CN107027516A - 一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用，富硒蝉花虫草的培养方法包括以下步骤：（1）在培养基上进行蝉花虫草菌种的活化培养；（2）制备含硒酸盐的液体培养基，将活化后的蝉花虫草菌种进行发酵培养；（3）制备子实体富硒培养基，培养富硒蝉花虫草孢梗束；（4）采收后的富硒蝉花虫草在45℃以下烘干或冷冻干燥，使其含水量控制在8%以下后储存。本发明培养的蝉花虫草，能大幅度提高蝉花虫草子实体的硒含量，子实体硒含量可达84‑146 mg/kg，且蝉花虫草子实体的生长势强、色泽鲜艳，从而提高了蝉花的营养和药用价值；另外，本发明实施条件容易达到，能进行大规模行业推广。

Description

一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用。

背景技术

蝉花，又名虫花、蝉草、蝉茸等，是蝉棒束孢(亦称蝉拟青霉)寄生在某些蝉若虫上形成的菌虫复合体；是真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲、肉座菌目、麦角菌科、虫草属真菌，为中国名贵传统中药材；主要分布于安徽、云南、福建、浙江、江西、四川等地。蝉花的许多活性和营养成分与冬虫夏草类似，有些成分的含量甚至高于冬虫夏草。而且是目前已有报道的500余种虫草菌中极少数可以大规模培养的虫草之一。与冬虫夏草一样，蝉花能滋补人体，具有多种药理功能，是冬虫夏草的理想替代品。人工培养的蝉花的蛋白质、氨基酸、必须氨基酸、微量元素钾和镁的含量均超过冬虫夏草和蛹虫草。多糖作为其主要的一种功效成分，具有多种药理活性。研究表明，蝉花多糖具有免疫调节、抑制肿瘤、抗病毒、抗疲劳、抗应激作用、镇静催眠作用、滋补强壮作用、解热镇痛作用、改善肾功能、促进造血系统功能、提升营养状况等作用。

现代流行病学调查证实，缺硒可导致许多疾病的发生。目前已知的与缺硒有关的人类疾病有40多种，包括癌症、心脑血管疾病、糖尿病、肝病、高血压、性功能减退等，近年来研究发现艾滋病人的血硒含量低于正常人体血硒含量。中国营养学会推荐国人每日从饮食中摄取的硒为50-250微克之间，世界卫生组织推荐的人体每日硒摄入量为400微克。我国是一个贫硒国，72％的地区处于土壤贫硒带。国人每日正常硒摄入量仅为17-32微克之间，最低在8微克以下，按此标准，国人硒的摄入量不足，长此以往，对人体健康会造成不利影响，因此，补硒对于维持缺硒人群健康十分重要。以往补硒采用直接补充无机硒的方法，无机硒(主要是亚硒酸钠)吸收不稳定，而且安全量不易把握，易造成中毒，有机补硒的方法逐步成为人们补硒的重要途径。近年来，随着人们对硒的作用及食品安全的深入认识，通过食用富含有机硒的食品补硒成为人体补硒的重要形式，但目前能够提供稳定有机硒含量的食品非常少，很难达到定量补硒的目的。研究证明：大部分粮食、蔬菜等农作物对硒元素的吸收是有限的，甚至是不能吸收，而真菌对硒元素的吸收别比较好。

发明内容

本发明的目的是解决上述现有技术的不足，提供一种富硒蝉花虫草、其培养方法及应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种富硒蝉花虫草的培养方法，包括以下步骤：

(1)在培养基上进行蝉花虫草菌种的活化培养；

(2)制备含硒酸盐的液体培养基，将活化后的蝉花虫草菌种进行发酵培养；

(3)制备子实体富硒培养基，培养富硒蝉花虫草孢梗束；

(4)采收后的富硒蝉花虫草在45℃以下烘干或冷冻干燥，使其含水量控制在8％以下后储存。

优选地，步骤(1)所述的培养基为PDA培养基，培养温度为20～25℃，培养时间为15～20天。

优选地，步骤(2)所述的液体培养基的配方为：每1000mL水中含马铃薯200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.15g、硒酸盐20mg。

优选地，步骤(2)所述的发酵培养包括以下步骤：

(21)选取步骤(1)活化后产孢良好的蝉花虫草菌种，用灭菌的蒸馏水配制成孢子悬浮液；

(22)将含硒酸盐的液体培养基灭菌、分装，每200～250mL液体培养基接种5～10mL孢子悬浮液，置于130～160r/min、20～25℃条件下的振荡培养箱中培养36～56小时；

(23)在种子罐中装入罐体2/3体积的含硒酸盐液体培养基和食用消泡剂，灭菌后冷却至20～25℃，接入200～250mL步骤(22)培养后的菌种，在培养温度为25±1℃，通气量为1.0～1.5vvm的条件下培养36～48小时；

(24)在发酵罐中装入罐体2/3体积的含硒酸盐液体培养基和食用消泡剂，灭菌后冷却至20～25℃，将种子罐中培养好的菌种通过已灭菌的移种管道转入到发酵罐中，培养温度为25±1℃，通气量为1.0～1.5vvm，经36～48小时通气培养，达到对数生长期后备用。

优选地，步骤(3)所述的子实体富硒培养基采用小麦固体培养基，包括小麦和培养液；小麦的添加量为使灭菌前小麦在容器内的厚度达到1.5～2cm，培养液的量为使小麦吸收培养液且灭菌后厚度达到2～3cm。

优选地，所述培养液为：蝉蛹粉50g/L、硒酸盐50～100mg/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、MgSO₄0.3g/L的水溶液。

优选地，步骤(3)所述的培养富硒蝉花虫草孢梗束包括以下步骤：将经发酵培养后的蝉花虫草菌种接种到灭菌后的子实体富硒培养基中，每33～45mL培养基接种5～10mL菌种，在22～25℃、湿度70～80％的条件下避光、无菌、透气培养3～5天；待白色菌丝体在培养基表面全部长满后，开始光照培养，光照强度保持在100～200Lx，且避免直射光照射，并控制湿度在75～90％；经20～30天的培养，子实体成熟部分顶端产孢即可采收。

优选地，所述硒酸盐为硒酸钠、亚硒酸钠、硒酸钾、硒酸铵中的至少一种。

本发明还保护利用所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法培养得到的富硒蝉花虫草。

本发明还进一步保护所述富硒蝉花虫草在制备药物或保健品中的应用。

本发明的有益效果在于：

本方法以蝉花虫草作为硒元素的转化载体，将一定微量的硒元素添加到蝉花虫草的培养基中，通过菌丝的吸收和转化变成安全、容易被人体吸收的有机硒。用该方法培养获得的蝉花虫草孢梗束能大幅度提高有机硒含量，子实体硒含量可达84-146mg/kg，且蝉花虫草子实体的生长势强、色泽鲜艳，从而提高了蝉花的营养和药用价值；另外，本发明实施条件容易达到，所以能进行大规模行业推广。

本发明培养方法在蝉花虫草液体菌种培养的过程中就添加硒酸盐，驯化蝉花虫草菌种对含硒培养环境的适应，在菌丝生长的同时从培养液中吸收、转化和积累硒元素；在固体培养阶段增大培养基中硒酸盐的浓度，以增加蝉花虫草菌丝和子实体形成过程中对硒的转化和积累。依据本发明培养的蝉花虫草子实体的硒含量比普通方法培养的蝉花虫草子实体硒含量增加400-800倍。实验表明，在蝉花虫草培养基中添加硒酸盐，对蝉花虫草子实体的产量还有一定的促进作用。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

一种富硒蝉花虫草的培养方法，该方法包括如下步骤：

第一步：菌种活化培养

1、培养基成分构成：

马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂18g～20g、水1000mL；

2、制备方法

将洗净去皮的马铃薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小时，用6-8层细纱布滤去马铃薯残渣，加入蔗糖20g，琼脂20g，用水量补足1000mL，加热煮沸5min以内，待琼脂完全溶化，趁热迅速分装到试管内，每个试管装5-7mL，用硅胶塞塞紧封口后开始灭菌，高压灭菌锅温度达到121℃-123℃时保压30min出锅，趁热将试管摆成斜面，培养基不得接触硅胶塞，冷却后斜面成固体状。将在冰箱保存的蝉花虫草菌种(该菌种已于2015年12月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO.2015745，保藏地址为中国.武汉.武汉大学)转接至新配制的斜面培养基上，然后将试管放入20-25℃的恒温培养箱中培养15-20天左右，至大量产孢后即可备用。

第二步：富硒蝉花虫草液体菌种的制备

1、培养基配方

马铃薯200g、蔗糖20g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.15g、硒酸盐20mg、水1000mL

2、制备方法

将洗净去皮的马铃薯200g切成薄片加入一定量的水煮沸半小时，用细纱布滤去马铃薯残渣，加入蔗糖20g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.15g、硒酸盐20mg、用水量补足1000mL，加热煮沸5分钟混匀，分装于三角瓶500mL中，每瓶装200-250mL。用硅胶塞封口，置于灭菌锅中灭菌。温度达到121℃-123℃时保压20分钟，冷却后放入超净工作台，连同其他接种用品用具一起照射紫外线30min，准备接种。添加磷酸二氢钾、硫酸镁的作用是由于蝉花在液体培养的过程中，pH值会减低，添加两种盐首先可以缓冲培养液的pH值变化，其次是给菌种生长提供矿质元素。添加低浓度的硒酸盐是让菌种适应有硒元素的环境，利用其在固体培养时的生长。

接种过程要严格遵守无菌操作规程，所以接种用品用具和操作人员必须经过无菌化处理之后方可进行操作。接种过程是将产孢良好的蝉花虫草斜面试管菌种，注入10mL灭菌的蒸馏水，用接种环刮下孢子后倒入50mL三角瓶配制成孢子悬浮液。每个500mL三角瓶接种5-10mL孢子悬浮液。液体培养基量增大时，接种量按上述比例类推增加。将接种好的三角瓶放置于恒温振荡培养箱中，置于130-160r/min，25℃条件下的振荡培养箱培养36-56小时。

种子罐发酵培养：在30L气升式发酵罐中装入20L液体培养基和食用消泡剂，在121℃，0.11MPa条件下保压灭菌30分钟；灭菌后，冷却至20-25℃时，将1瓶上述培养好的500mL摇瓶菌种在火焰保护下种接到发酵罐中，在培养温度为25±1℃，通气量为1.5vvm的条件下培养36-48小时。

发酵罐培养：在300L气升式发酵罐中装入200L液体培养基和食用消泡剂，在121℃，0.11Mpa条件下保压灭菌30-45分钟；灭菌后，冷却至20-25℃时，将种子发酵罐中培养好菌种通过以灭菌的移种管道转入到发酵罐中，培养温度为25±1℃，通气量为1.5vvm，经36-48小时通气培养，达到对数生长期后备用。

第三步：富硒蝉花虫草孢梗束的培养

1、培养基配方：

(采用培养瓶培养时)小麦30g/瓶、培养液33mL-45mL/瓶，

培养的容器既可以是培养瓶，也可以是PP材质的培养盒或者培养袋(其中培养袋的厚度以8丝至10丝为宜)。小麦的添加量根据培养容器的不同而不同，使小麦灭菌前厚度为1.5-2cm，吸收培养液灭菌后厚度为2-3cm。培养基太薄其营养不够，太厚则单位培养基的产量较低。

培养液配方：蝉蛹粉50g/L、硒酸盐50-100mg/L，KH₂PO₄ 0.5g/L和MgSO₄0.3g/L的水溶液；硒酸盐是硒酸钠、亚硒酸钠、硒酸钾、硒酸铵中的一种；蝉蛹粉富含蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等多种氨基酸和B族维生素。称取适量的蝉蛹粉，沸水蒸煮半小时，冷却至室温，并将硒酸盐溶解于其中，使硒酸盐的浓度为50～100mg/kg；将清洗的小麦按照1:1.1～1.4与上述培养液混合。

2、配制程序

根据实际需要的数量，按上述所列的培养基配方配制培养基，混合搅拌均匀，装入清洗干净的培养瓶中，用无菌透气膜封口，橡皮筋包扎。放入灭菌锅，在121℃温度下高压蒸汽灭菌30min。降温后取出放入严格灭菌的接种台中，将蝉花虫草液体菌种接种到培养瓶中的培养基上，每瓶接种5-10mL，无菌透气膜封好口，转入培养室中的培养架上进行培养。培养室的温度应控制在22℃-25℃，湿度控制在70％-80％；避光培养3-5天，待白色菌丝体在培养基表面全部长满后，开始光照培养，照强度保持在100-200Lx，但要避免直射光照射；此时培养室的湿度应控制在75％-90％。经24-28天的培养，子实体成熟部分顶端产孢即可采收。

采收后的富硒蝉花虫草可在45℃以下的烘箱中烘干，也可以采用冷冻干燥法干，含水量必须保持在8％以下才可以储存，包装在真空密封的塑料袋中效果最佳。

检测培养得到的富硒蝉花虫草孢梗束中主要功能和营养成分含量，结果如表1所示：

表1富硒蝉花虫草孢梗束中主要功能和营养成分含量

不同字母表示与对照组比较差异显著，p<0.05

由上表1可以看出，经过富硒培养的蝉花虫草中含有硒元素，而且随着培养料中硒含量的增加，蝉花虫草孢梗束中硒的含量也逐渐增加。富硒蝉花虫草孢梗束中腺苷的含量略有降低，甘露醇、粗脂肪和蛋白质的含量随着硒添加量增加而增加；粗纤维的含量却因硒含量的增加而降低。

检测培养得到的富硒蝉花虫草孢梗束中氨基酸含量情况，结果如表2所示：

表2富硒蝉花虫草孢梗束中氨基酸含量情况

由表2可以看出，培养料中硒的添加量对蝉花虫草孢梗束中总氨基酸的含量无明显的影响作用；部分硒添加剂量组必需氨基酸含量有所增加，必需氨基酸占总氨基酸中的比例略有增加，但增加的水平有限。

通过上述两个表中的数据，可以看出，通过富硒培养的蝉花虫草孢梗束中硒元素的含量明显增加，同时部分营养成分和功能成分的含量还有所改善。富硒蝉花虫草不仅具有蝉花虫草的功能还具有硒的功能和效果，可以制成保健食品作为缺硒人群的良好补剂，也可对慢性肾脏病患者进行补硒治疗，还能制成食用菌食品，提高蝉花的营养和药用价值。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）在培养基上进行蝉花虫草菌种的活化培养；

（2）制备含硒酸盐的液体培养基，将活化后的蝉花虫草菌种进行发酵培养；

（3）制备子实体富硒培养基，培养富硒蝉花虫草孢梗束；

（4）采收后的富硒蝉花虫草在45℃以下烘干或冷冻干燥，使其含水量控制在8%以下后储存。

2.根据权利要求1所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述的培养基为PDA培养基，培养温度为20~25℃，培养时间为15~20天。

3.根据权利要求1所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的液体培养基的配方为：每1000 mL水中含马铃薯200 g、蔗糖20 g、磷酸二氢钾0.3 g、硫酸镁0.15 g、硒酸盐20 mg。

4.根据权利要求1所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，步骤（2）所述的发酵培养包括以下步骤：

（21）选取步骤（1）活化后产孢良好的蝉花虫草菌种，用灭菌的蒸馏水配制成孢子悬浮液；

（22）将含硒酸盐的液体培养基灭菌、分装，每200~250 mL液体培养基接种5~10 mL孢子悬浮液，置于130~160 r/min、20~25℃条件下的振荡培养箱中培养36~56小时；

（23）在种子罐中装入罐体2/3体积的含硒酸盐液体培养基和食用消泡剂，灭菌后冷却至20~25℃，接入200~250 mL步骤（22）培养后的菌种，在培养温度为25±1℃，通气量为1.0~1.5vvm的条件下培养36~48小时；

（24）在发酵罐中装入罐体2/3体积的含硒酸盐液体培养基和食用消泡剂，灭菌后冷却至20~25℃，将种子罐中培养好的菌种通过已灭菌的移种管道转入到发酵罐中，培养温度为25±1℃，通气量为1.0~1.5vvm，经36~48小时通气培养，达到对数生长期后备用。

5.根据权利要求1所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，步骤（3）所述的子实体富硒培养基采用小麦固体培养基，包括小麦和培养液；小麦的添加量为使灭菌前小麦在容器内的厚度达到1.5~2 cm，培养液的量为使小麦吸收培养液且灭菌后厚度达到2~3cm。

6.根据权利要求5所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，所述培养液为：蝉蛹粉50g/L、硒酸盐50~100 mg/L、KH₂PO₄ 0.5 g/L、MgSO₄ 0.3 g/L的水溶液。

7.根据权利要求1所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于，步骤（3）所述的培养富硒蝉花虫草孢梗束包括以下步骤：将经发酵培养后的蝉花虫草菌种接种到灭菌后的子实体富硒培养基中，每33~45 mL培养基接种5~10 mL菌种，在22~25℃、湿度70~80%的条件下避光、无菌、透气培养3~5天；待白色菌丝体在培养基表面全部长满后，开始光照培养，光照强度保持在100~200 Lx，且避免直射光照射，并控制湿度在75~90%；经20~30天的培养，子实体成熟部分顶端产孢即可采收。

8.根据权利要求1~7任一项所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法，其特征在于：所述硒酸盐为硒酸钠、亚硒酸钠、硒酸钾、硒酸铵中的至少一种。

9.利用权利要求1~7任一项所述的一种富硒蝉花虫草的培养方法培养得到的富硒蝉花虫草。

10.权利要求9所述富硒蝉花虫草在制备药物或保健品中的应用。