5-7d，培养结束后，在35-40℃下鼓风干燥24-48h，再将干燥后的物料进行粉碎，得到淡紫拟青霉菌粉；
所述喷雾干燥塔的进料流量为3.7L/h，所述的海藻酸钠水溶液中海藻酸钠质量分数为3.183％，所述的淡紫拟青霉菌粉与海藻酸钠水溶液的质量比为1.71:100，膨化羽毛粉质量分数为4％，生物炭质量分数为4％，CaCl2的浓度为3％，壳聚糖浓度为0.858％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述羽毛粉为过100目筛的膨化鸡羽毛粉。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述膨化鸡羽毛粉的制备方法，具体步骤如下，将鸡羽毛进行除杂，清水洗干净，然后烘干，调整鸡羽毛水分为18％-22％，加入DSE-30双螺杆挤压膨化机中，设置转速为180-220r/min，温度为155-170℃，压力为0.6-0.8MPa，冷却后进行粉碎，获得膨化鸡羽毛粉。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物炭为过100目筛玉米秸秆生物炭。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述玉米秸秆生物炭的制备方法，具体步骤如下；将玉米秸秆在马弗炉中500℃加热6h，同时持续通入氮气，加热完成后，在干燥环境中冷却并粉碎，获得玉米秸秆生物炭。
6.一种按照权利要求1所述的制备方法制备得到的淡紫拟青霉的羽碳双基双层微胶囊制剂。
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