CN110122193B - 一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，属于药食两用子实体生产技术领域。一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，步骤为：1）母种及其液体种的制备：以经过驯化培养为抗退化菌种为母种，种于液体培养基，23‑28℃避光静置培养24‑72小时，再摇瓶培养6‑8天，得到液体种；2）固体培养基的制备：以大米和小麦为主料，加入主料质量1.3‑1.5倍的营养液，121℃灭菌1.5‑2小时，冷却后无菌操接入液体种，封口，进入发菌室培养；3）发菌培养及初加工。本发明使用抗退化菌种为母种，在腺苷和虫草素的关系上建立新的液体培养基，通过对发菌培养阶段进行温度和光照控制，可以稳定提高蛹虫草多糖含量和质量。

Description

一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法
技术领域
本发明属于药食两用子实体生产技术领域，涉及蛹虫草的栽培方法，具体涉及一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法。
背景技术
虫草包括冬虫夏草及各种虫草，虫草多糖是虫草中普遍含有的活性物质，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、调节免疫、降血脂、降血糖、保护心脏和肝脏等显著作用。虫草多糖是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、岩藻糖、虫草素、腺苷等组成的高分子多聚糖，而多糖含量的多少是衡量蛹虫草质量标准的重要内容之一。近代研究成果表明，在人工栽培的蛹虫草中粗多糖含量为5-6%，高于天然蛹虫草中多糖的含量，也高于其他虫草中多糖的含量，但是蛹虫草中的多糖存在含量不够稳定的缺点。
近年来在人工栽培蛹虫草的技术领域，以如何提高虫草素的含量为内容甚多，对如何提高多糖的含量研究极少，更无稳定的研究，且现有研究均以单糖为代表确定工艺标准，或者以发酵菌丝的胞内多糖和发酵液的胞外多糖为标志，其粗多糖甚低，这引起均未发挥出蛹虫草多聚糖的食疗意义。
针对现有技术存在的上述缺陷，本发明研发了一种可以提高和稳定蛹虫草子实体多糖含量栽培方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，步骤为：
1）母种及其液体种的制备：以经过驯化培养为抗退化菌种为母种，在无菌条件下将母种接种于液体培养基，23-28℃避光静置培养24-72小时，再23-28℃以120Y/min的条件摇瓶培养6-8天，得到液体种；
2）固体培养基的制备：以大米和小麦为主料，加入主料质量1.3-1.5倍的营养液，121℃灭菌1.5-2小时，冷却后无菌操接入液体种，封口，进入发菌室培养；
3）发菌培养及初加工：发菌阶段时，于25℃避光培养7-9天，当菌丝长至培养基2/3时，进行光照和温度控制管理，其中光照用用LED灯依次进行白光照、蓝光照和避光照，昼夜温度为16-25℃，培养管理12-15天，当子实体生长为0.8-1.2cm时进入生殖阶段；生殖阶段温度23-25℃，使用LED灯白光照，培养15-20天，然后用质量份数为0.3-0.5%白砂糖水喷子实体，培养5-8天；采收未散发孢子进行初加工，先将子实体晾干表水，再用干松针、白酒浸泡20-28小时，取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，贮存20-28小时后，60℃烘干至含水分≥12%，即得。
进一步地，步骤1）所述的母种为抗退化菌种，优选为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC.No 5577，保藏时间：2011年12月12日，专利号：ZL201210248399.6，具体步骤为（1）培养优胜种 ：制备有伴生菌生长的蛹虫草母种管，PDA培养基 + 氯霉素，先斜面接 种伴生菌拟青霉或被毛孢菌种，进行培养，再接入蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种（Cordyceps militaris）保藏单位 ：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日 ：2011 年 12 月 12 日，保藏号 ：CGMCC No. 5577，继续进行培养，使蛹虫草生长旺盛并全部吞没伴生 菌，得到蛹虫草种优胜种管 ； （2）将优胜种管置于0℃的环境中培养 30 天，然后将其置于 18 ～ 25℃条件下恢复生长 3 ～ 5 天 ； （3）将恢复后的优胜种管去掉管塞，置于 15 ～ 25℃的杂菌环境中培养 5 ～ 7 天 ；然后 盖上管塞再将其置于 28 ～ 36℃的杂菌环境中培养 5 ～ 7 天 ；或 先将恢复后的优胜种管置于 28 ～ 36℃的杂菌环境中培养 5 ～ 7 天 ；然后再去掉管塞 将其置于 15 ～ 25℃的杂菌环境中培养 5 ～ 7 天 ； （4）经上述（1）～（3）步骤培养后，试管菌种变色，杂菌生长，其中有少量具有生命活力 的蛹虫草菌丝，将其分离于 PDA 培养基上，置于 18 ～ 25℃条件下培养 6 ～ 8 天后，按制种常 规提纯复壮，得到蛹虫草抗退化菌种；这是因为蛹虫草菌种退化快，一般继代不超过三代，否则绝收，这是蛹虫草生产中的一大难题，即便是三代之内的菌种也得先试验后使用，有的首代就退化减产，多数生产者全凭经验把握；蛹虫草是典型的异宗配合，若菌株中不同时含有两种基因,则不能结实,两种基因比例不同，子实体的形状也有差异；而且草的重要活性物质成分多糖是次生代谢的产物，必须在生产工艺中经过几十天的化学、物理、生物及内外条件的多因素的刺激，才能完成积累，否则不会产生高含量的产品，普通菌种如果历经几十天的多因素刺激，连生存都不存在，更谈不上给性物质多糖的积累了，因此本申请使用抗退化菌种,优选保藏号CGMCC.No 5577的抗退化菌种。
步骤1）所述的液体培养基的配制：蛋白胨10g，蔗糖20g，玉米粗粉5g，麦麸1g，腺苷3.6g，KH2PO43g，MgSO41.5g，水1000mL，PH7煮溶取滤液补足水1000mL，分装于500mL 三角瓶总装量为150mL/瓶，用棉塞和聚丙烯封口，121℃灭菌30分钟；该液体培养基建立在腺苷(C10H13N5 O4)和虫草素（C10H13N5 O3)的关系上，虫草素是多糖中的重要成员，而添加腺苷是核心成分，腺苷既是多糖的重要成员，更是虫草素的前体物质，也是其他物质C、H、O的合成新成员的诱导剂，腺苷受到内外因素的刺激后，O4脱掉一个分子为O3，即成了虫草素也叫3-脱氧腺苷，腺苷还能诱导其他分子合成多糖的诸多物质，在培养出长的过程中，蔗糖、玉米粉，麸皮均为大分子物质，透气性能和活动性能好，在大分子转为小分子物质过程中，腺苷起着重要的促进转化作用。
步骤1）所述的液体培养基先经过灭菌处理，然后在30℃的条件下无菌操作接入母种，其中150mL/瓶的液体培养基接种2-3块2mm2的母种，使得母种漂浮于液面，棉塞封口，25℃避光培养，静置24-72小时，待菌种发开菌丝散发于液面时，在25℃温度下，以120Y/min的条件下摇瓶培养6-8天，观察菌球1-2mm，液体清澈即可，保藏于4-5℃冰箱中，不超过5天内用完。
步骤2）所述的主料以质量比为1:1的大米：小麦为原料，装于栽培容器中，装量为容器量的1/17-1/60；传统培养蛹虫草主料是大米或者小麦，大米发菌快，生长后期没劲，小麦生长期长，生长后劲大，但发酵慢；本发明主料为大米、小麦各占二分之一，透气性好，生长时间长，产量高，二者配合，既生长快又后劲大，有利于多糖的积累。两种主料的配合，是实践的总结，全新的创新。
步骤2）所述的营养液的配制：蔗糖20g，牛奶20mL，玉米粉4g，麦麸1g，KH2PO40.1g，ZnSO40.1g，酵母膏1g，水1000mL，煮溶过滤，取滤液补足1000mL水，即得。
步骤3）所述的发菌阶段：25℃，避光培养7-9天，当菌丝长至培养基2/3时；进入控温光照管理：用LED灯200LX白光照8小时，然后蓝光照8小时，再避光照8小时；同时进行温差控制：昼夜温度为16-25℃，各12小时，每日早晚各通风一次，每次半小时，如此管理12-15天，子实体生长为1cm左右时进入生殖阶段管理。
步骤3）所述的生殖阶段：温度23-25℃，LED灯依次使用200LX、500LX、1000LX、1500LX白光照，每昼夜24小时分四段光照，培养15-20天；子实体长至4-6cm时，用0.3-0.5%白砂糖水喷水子实体一次，用LED灯200LX蓝光每天照12小时，避光12小时，培养5-8天，观察子实体的生长状态，在未散发孢子时及时采收。
步骤3）所述的初加工：收取子实体后在阴凉处晾干表水，用干松针20g、60度白酒1000mL浸泡24小时；取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，让洒液渗透于子实体内后，贮存容器内24小时后，60℃烘干至含水分≥12%，封存入库，能使活性物质久储不挥发；其中松针是一种药食两用材料，具有抑制杂菌生长和抗氧化功效，用酒浸泡后取汁喷洒虫草表面，具有杀菌保护和抗氧化作用，可以保证蛹虫草长期储存（十年内）活性成分不挥发，而使用常规初加工方法处理过的蛹虫草储存二年内活性成分会挥发80%左右。
本发明使用抗退化菌种为母种，是生产高含量多糖的基本保证；在腺苷和虫草素的关系上建立新的液体培养基，其中蔗糖、玉米粉，麦麸均为大分子物质，透气性能和活动性能好，在大分子转为小分子物质过程中，腺苷起着重要的促进转化作用；固体培养基为大米和小麦，透气性好，生长时间长，产量高；蛹虫草之所以经过培养能产生高含量且稳定的多糖，是由其基因的高表达实现的，基因只是具有了高表达的可能性，不一定具有必然性，要实现其必然性，取决培养的外部环境条件，包括温度、光照、空气，也包括其内部环境条件的生命因子和非生命因子，其中PH值是非常重要的因素，发明人在较高理论指导和大量试验摸索中发明，蓝光的刺激要比白光和黄光收获量高，而在生殖阶段，用四段光照15-20天，子实体已长高，并受刺激后有萎缩表现，严重缺水，此时用白糖水喷洒等于浇水，同时大分子糖易被吸收，立即就转化为多糖成分，既增产量又增质量，这些是实践的总结，也是正确理论指导的结果，二使用葡萄糖浇洒，会发生腐败现象；松针用酒浸泡后取汁喷洒虫草表面，具有杀菌保护和抗氧化作用，可极大的延长蛹虫草的储存稳定性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1）使用抗退化菌种为母种，可以为市售菌种，或者自己分离菌种，优选为保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC.No 5577，的菌种，这是关系到蛹虫草能否达到高含量且稳定的多糖的决定性因素之一；
2）液体培养基建立在腺苷(C10H13N5 O4)和虫草素（C10H13N5 O3)的关系上，不仅具有良好的透气性和活动性，腺苷可促进大分子转为小分子物质；
3）固体培养基以大米和小麦为原料，具有透气性好，生长时间长，产量高的优点。
4）发菌培养阶段对温度、光照的控制，以及使用白砂糖水喷洒，不仅可以提高产量，也可以提高蛹虫草的质量；
5）初加工阶段使用松针酒浸泡液喷洒于蛹虫草表面，具有杀菌保护和抗氧化作用，可延长蛹虫草储存过程活性成分的稳定。
具体实施方式
下述实施例仅为本发明的优选技术方案，并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，步骤为：
1）母种及其液体种的制备：
以经过驯化培养为抗退化菌种为母种；
液体培养基的配制：蛋白胨10g，蔗糖20g，玉米粗粉5g，麦麸1g，腺苷3.6g，KH2PO43g，MgSO41.5g，水1000mL，PH7煮溶取滤液补足水1000mL，分装于500mL 三角瓶总装量为150mL/瓶，用棉塞和聚丙烯封口，121℃灭菌30分钟，即得；
将液体培养基先经过灭菌处理，然后在30℃的条件下无菌操作接入母种，其中150mL/瓶的液体培养基接种2-3块2mm2的母种，使得母种漂浮于液面，棉塞封口，25℃避光培养，静置24小时，待菌种发开菌丝散发于液面时，在25℃温度下，以120Y/min的条件下摇瓶培养7天，观察菌球1-2mm，液体清澈即可，保藏于4-5℃冰箱中，不超过5天内用完；
2）固体培养基的制备：
将质量比为1:1的大米和小麦混匀作为主料，分装于栽培容器中，装量为容器量的1/17-1/60，然后加入主料质量1.5倍的营养液，121℃灭菌1.5小时，冷却至30℃以下时，无菌操作法接入液体种5-15mL，封口，进入发菌室培养；
营养液的配制：蔗糖20g，牛奶20mL，玉米粉4g，麦麸1g，KH2PO40.1g，ZnSO40.1g，酵母膏1g，水1000mL，煮溶过滤，取滤液补足1000mL水，即得；
3）发菌培养及初加工：
发菌阶段时，于25℃避光培养7天，当菌丝长至培养基2/3时，进行光照和温度控制管理，循环用LED灯200LX白光照8小时，蓝光照8小时，避光8小时，同时昼夜温度为16-25℃，各12小时，每日早晚各通风一次，每次半小时，循环管理14天，子实体生长为1cm左右时进入生殖阶段管理；
生殖阶段时，温度23-25℃，LED灯白光照200LX、500LX、1000LX、1500LX白光照，每昼夜24小时分四段光照，培养18天，子实体长至4-6cm时，用0.3-0.5%白砂糖水喷水子实体一次，用LED灯200LX蓝光每天照12小时，避光12小时，培养5天，观察子实体的生长状态，在未散发孢子时及时采收；+
初加工时，收取子实体后在阴凉处晾干表水，用干松针20g、60度白酒1000mL浸泡24小时，取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，让洒液渗透于子实体内后，贮存容器内24小时后，60℃烘干至含水分≥12%，封存入库。
实施例2
一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，步骤为：
1）母种及其液体种的制备：
以按照专利号为ZL201210248399.6公开的方法培养获得的抗退化菌种为母种；
液体培养基的配制：蛋白胨10g，蔗糖20g，玉米粗粉5g，麦麸1g，腺苷3.6g，KH2PO43g，MgSO41.5g，水1000mL，PH7煮溶取滤液补足水1000mL，分装于500mL 三角瓶总装量为150mL/瓶，用棉塞和聚丙烯封口，121℃灭菌30分钟，即得；
将液体培养基先经过灭菌处理，然后在30℃的条件下无菌操作接入母种，其中150mL/瓶的液体培养基接种2-3块2mm2的母种，使得母种漂浮于液面，棉塞封口，23℃避光培养，静置48小时，待菌种发开菌丝散发于液面时，在25℃温度下，以120Y/min的条件下摇瓶培养8天，观察菌球1-2mm，液体清澈即可，保藏于4-5℃冰箱中，不超过5天内用完；
2）固体培养基的制备：
将质量比为1:1的大米和小麦混匀作为主料，分装于栽培容器中，装量为容器量的1/17-1/60，然后加入主料质量1.3倍的营养液，121℃灭菌2小时，冷却至30℃以下时，无菌操作法接入液体种5-15mL，封口，进入发菌室培养；
营养液的配制：蔗糖20g，牛奶20mL，玉米粉4g，麦麸1g，KH2PO40.1g，ZnSO40.1g，酵母膏1g，水1000mL，煮溶过滤，取滤液补足1000mL水，即得；
3）发菌培养及初加工：
发菌阶段时，于25℃避光培养9天，当菌丝长至培养基2/3时，进行光照和温度控制管理，循环用LED灯200LX白光照8小时，蓝光照8小时，避光8小时，同时昼夜温度为16-25℃，各12小时，每日早晚各通风一次，每次半小时，循环管理15天，子实体生长为1cm左右时进入生殖阶段管理；
生殖阶段时，温度23-25℃，LED灯白光照200LX、500LX、1000LX、1500LX白光照，每昼夜24小时分四段光照，培养15天，子实体长至4-6cm时，用0.3-0.5%白砂糖水喷水子实体一次，用LED灯200LX蓝光每天照12小时，避光12小时，培养8天，观察子实体的生长状态，在未散发孢子时及时采收；+
初加工时，收取子实体后在阴凉处晾干表水，用干松针20g、60度白酒1000mL浸泡24小时，取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，让洒液渗透于子实体内后，贮存容器内24小时后，60℃烘干至含水分≥12%，封存入库。
实施例3
一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，步骤为：
1）母种及其液体种的制备：
以按照专利号为ZL201210248399.6公开的方法培养获得的抗退化菌种为母种；
液体培养基的配制：蛋白胨10g，蔗糖20g，玉米粗粉5g，麦麸1g，腺苷3.6g，KH2PO43g，MgSO41.5g，水1000mL，PH7煮溶取滤液补足水1000mL，分装于500mL 三角瓶总装量为150mL/瓶，用棉塞和聚丙烯封口，121℃灭菌30分钟，即得；
将液体培养基先经过灭菌处理，然后在30℃的条件下无菌操作接入母种，其中150mL/瓶的液体培养基接种2-3块2mm2的母种，使得母种漂浮于液面，棉塞封口，28℃避光培养，静置72小时，待菌种发开菌丝散发于液面时，在25℃温度下，以120Y/min的条件下摇瓶培养6天，观察菌球1-2mm，液体清澈即可，保藏于4-5℃冰箱中，不超过5天内用完；
2）固体培养基的制备：
将质量比为1:1的大米和小麦混匀作为主料，分装于栽培容器中，装量为容器量的1/17-1/60，然后加入主料质量1.4倍的营养液，121℃灭菌2小时，冷却至30℃以下时，无菌操作法接入液体种5-15mL，封口，进入发菌室培养；
营养液的配制：蔗糖20g，牛奶20mL，玉米粉4g，麦麸1g，KH2PO40.1g，ZnSO40.1g，酵母膏1g，水1000mL，煮溶过滤，取滤液补足1000mL水，即得；
3）发菌培养及初加工：
发菌阶段时，于25℃避光培养8天，当菌丝长至培养基2/3时，进行光照和温度控制管理，循环用LED灯200LX白光照8小时，蓝光照8小时，避光8小时，同时昼夜温度为16-25℃，各12小时，每日早晚各通风一次，每次半小时，循环管理12天，子实体生长为1cm左右时进入生殖阶段管理；
生殖阶段时，温度23-25℃，LED灯白光照200LX、500LX、1000LX、1500LX白光照，每昼夜24小时分四段光照，培养20天，子实体长至4-6cm时，用0.3-0.5%白砂糖水喷水子实体一次，用LED灯200LX蓝光每天照12小时，避光12小时，培养6天，观察子实体的生长状态，在未散发孢子时及时采收；+
初加工时，收取子实体后在阴凉处晾干表水，用干松针20g、60度白酒1000mL浸泡24小时，取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，让洒液渗透于子实体内后，贮存容器内24小时后，60℃烘干至含水分≥12%，封存入库。
为了验证本发明的效果，使用苯酚-硫酸法测定依据上述实施例1-3栽培获得的蛹虫草的多糖含量，并与按照传统方法获得的蛹虫草的多糖含量分别进行测定比较，结果如下表。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
从表1可以看出，依据本发明方法栽培获得的蛹虫草多糖高且稳定，相当于传统蛹虫草多糖含量的10倍之多。

Claims (1)

1.一种稳定高含量多糖的蛹虫草栽培方法，其特征在于，步骤为：
1）母种及其液体种的制备：以经过驯化培养为抗退化菌种为母种，配制液体培养基，将液体培养基先经过灭菌处理，然后在30℃的条件下无菌操作接入母种，其中150mL/瓶的液体培养基接种2-3块2mm2的母种，使得母种漂浮于液面，棉塞封口，25℃避光培养，静置24-72小时，待菌种发开菌丝散发于液面时，在25℃温度下，以120Y/min的条件下摇瓶培养6-8天，观察菌球1-2mm，液体清澈即可，保藏于4-5℃冰箱中，不超过5天内用完；
所述的液体培养基的配制：蛋白胨10g，蔗糖20g，玉米粗粉5g，麦麸1g，腺苷3.6g，KH2PO43g，MgSO41.5g，水1000mL，PH7煮溶，取滤液补足水1000mL，分装于500mL 三角瓶总装量为150mL/瓶，用棉塞和聚丙烯封口，121℃灭菌30分钟，即得；
2）固体培养基的制备：以质量比为1:1的大米和小麦为主料，加入主料质量1.3-1.5倍的营养液，121℃灭菌1.5-2小时，冷却后无菌操作，接入液体种，封口，进入发菌室培养；
所述的营养液的配制：蔗糖20g，牛奶20mL，玉米粉4g，麦麸1g，KH2PO40.1g，ZnSO40.1g，酵母膏1g，水1000mL，煮溶过滤，取滤液补足1000mL水，即得；
3）发菌培养及初加工：发菌阶段时，于25℃避光培养7-9天，当菌丝长至培养基2/3时，进行光照和温度控制管理，其中用LED灯200LX白光照8小时，然后蓝光照8小时，再避光照8小时，昼夜温度为16-25℃，每日早晚各通风一次，每次半小时，如此管理12-15天，子实体生长为1cm左右时进入生殖阶段管理；
生殖阶段温度23-25℃，LED灯依次使用200LX、500LX、1000LX、1500LX白光照，每昼夜24小时分四段光照，培养15-20天，子实体长至4-6cm时，用0.3-0.5%白砂糖水喷水子实体一次，用LED灯200LX蓝光每天照12小时，避光12小时，培养5-8天，观察子实体的生长状态，在未散发孢子时及时采收；
收取子实体后在阴凉处晾干表水，用干松针20g、60度白酒1000mL浸泡24小时；取滤液喷洒于子实体表面并搓揉，让洒液渗透于子实体内，贮存容器内24小时后，60℃烘干至含水分≥12%，封存入库。
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