CN102242154A - 一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用。该方法包括以下步骤：配制培养基、制备培养液、将培养液分装入发酵罐、灭菌、冷却、接种、通气发酵。本发明的培养方法能够产生大量蝉拟青霉菌丝体与分生孢子，且其培养产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能，可以应用于食品、保健品、药品、化妆品等。本发明的液体发酵生产工艺周期短、产量高、不易污染、产品质量稳定、适用于大规模生产。

Description

一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养产物的应用。

背景技术

蝉花，学名蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)，是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌寄生后的产物，是一种菌虫复合体。含有肝糖、虫草酸、多种必需氨基酸、D-甘露醇、多种生物碱、麦角甾醇等活性成分。蝉花中所含的17种氨基酸、多糖、甘露醇均与冬虫夏草相近，所以常用被用作冬虫夏草的代用品。蝉花具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等多种药理作用，可被应用到食品、保健品、药品、化妆品等领域。

现有专利中蝉花的人工培育方法大多数都集中在固体发酵方面，涉及到液体发酵的很少。而固体发酵往往存在培养周期长、产量较低，易污染。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种生产周期短、产量高、产品质量稳定、适用于大规模生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法及其培养物的应用。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，包括以下步骤：

1)菌种制备：包括斜面种制备和摇瓶种制备过程；

2)液体发酵：采用二级发酵；

①一级种子罐发酵：发酵罐中装入培养液，加入消泡剂0.1～0.2％(以培养液重量为基础，按重量百分比计)，灭菌(一般为121℃30～60min)并冷却后将步骤1)中的摇瓶种接入培养，接种量为5～10％，在温度23～25℃下发酵72～96h放罐；

②发酵罐发酵：发酵罐中装入培养液，加入消泡剂0.1～0.2％(以培养液重量为基础，按重量百分比计)，灭菌(一般为121℃30～60min)并冷却后将一级种子罐发酵好的液体种子接入培养，接种量为5～10％，在温度23～25℃下发酵7～10天放罐。

较佳的，所述一级种子罐发酵与发酵罐发酵时的罐压为0.05MPa；所述一级种子罐发酵与发酵罐发酵时的通气量为1∶0.5。

较佳的，步骤1)中，所述斜面种制备包括如下步骤：将分离纯化后的蝉拟青霉菌株(Paecilomyces cicadae)移殖到PSA斜面试管中，在22℃～25℃下培养5～7天，挑选长势好的种作为斜面种。

优选的，所述PSA固体培养基中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g。

较佳的，步骤1)中，所述摇瓶种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在22℃～25℃，振荡频率为130～150r/min的条件下培养3～7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为摇瓶种。

优选的，所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g。

较佳的，步骤2)中，所述一级种子罐和二级种子罐的液体培养基配方(按重量百分比计)为：20～25％的马铃薯煮汁、1～2％蔗糖、蛋白胨-鱼粉0.2～0.5％、磷酸二氢钾0.15～0.3％、硫酸镁0.1～0.25％、硝酸钾0.3～0.5％、消泡剂0.1～0.2％、水71.25～78.15.％、pH6.0～6.5。

所述消泡剂可为植物油。

较佳的，所述生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法采用蝉拟青霉菌株CGMCCNo.3453[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]进行发酵，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏，保藏号为CGMCC No.3453。

本发明所得产物蝉拟青霉菌丝体与发酵液，可用于制备具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能的食品或保健品或药品或化妆品；本发明的方法生产工艺周期短、产量高、产品质量稳定、适用于大规模生产。尤其是采用蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453，并使用本发明的液体发酵方法发酵之后获得的发酵产物中甘露醇含量高于野生蝉花中的含量，并且具有质量稳定，产量较高等突出特点。

附图说明

图1：虫草多糖标准曲线

图2：甘露醇标准曲线

图3：腺苷虫草素校正曲线图

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

1、菌种的制备和培养：

1)菌种制备：包括斜面种制备和摇瓶种制备过程；

其中，斜面种制备包括如下步骤：将分离纯化后的蝉拟青霉菌株移殖到PSA斜面试管中，在24℃下培养7天，挑选长势好的种保存备用；

摇瓶种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在25℃，振荡频率为140r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为摇瓶种备用；

所述PSA固体培养基中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g；

所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g；

2)液体发酵：采用二级发酵

一级、二级种子罐的液体培养基配方为：20％的马铃薯煮汁、1％蔗糖、蛋白胨-鱼粉0.5％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.1％、硝酸钾0.3％、植物油0.2％、水余量、PH6.5。

或者，一级、二级种子罐的液体培养基配方为：25％的马铃薯煮汁、1％蔗糖、蛋白胨-鱼粉0.2％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.25％、硝酸钾0.5％、植物油0.2％、水余量、PH6.5。

发酵方法：

(1)一级种子罐发酵：100L发酵罐中装入60L培养液，加入消泡剂0.2％，121℃灭菌60min，冷却后将步骤1)中的摇瓶种接入培养，接种量为10％，在温度24℃，通气量1∶0.5，在0.05MPa罐压下发酵84h放罐；

(2)发酵罐发酵：10T发酵罐中装入6T培养液，加入消泡剂0.2％，121℃灭菌60min，冷却后将一级种子罐发酵好的液体种子接入培养，接种量为10％，在温度24℃，通气量1∶0.5，在0.05MPa罐压下发酵8天放罐；

3、发酵产物的药理作用的检测：

经过检测，本实施例中制得的发酵产物具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能。

实施例2

1、菌种的制备和培养：采用蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]CGMCCNo.3453进行液体发酵

1)菌种制备：包括斜面种制备和摇瓶种制备过程；

其中，斜面种制备包括如下步骤：将分离纯化后的菌株移殖到PSA斜面试管中，在24℃下培养7天，挑选长势好的种保存备用；

摇瓶种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在25℃，振荡频率为140r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为摇瓶种备用；

所述PSA固体培养基中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g；

所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分(每1000ml培养基中含有)：马铃薯200g、蔗糖20g；

2)液体发酵：采用二级发酵

(1)一级种子罐发酵：100L发酵罐中装入60L培养液，加入消泡剂0.1％，121℃灭菌30min，冷却后将步骤1)中的摇瓶种接入培养，接种量为10％，在温度24℃，通气量1∶0.5，在0.05MPa罐压下发酵72h放罐；

(2)发酵罐发酵：10T发酵罐中装入6T培养液，加入消泡剂0.1％，121℃灭菌30min，冷却后将一级种子罐发酵好的液体种子接入培养，接种量为10％，在温度24℃，通气量1∶0.5，在0.05MPa罐压下发酵7天放罐；

所述的一级、发酵罐的液体培养基配方为：20％的马铃薯煮汁、2％蔗糖、蛋白胨-鱼粉0.5％、磷酸二氢钾0.15％、硫酸镁0.1％、硝酸钾0.3％、植物油0.1％、水76.85％、PH6.5。

2、发酵产物中有效物质含量检测：

一：多糖检测方法

1实验原理

采用苯酚硫酸比色法对样品多糖进行检测。其原理是：多糖类在浓硫酸作用下先水解成单糖分子，并迅速脱水生成糖醛衍生物，糖醛衍生物再与酚性物质如苯酚反应生成有色化合物，在波长490nm处有最大吸收，且满足朗伯-比尔定律，通过检测样品在该波长下的吸光值，即可算出样品中多糖的含量。

2仪器与材料

2.1主要仪器紫外可见分光光度计；电子天平；可调式封闭电炉；离心机H-1650。

2.2实验试剂无水葡萄糖(AR)；苯酚(AR)；浓硫酸(AR)；屈臣氏蒸馏水。试剂配制5％苯酚溶液：精确称取5g苯酚，用水定容至100ml。

葡萄糖标准液配制：配制浓度为0.25mg/mL的葡萄糖标准液，精确称取0.2500g烘干后的葡萄糖，加水定容至1000mL。

2.3材料实施例1的培养产物

3实验方法

3.1样品粗多糖提取液的制备精确称取1g样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为m1，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为m1+100g，加水完毕之后摇匀，过滤，接取过滤液，稀释2倍备用，即为待测样品，-20℃保存。

3.2样品粗多糖的测定

3.2.1标准曲线的绘制精密称取无水葡糖0.2500g，用蒸馏水配制成0.25mg/ml的葡萄糖标准品溶液，吸取葡萄糖标准液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1ml，分别置于具塞试管中，各加蒸馏水，使体积为2.0ml，再加5％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速滴加98％硫酸5ml，摇匀后放置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，取出冷水冷却至室温；另加蒸馏水2ml，同上操作做空白对照，于490nm处测定吸光值(Abs)。以标准品葡萄糖浓度(mg/ml)为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程：Y＝0.6622X+0.0088，R²＝0.9997，说明标准品葡萄糖量在0～2.75mg/ml范围内，与Abs呈良好的线性关系。

3.2.2实验数据处理

$M=\frac{a\×C\×V\×\left(8\mathrm{mL}\right)}{W\×\left(0.1\mathrm{mL}\right)}$

M：多糖含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液多糖浓度(mg/mL)；V：体积(mL)；W：样品质量(g)

二：甘露醇检测方法

1实验原理利用多元醇化合物甘露醇成分与高碘酸钠及Nash试剂产生的显色反应，测定样品中甘露醇的含量。

2仪器与材料

2.1主要仪器紫外可见分光光度计；电子天平；离心机H-1650；电热恒温水箱CU600型；可调式封闭电炉。

2.2实验试剂甘露醇标准品；醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖。试剂配制

高碘酸钾溶液：15mmol(即3.45g)高碘酸钾溶于1L 0.12mol/L盐酸溶液中。Nash试剂：150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至1L(现用现配)。L-鼠李糖溶液：L-鼠李糖100mg，用蒸馏水定容至100mL。

2.3实验材料实施例1的培养产物

3实验方法

3.1样品甘露醇提取液的制备精确称取1g样品置于干燥的500ml锥形瓶内，称量瓶与样品的总质量记为m1，向三角瓶中加入沸腾蒸馏水约70ml，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠后，向其中加入蒸馏水至最终质量为m1+100g，加水完毕之后摇匀，过滤，接取过滤液，即为待测样品，-20℃保存。

3.2样品甘露醇的测定

3.2.1标准溶液的配制精密称取D-甘露醇标准品0.1g于烧杯中，加少量蒸馏水溶解完全，转移至100ml容量瓶中定容，配制成1mg/ml的甘露醇溶液，进行稀释后，得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。取上述浓度标准品甘露醇溶液各1mL，分置不同试管中，然后分别加1mL高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加2mL0.1％L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，加4mL新鲜配制的Nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温，在412nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。以标准品甘露醇浓度(mg/ml)为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程：Y＝0.0826X+0.0019，R²＝0.9998，说明标准品甘露醇量在0～21.25mg/L范围内，与Abs呈良好的线性关系。

3.2.2实验数据处理

$M=\frac{a\×C\×V\×\left(8\mathrm{mL}\right)}{W\×\left(1\mathrm{mL}\right)}$

M：甘露醇含量(mg/g)；a：稀释倍数；C：待测液甘露醇浓度(mg/mL)；V：提取溶液体积(mL)；W：测试样品量(g)

三：腺苷含量测定方法

1.仪器与试剂

1.1仪器

Waters 1525Binary HPLC Pump；

Waters 2998Photodiode Aarry Detector；

超声波清洗仪SB25-12DT，宁波新芝生物科技股份有限公司；

电子天平AL104型，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

二两装高速万能粉碎机QE-100克，浙江屹立工贸有限公司；

Simplicity，Millipore；

针筒式过滤器0.22μm，Pall。

1.2试剂

腺苷068K0691，Sigma；

虫草素2007914，Sigma；

乙腈HPLC，Lot100606，Fisher；

甲醇HPLC，Lot096964，Fisher；

石油醚AR级，60-90℃，国药集团化学试剂有限公司；

磷酸二氢钾AR，10017618，国药集团化学试剂有限公司；

屈臣氏蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.3样品实施例1的培养产物

2.方法

2.1色谱条件

色谱柱：XBridge C18色谱柱(Waters，4.6mm×250mm，5μm)；

流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾(5∶95)；

流速：1.0mL/min；

检测波长：260nm；

柱温：35℃；

进样量：20μL。

2.2腺苷虫草素标准曲线绘制

精密称取50mg腺苷对照品，置50mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度制成1mg/mL溶液。精密移取适量1mg/mL腺苷对照品溶液，分别配制成1、5、10、30、50、100μg/mL的腺苷标准液，备用。

2.3供试品溶液的制备

取约1.0g样品粉末，精密称定，置具塞100mL具塞锥形瓶中，加石油醚(60-90℃)10mL，密塞，超声30分钟，滤过，弃去石油醚，取药渣挥干，连同滤纸一并置具塞瓶中，在瓶中加入20mL超纯水，称总重(包括锥形瓶重量)，超声30min。快速冷却后称重，以超纯水补至总重，混匀后离心，取上清液，过0.22μm微孔滤膜，备用。

2.4标准曲线绘制

将对照品1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL溶液进样，按2.1项下色谱条件测定，以样品浓度(μg/mL)为横坐标，峰面积(微伏·秒)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y＝7.08e+004x-1.05e+004，R²＝0.999978，在1～100μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.5供试品腺苷含量测定

取2.3项下制备的供试品溶液，与超纯水以2∶1的比例混合，制成待测液。取待测液按2.1项下色谱条件进样，由回归方程得待测液腺苷浓度x(μg/mL)，根据下列公式得到供试品腺苷含量(mg/g)。

检测结果mg/g

样品名称	多糖含量	虫草酸含量	腺苷含量
				蝉拟青霉菌丝体	330.78	122.46	0.644

使用本发明的液体发酵方法发酵之后获得的发酵产物中甘露醇含量高于野生蝉花中的含量。

实施例3瑞氏吉姆萨(Wright-giemsa)染色法检测蝉拟青霉菌丝体水提液对腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

1、实验材料与方法

1.1样品：人工培养蝉拟青霉菌丝体水提液，以实施例2所述方法制得的菌丝体采用常规水提获得。

1.2实验动物及环境：昆明种小鼠30只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲以常规饲料。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。按性别随机分成3组，每组雌雄各5只。

1.3实验方法：每鼠先ip5％生理盐水鸡红细胞混悬液0.2ml进行免疫，空白组ig等容量蒸馏水，蝉拟青霉菌丝体大、小剂量组ig蝉拟青霉菌丝体水提液(3g/kg/d，1.5g/kg/d)，每天1次，连续7天。末次给药后2小时，每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.4ml，6小时后将小鼠脱颈处死，腹腔注射生理盐水2ml，轻柔腹部后，剪开腹腔皮肤，吸取腹腔液，分滴于两片载玻片上，于37℃孵箱中温育30分钟后，用生理盐水漂洗、吹干，丙酮、甲醇溶液(1∶1)固定5分钟，4％Wright-Giemsa染液、晾干，油镜观察。每片计100个巨噬细胞，计算吞噬百分数和吞噬指数。

1.4Wright-Giemsa混合染色液配制：

Wright染液：5ml

Giemsa原液：1ml

双蒸水：6ml

2、实验结果

与空白组比较*P＜0.01，**P＜0.001

结果表明，经口给予小鼠不同剂量的蝉拟青霉菌丝体水提液7d，经统计学处理，其吞噬百分数和吞噬指数在空白组与蝉拟青霉菌丝体水提液大、小剂量组差异均有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，即蝉拟青霉菌丝体可显著提高巨噬细胞的吞噬活性，显示其具有促进免疫功能的作用。

Claims (10)

1.一种生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，包括以下步骤：

1)菌种制备：包括斜面种制备和摇瓶种制备过程；

2)液体发酵：采用二级发酵；

①一级种子罐发酵：发酵罐中装入培养液，加入消泡剂0.1～0.2％，灭菌并冷却后将步骤1)中的摇瓶种接入培养，接种量为5～10％，在温度23～25℃下发酵72～96h放罐；

②发酵罐发酵：发酵罐中装入培养液，加入消泡剂0.1～0.2％，灭菌并冷却后将一级种子罐发酵好的液体种子接入培养，接种量为5～10％，在温度23～25℃下发酵7～10天放罐。

2.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，所述一级种子罐发酵与发酵罐发酵时的罐压均为0.05MPa。

3.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，步骤1)中，所述斜面种制备包括如下步骤：将分离纯化后的菌株移殖到PSA斜面试管中，在22℃～25℃下培养5～7天，挑选长势好的种作为斜面种。

4.如权利要求2中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，每1000ml所述PSA斜面培养基中含有如下组分：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g。

5.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，步骤1)中，所述摇瓶种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在22℃～25℃，振荡频率为130～150r/min的条件下培养3～7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为摇瓶种。

6.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，步骤2)中，所述一级种子罐和发酵罐的液体培养基配方为：20～25％的马铃薯煮汁、1～2％蔗糖、蛋白胨-鱼粉0.2～0.5％、磷酸二氢钾0.15～0.3％、硫酸镁0.1～0.25％、硝酸钾0.3～0.5％、消泡剂0.1～0.2％、水71.25～78.15％、PH6.0～6.5。

7.如权利要求1中所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中，所述消泡剂选自天然植物油、聚醚类消泡剂、高碳醇和硅类中的一种。

8.如权利要求1～7中任一权利要求所述的生产蝉拟青霉菌丝体的液体发酵方法，其特征在于，所述液体发酵方法采用蝉拟青霉菌株CGMCC No.3453进行液体发酵。

9.一种蝉拟青霉液体发酵产物，由权利要求1～8中任一权利要求所述的液体发酵方法进行发酵制得。

10.权利要求9中所述的蝉拟青霉液体发酵产物在制备具有抗肿瘤、调节免疫、降血糖、降血脂、降血压、明目、抗辐射、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能等功能的食品、保健品、药品或化妆品中的应用。

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