CN109006175B - 一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法 - Google Patents

一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，该方法包括以下步骤：(1)菌膜的培养，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养；将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；(2)子实体的培养，1)后熟期：在23～25℃下，环境湿度65％‑75％；2)逆境催蕾期：温度23～25℃,光照强度50Lux～150Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度100Lux～550Lux；3)生长期：保持光照强度为50Lux～100Lux,温度为23～25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天；本发明利用磁力搅拌器使溶氧增加，并在中间形成漩涡，使菌丝能够附在壁上生长，满足虫草子座生长需要的物理支撑条件，生产周期缩短,生长条件易于控制，有效成份虫草酸提高1倍以上。

Description

一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法
技术领域
本发明涉及一种培养方法，具体是一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，属于食药用菌的栽培技术领域。
背景技术
蛹虫草别名北冬虫夏草，有“中药三大宝之一”之称，它是由虫体和真菌子座组成的复合体。在我国主要分布于湖南、湖北、吉林、河北等省。蛹虫草作为我国有名的中药和营养品，长期以来被视为珍贵的滋补中药和藏药，虫草酸，即D-甘露醇，虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。虫草酸能抑制各种病菌的成长，具有利尿脱水、提高血浆渗透压、镇喘祛痰、抗自由基等药理作用，虫草酸能保肺益肾、止血化痰，明显增强支气管纤毛活动能力，调节支气管平滑肌，虫草酸能降低血液中胆固醇、甘油三脂的含量，预防血栓的形成，并且对多种疾病有一定的疗效。甘露醇现已被认为是发酵虫草菌丝体中活成分的重要测试指标。
蛹虫草已实现人工培育，将虫草菌接种至不同的培养基上，进行生长繁殖，根据培养基的不同，可大致分为三类。第一类，以小麦、大米等谷类为培养基培育，培养基的底部会凝结成块，切除之后，被商人起名为“虫草花”。第二类，以虫蛹等为培养基培育，这是真正的类似野生蛹虫草，但采用家蚕和柞蚕蛹人工批量培育，药理与野生种相似，药效比之更好。第三类，以液体发酵液等为培养基培育，菌丝体在液体培养条件下生长，到一定阶段会形成菌膜，控制一定条件，在菌膜上可以长出子实体，这是一种生长周期短、条件易于控制的培育方法。
上述三种生产工艺存在如下缺陷:
1、生产周期长,能耗大，栽培周期一般25-50天。
2、由于小麦、大米等谷类原料来源广泛,品质难控制,生产的虫草子座往往存在诸多食品安全隐患(如农药残留、重金属等)；而利用蚕蛹出草又受时间限制(只有产蚕蛹的春季和秋季可以生产)、成本高等问题。
3、以液体发酵液等为培养基培育蛹虫草子座，虽然是一种生长周期短、条件易于控制的培育方法，但也存在着形成菌膜时易污染，菌丝挂壁容易失败等缺点。
目前,国内关于利用液体发酵培养基培育蛹虫草方面的授权专利和公开中请技术较少,比如,陈国卿等在申请号为93105056.1的发明专利“北冬虫夏草菌人工栽培子实体的方法”中,提到了将北冬虫夏草接种液体培养基经过培养得到子实体的方法,但是,在权利要求和实例说明中却没有进-步提供具体的技术工艺控制参数和生产效果,可以理解为发明者只是给出了液体培养蛹虫草子实体的概念,并没有具体的生产技术和方法。冀宏等在“一种液体培育蛹虫草子座的方法”(申请号:201410632217.4)中提供具体的技术工艺控制参数和生产效果，但对最关键的菌丝挂壁，菌膜形成条件没有具体的生产技术和方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种生长周期短、条件易于控制的液体培育蛹虫草子座的方法,所制备的蛹虫草子座有效成分含量高。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，包括以下步骤：
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖15～28克，蚕蛹粉8～18克，硫酸镁0.8～1.8克，磷酸二氢钾1.5～3克，硫胺素12～22毫克，核黄素12～22毫克，水1000毫升。培养基中添加蚕蛹粉，在培养基内有很多悬浮的颗粒，这些了颗粒很快就会成为菌丝的发菌点，后期菌丝生长的速度会很快。而且可以增加培养基的粘度，在磁力搅拌器搅拌过程中，在三角瓶壁上(或其他器皿)增加液体停留时间，使菌丝容易在壁上生长，形成挂壁现象。一旦菌丝挂壁形成，表面的菌丝会由于干燥而老化，添加蚕蛹粉的培养基由于粘度的影响，怎加停留时间，可以保持菌丝湿度，减慢菌丝老化。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养；所述蛹虫草菌种选用ACCC50562(为保藏号，如专利文献CN103005402A公开的)或ACCC50383(保藏号)中的一种。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为21～27℃静置24小时,在转速为600～800转/min，温度为23～25℃条件下培养36～72小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。利用传统转动(例如摇床)来制作液体菌种，传统转动一般是使用外力，推动三角瓶或其他器皿进行旋转，来带动里面的液体。转动时，由于转动幅度较大，液面晃动幅度也比较大，菌丝不容易挂壁，而且传统搅拌模式中部液体转动幅度最小，会形成固体沉淀，搅拌不均匀现象。本发明使用磁力搅拌器来制作液体菌种，通过内部形成漩涡来使液体流动，所有搅拌比较均匀，不容易形成沉淀，更重要的是液面幅度相对较稳，菌丝容易形成挂壁，形成挂壁现象。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在23～25℃下，环境湿度65％-75％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度23～25℃,光照强度50Lux～150Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度100Lux～550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；为满足虫草子座的生产需要，作为优选，在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到1～2cm时保持光照强度为50Lux～100Lux,温度为23～25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。同样，为满足虫草子座的生产需要，在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
本发明的有益技术效果是：
(1)利用磁力搅拌器使溶氧增加，并在中间形成漩涡，使菌丝能够附在壁上生长(挂壁现象)，满足虫草子座生长需要的物理支撑条件(挂壁)，这是本发明培养方法生产周期缩短的关键。
(2)生产周期缩短,通过液体发酵的生长代谢转化作用可以提高前体物质的细胞摄入量,从而可以通过单因子调控液体培养基配方的方法,提高蛹出草子座有效成分含量，较现有的液体培育蛹虫草子座培养方法生产周期缩短7-9天。
(3)通过调控液体培养基配方的方法,在确保食品安全的前提下,提高蛹出草子座有效成分含量,尤其是虫草素、虫草酸等,品质有保障,经检测，有效成份虫草酸较传统方法培养的产品提高1倍以上。
(4)生长条件易于控制,放置在磁力搅拌培养箱中温度可随意调控。并且每个培养箱可放置多个(如27个)瓶菌丝便于工业化生产。
具体实施方式
实施例1
一种液体培育蛹虫草子座的方法,是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，菌种选用ACCC50562。培养包括以下步骤:
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖20克，蚕蛹粉15克，硫酸镁0.8克，磷酸二氢钾3克，硫胺素12毫克，核黄素18毫克，水1000毫升。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为21℃静置24小时,在转速为600转/min，温度为23℃条件下培养48小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在25℃下，环境湿度70％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度25℃,光照强度100Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到1cm时保持光照强度为50Lux,温度为23℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
实施例2
一种液体培育蛹虫草子座的方法,是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，菌种选用ACCC50383。培养包括以下步骤:
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖15克，蚕蛹粉8克，硫酸镁1.5克，磷酸二氢钾1.5克，硫胺素20毫克，核黄素12毫克，水1000毫升。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为27℃静置24小时,在转速为750转/min，温度为23℃条件下培养36小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在23℃下，环境湿度65％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度23℃,光照强度50Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度400Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到2cm时保持光照强度为100Lux,温度为25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
实施例3
一种液体培育蛹虫草子座的方法,是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，菌种选用ACCC50383。培养包括以下步骤:
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖18克，蚕蛹粉10克，硫酸镁1克，磷酸二氢钾2克，硫胺素18毫克，核黄素22毫克，水1000毫升。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为23℃静置24小时,在转速为800转/min，温度为23℃条件下培养72小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在23℃下，环境湿度65％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度23℃,光照强度150Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到1cm时保持光照强度为100Lux,温度为23℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
实施例4
一种液体培育蛹虫草子座的方法,是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，菌种选用ACCC50562。培养包括以下步骤:
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖28克，蚕蛹粉18克，硫酸镁1.8克，磷酸二氢钾2.5克，硫胺素22毫克，核黄素16毫克，水1000毫升。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为25℃静置24小时,在转速为600转/min，温度为23℃条件下培养36小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在25℃下，环境湿度75％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度25℃,光照强度100Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度4时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到2cm时保持光照强度为50Lux,温度为25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
实施例5
一种液体培育蛹虫草子座的方法,是将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种接种到培养基上进行培养，菌种选用ACCC50562。培养包括以下步骤:
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖25克，蚕蛹粉16克，硫酸镁1克，磷酸二氢钾2.8克，硫胺素16毫克，核黄素14毫克，水1000毫升。
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养。
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为23℃静置24小时,在转速为700转/min，温度为25℃条件下培养48小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌。
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在23℃下，环境湿度70％。
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度25℃,光照强度150Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度200Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。白天可以利用自然的散射光,夜晚可以酌情利用日光灯补充光照2-4小时。
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到1cm时保持光照强度为100Lux,温度为25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天。在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
检测依据为中华人民共和国农业行业标准NY/T2116-2012(虫草制品中虫草酸和腺苷的测定高效液相色谱法)，结果如下：
样品 虫草酸(mg/g)
实施例1 1.57×10<sup>2</sup>
实施例2 1.64×10<sup>2</sup>
实施例3 1.63×10<sup>2</sup>
实施例4 1.53×10<sup>2</sup>
实施例5 1.62×10<sup>2</sup>
普通的蛹虫草(虫体子座)虫草酸含量一般为8.12×101～8.72×101，蛹虫草(大米培养子座)虫草酸含量在6.13×101，而上述实施例中虫草酸含量显著提高。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)菌膜的培养
液体培养基采用如下原料配制:葡萄糖15～28克，蚕蛹粉8～18克，硫酸镁0.8～1.8克，磷酸二氢钾1.5～3克，硫胺素12～22毫克，核黄素12～22毫克，水1000毫升；
在培养器皿中加入液体培养基，灭菌后，将蛹虫草菌种接种到液体培养基中进行培养；
将磁力搅拌器置于培养箱内，将所述培养器皿放置在磁力搅拌器上；
培养条件如下:所述培养器皿在温度为21～27℃静置24小时,在转速为600～800转/min，温度为23～25℃条件下培养36～72小时，在形成菌膜后磁力搅拌器停止搅拌；
(2)子实体的培养
1)后熟期：培养条件如下:在23～25℃下，环境湿度65％-75％；
2)逆境催蕾期：环境空气湿度90％以上,温度23～25℃,光照强度50Lux～150Lux,1天后菌丝开始转为淡黄色,保持光照强度100Lux～550Lux，二氧化碳浓度小于0.1％,经过2天出现原基；
3)生长期：当原基分化为虫草子座的形状并生长到1～2cm时保持光照强度为50Lux～100Lux,温度为23～25℃,空气湿度不低于70％，二氧化碳浓度小于0.1％,生长周期为2天；
所述蛹虫草菌种选用ACCC50562或ACCC50383中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，其特征在于：在逆境催蕾期，每天光照时间累计不小于10小时。
3.根据权利要求1所述的一种快速培养蛹虫草子座的液体培养方法，其特征在于：在生长期，每天光照时间累计不小于8小时。
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