CN107638316A - 虫草属真菌细胞代谢产物在制备护肤品中的用途及护肤品 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种虫草属真菌细胞代谢产物用在制备护肤品中的用途及护肤品，所述虫草菌种类至少包括以下任意一种：冬虫夏草、中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被毛孢、蛹虫草或北虫草、虫草藻、大团囊虫草、亚香棒虫草、珊瑚虫草、蝉花、虫草实蝇。本发明中所述细胞代谢产物不是典型的抗生素，但有杀灭细菌的作用；不是典型的抗炎药，但有消炎功能，天然无副作用。

Description

虫草属真菌细胞代谢产物在制备护肤品中的用途及护肤品

技术领域

本发明涉及一种虫草属真菌细胞代谢产物用在制备护肤品中的用途及护肤品，特别是在祛痘方面的作用。

背景技术

痤疮是皮肤科的最常见的病种之一，又叫青春痘、面皰或粉刺、毛囊炎。痤疮的发生一般与雄激素过度分泌、皮脂分泌增加、毛囊导管角化过度、痤疮丙酸杆菌感染、环境因素、遗传因素及皮脂膜破坏有关。痤疮是典型的“少年维特的烦恼”，4/5年龄介于12-25岁的年轻人会有青春痘问题。

药物治疗基本上分四类，即避孕药、雄激素阻滞剂、抗生素、维甲酸/维A酸类。维甲酸/维A酸类药物是治疗炎症性痤疮的一线药物，维甲酸/维A酸治疗痤疮的机制包括抑制皮脂腺功能；抗毛囊皮脂导管角化；抑制毛囊皮脂导管内微生物的生长；抑制炎症。但是这类药物有着明显的副作用，包括皮肤红斑、干燥、痘痒、脱屑等皮肤症状；严重头痛、眩晕、抑郁症、性格改变及听力减退等中枢神经系统的副作用，另一个较为严重的副作用就是具有胚胎毒性和致畸胎性。

其他常见的外用类产品包括水杨酸、过氧化苯酰、三氯沙(已被美国FDA禁止在日化产品中使用)、硫磺剂、雷索辛等，这些产品效果平平。在护肤类产品中最常用的袪痘成份是水杨酸和过氧化苯酰，它们的功效基本上是促使青春痘脓肿成熟、排脓、然后收缩。另一类是润肤或多种维生素的护肤产品，基本上属于安慰剂。

在现有的袪痘专利中，中国专利102018646A公开了一种由多味中药提取物组成的袪痘护肤组合，包括丹参、金银花、丁香、厚大黄；中国专利103432244A公开了另一种由多味中药提取物组成的袪痘护肤组合包括黄芪、连翘、牡丹皮、白芷、蛇舌草、丹参；中国专利201510240360.3提供了一种含有多种植物抗痘成份的防腐剂组合物，包括植物提取物苦参、丹参、百部、紫草，防腐剂尼泊金甲酯、尼泊金丙酯，丙氧乙醇、三氯生、布罗波尔、DMDMH；中国专利201480055619.0公开了一种包含脂肪酸胆汁酸缀合物(FABAC)作为祛痘活性成份的局部药物组合物；美国专利US 2012/0108539阐述了将已知活性药用成份与壳聚糖生物聚合物以及其他辅料所组成的配方用于治疗痤疮；美国专利US20090318371公开了一种以维甲酸、抗生素-克林霉素磷酸盐、和/或Keratolytic(过氧化苯甲酰的微海棉制剂)作为活性成份并配以一种多种成份载体的痤疮治疗配方；美国专利US Patent 006936267发现含有二氧化氯的成份组合具有祛痘功效。

综上所述，在现有已公开的专利中和已发表的论文中都没有关于虫草真菌代谢产物，尤其是高分子化合物糖肽在消除痤疮方面的功效以及应用方面的论述。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种虫草属真菌细胞代谢产物在制备祛痘护肤品中的用途及护肤品，填补了现有技术中的空白。

基于实验申请人发现一类虫草属真菌细胞代谢产物具有祛痘的作用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供了虫草属真菌细胞代谢产物用在制备护肤品中的用途，所述护肤品具有祛痘的作用，所述虫草菌种类包括以下任意一种或几种：冬虫夏草(Cordyceps sinensis或Ophiocordyceps sinensis)、中华被毛孢(Hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid Chen et Dai,sp.Nov)、蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)、蛹虫草或北虫草(Cordycepsmilitaris)、虫草藻(Cordyceps gracilis)、大团囊虫草(Cordyceps ophioglossoides、Cordyceps memorabillis、Cordyceps sphecocephala)亚香棒虫草(Cordycepshawkesii)、珊瑚虫草(Cordyceps martialis)、蝉花(Cordyceps sobolifera)、虫草实蝇(Cordyceps capitata)。

祛痘作用是指具有以下任意一种功效或几种功效：抑制痤疮肿胀或疼痛、缩减青春痘脓肿、淡化或消除痘痕、使痘痕愈合、对于痤疮的疼痛具有明显的平抑作用、消除刚刚萌芽的青春痘、消除脓疮型青春痘、改变脓液排出的规律。痘可以是痤疮、青春痘或粉刺。本发明针对痤疮效果更佳。

痤疮大致上可以分为两大类，即堵塞型和炎症型。堵塞型是指白头黑头粉刺，而炎症型包括炎性丘疹、脓疱、囊肿和结节等。在给定的实验条件下，这种虫草真菌胞外代谢产物在三到七天的时间内可以基本上消除这两类痤疮。

进一步地，所述虫草属真菌细胞代谢产物是祛痘作用的主要有效成分或唯一有效成分。

进一步地，所述虫草属真菌细胞代谢产物的主要成分是多糖和/或糖肽。更进一步地，所述多糖或糖肽是若干单糖组成的多糖链；所述糖肽是蛋白质稳定剂，即蛋白质变性抑制剂；所述细胞代谢产物的pKa为4.0-4.2。

更进一步地，本发明的多糖是由两种不同的单糖例如N-乙酰-D-半乳糖胺或N-乙酰基-D-葡糖胺或N-乙酰神经氨酸与糖胺键合组成的双糖的重复结构；糖肽是指在多糖链上连接多肽(蛋白质)链。

进一步的，所述糖肽具有一种球形3D结构，表面显示出典型的大分子生物聚合物的构造。能量色散X射线光谱仪测得的糖肽3D表面元素组成的结果表明，糖肽表面即大分子生物聚合物侧链的主要元素是碳和氧：实验中选取的4个区域的平均氧/碳比＝2.69，非常接近游离型羧基(COO-)的理论氧/碳比＝2.67；肽链处在结构的中心。多糖侧链的游离羧基(R-COO-)是这种虫草真菌胞外多糖/糖肽的袪痘功能基团。由于这种虫草菌胞外代谢产物含有蛋白质，所以多糖可能与肽链或与脂类键合或复合的大分子化合物。

标准抗菌试验表明，虫草真菌源袪痘制剂具有抑制和杀灭痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的功效。痤疮丙酸杆菌是造成造成青春痘的主要细菌。抗菌实验得出结论，虫草真菌源袪痘制剂以干物质计的最小抑菌浓度(MIC)是6.25％，它的最小杀菌浓度(MBC)为25％。

进一步地，这种虫草真菌多糖/糖肽的还具有抗炎活性，相当于双氯芬酸钠的3％或以上，即32.8克虫草真菌多糖/糖肽相当于1克或以上的双氯芬酸抗炎性活力。

多糖/糖肽具有抗炎症活性和痤疮丙酸杆菌抗性双重功能，是多糖/糖肽制剂对于青春痘，尤其是典型的炎症型痤疮疗效显著的药理基础。

进一步地，所述虫草属真菌细胞代谢产物以虫草属真菌的菌丝体与孢子的细胞外代谢产物为原料经醇提制得。

进一步地，所述虫草属真菌的菌丝体与孢子细胞经固体发酵阶段与液体发酵阶段人工培养获得，收集菌丝与孢子分泌到细胞外代谢产物而获得。

更进一步地，所述人工培养的虫草属真菌为虫草属真菌纯种且经驯化。

更进一步地，驯化方法选自以下：

方法一：

将虫草属真菌纯种在固体培养基上接种培养，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，如此反复多次驯化虫草属真菌纯种；

方法二：

将虫草属真菌纯种接种液体培养基培养至对数期，经紫外照射后接种固体培养基，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，反复多次选择最早长出的单菌落传代培养以驯化虫草属真菌纯种。

较佳的，所述经驯化的虫草属真菌纯种相比驯化前，发酵周期缩短至少24小时。更佳的，所述经驯化的虫草属真菌纯种液体发酵罐发酵时间少于3天即可至稳定期。

本发明所用虫草真菌菌种可以来自自然界分离到虫草原菌种。原种在实验室里经过一个为期数年在驯化后，可使得菌种得到优化，尤其是培养特性获得优化。优化后的菌种特点是三高，即生長速率高、细胞得率高、生物活性成份含量高。虫草原菌种基本上需要7-14天完成生物发酵周期。与此相对应，优化后的菌种只需2天即可完成生物发酵周期。同时细胞得率和生物活性成份相对于原种大幅度提高，可以达到现有培养条件下的更高值。

所述虫草属真菌经人工培养包括以下步骤：

1.固体培养基在合适虫草属真菌生长的条件下培养；

2.将固体培养基培养产物接种液体培养并在合适虫草属真菌生长的条件下进行一级种子培养；

3.一级种子接种液体发酵罐并在合适虫草属真菌生长的条件下发酵培养。

优选的，所述步骤3中液体发酵罐发酵培养经多级放大发酵培养。

具体的，可将步骤2获得的一级种子接种液体发酵罐进行二级种子培养，将获得的二级种子进一步接种较第一次液体发酵用发酵罐大的发酵罐进行液体发酵培养，以此类推，多次逐级放大发酵培养。

如实施例列举的，所述多级放大发酵培养经两级液体发酵罐发酵培养。

固体培养或液体培养所用培养基可为现有的适合于虫草属真菌繁殖的培养基。本领域技术人员可以凭借本领域的技术知识进行适当选择，并无特殊要求。一般而言，所述固体培养基或液体培养基应含有微生物生长代谢的碳源、氮源、维生素和无机盐。

如本发明实施例列举的，所述固体培养所用培养基可以是马铃薯葡萄糖琼脂培养基或琼脂培养基，所述液体培养或液体发酵所用的培养基可以是含葡萄糖、麦芽糖、酵母提取物/蛋白胨以及矿物质的液体培养基。

本发明另一方面公开了一种祛痘制剂，所述祛痘制剂中包含至少以下任意一种虫草属真菌细胞代谢产物：冬虫夏草(Cordyceps sinensis或Ophiocordyceps sinensis)、中华被毛孢(Hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid Chen et Dai,sp.Nov)、蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)、蛹虫草或北虫草(Cordyceps militaris)、虫草藻(Cordyceps gracilis)、大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides、Cordyceps memorabillis、Cordyceps sphecocephala)、亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii)、珊瑚虫草(Cordyceps martialis)、蝉花(Cordycepssobolifera)、虫草实蝇(Cordyceps capitata)。

进一步地，所述祛痘制剂可以是外用制剂、口服制剂、精制可注射制剂。

更进一步地，所述制剂可以是液体或者固体。

进一步地，所述祛痘制剂还包括其他人体可接受的辅料。

本发明的另一方面公开了一种护肤品，所述护肤品包含至少以下任意一种虫草属真菌细胞代谢产物：冬虫夏草(Cordyceps sinensis或Ophiocordyceps sinensis)、中华被毛孢(Hirsutella sinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepialid Chen et Dai,sp.Nov)、蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)、蛹虫草或北虫草(Cordyceps militaris)、虫草藻(Cordyceps gracilis)、大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides、Cordyceps memorabillis、Cordyceps sphecocephala)亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii)、珊瑚虫草(Cordyceps martialis)、蝉花(Cordycepssobolifera)、虫草实蝇(Cordyceps capitata)。

进一步地，所述虫草属真菌细胞代谢产物的主要成分是多糖和/或糖肽。

进一步地，所述糖肽具有一种球形3D结构。

更进一步地，所述多糖或糖肽是若干单糖组成的多糖。

进一步地，所述虫草真菌胞外代谢产物的pKa为4.0-4.2。

进一步地，所述虫草属真菌细胞代谢产物是所述护肤品的唯一有效成分、主要有效成分或者辅助成分。

进一步地，所述护肤品的剂型无特别限定，可以是液态护肤品、油状护肤品、乳化体护肤品、悬浮体护肤品、膏状护肤品、凝胶状护肤品、粉状护肤品、块状护肤品、锭状护肤品、笔状护肤品、蜡状护肤品、气雾状护肤品、薄膜状护肤品、胶囊状护肤品、纸状护肤品等。可按各剂型护肤品的常规制备方法配合各剂型常用辅料制备。

进一步地，所述护肤品中还包括其他人体可接受的的辅料。

所述的辅料可以选自：水；油脂，这种油脂可以是从动物、植物或石油里面提取的，也可以是人工合成的；保湿剂，如甘油、丙二醇、丁二醇或山梨醇；乳化剂；消泡剂；硅树脂；顺滑剂；增稠剂，如羧基酸聚合物、交联聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖、树胶等；表面活性剂，如非离子表面活性剂、离子表面活性剂；pH调节剂；基质；盐；螯合掩蔽剂；分散剂；防腐剂；遮光剂；着色剂；赋形剂，如硬脂酸、棕榈酸、十八烷醇、十六烷醇、苯甲醇、硬脂酸和1～21位乙撑氧基的十六烷醇聚乙二醇醚及其混合物等；缓释剂；抗结块剂；抗氧化剂；缓冲剂；填充剂；螯合剂；成膜剂；乳浊剂。

进一步，所述护肤品中还含有其他典型有效成分，如润肤剂；抗痤疮剂，如有间苯二酚、硫磺、水杨酸、过氧化苯甲酰、红霉素、锌等；除皱剂/抗萎缩剂，如硫代D-或L-氨基酸及其衍生物和盐如N-乙酰衍生物、硫醇如乙硫醇、羟基酸、植酸、硫辛酸、溶血磷脂酸、皮肤脱落剂(如苯酚等)、VB3类和维生素A酸类(能改善皮肤角质组织的外观，特别是能调节角质组织的环境)；收敛剂，如丁香精油、薄荷醇、樟脑、桉油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅萃取液；皮肤漂白和发光剂，如对苯二酚、曲酸、Vc、Vc磷酸镁、Vc葡糖胺、Vc甘糖；皮肤舒缓剂或修复剂，如泛醇即VB5和泛醇衍生物如乙基泛醇、芦荟浓缩物、泛酸和泛酸衍生物、尿囊素、甜没药醇、甘草酸二钾；抗氧化剂/自由基清除剂，如抗坏血酸(维生素C)及其盐，脂肪酸中的抗坏血酸酯，抗坏血酸衍生物(如抗坏血酸磷酸酯镁盐，抗坏血酸磷酸酯钠，抗坏血酸山梨酸酯)，生育酚(维生素E)，tocopherol sorbate，生育酚醋酸酯，其他生育酚酯，丁羟基安息香酯及其他盐，6－羟基－2，5，7，8－四甲基克罗曼铬镍合金基－2－羧基酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)，五倍子酸及其烷基酯，特别是丙基五倍子酸酯，尿酸及其盐和烷基酯，山梨酸及其盐，硫辛酸，胺(如硫辛酸，胺(N,N－二乙羟基胺，胺基胍)，硫氢基化合物(如谷胱甘肽)，含有两个羟基的反丁烯二酸及其盐，lycinepidolate，arginine pilolate，去甲二氢愈创木酸，生物类黄酮，姜黄色素，赖氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，超氧化岐化酶，水飞蓟素，茶提取物，葡萄皮/种子提取物，黑色素和迷迭香提取物等；抗炎剂，如类固醇类抗炎剂、非类固醇类抗炎剂、天然抗炎剂如芦荟等；抗脂肪剂；皮肤增亮剂，如清酒曲酸，熊果苷，维生素C及其衍生物(如抗坏血酸磷酸酯镁盐，抗坏血酸磷酸酯钠盐或抗坏血酸葡萄糖苷)和提取物(如桑树提取物，胎盘提取物)；皮肤润滑及皮肤修复活性物质，如泛酰酸衍生物(包括泛酰醇，泛醇，乙烷基泛酰醇)，真芦荟，尿囊素，红没药醇和甘草酸二钾等；抗菌剂和抗真菌活性物；遮光活性物质，无机遮光物如二氧化钛、氧化锌、氧化铁，有机遮光剂如2－乙烷己基－p－甲氧基肉桂酸，丁基甲氧基联苯甲酰－甲烷，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，2－苯基苯并咪唑－5－磺酸，辛基二甲基－p－氨基安息香酸，奥克立宁等。

优选地方法中，护肤品是凝胶、精华、水合液、面膜、面霜或者外用膏剂的形式。

优选地，所述凝胶中细胞代谢产物的干物质含量为48％，所述面膜中细胞代谢产物的干物质含量6％。其中面膜中细胞代谢产物的含量是指细胞代谢产物占面膜中使用的精华液的重量比例。

使用量、使用的频率和使用的时间根据皮肤状况及想要达到的调节效果由施用者来自主调节。

如上所述，本发明的虫草属真菌细胞代谢产物用在制备护肤品中的用途及护肤品，具有以下有益效果：

本发明中所述细胞代谢产物不是典型的抗生素，但有杀灭细菌的作用；不是典型的抗炎药，但有消炎功能。具有有效的祛痘作用，且属于天然物质，避免了常规祛痘产品的副作用，天然无公害。痤疮患者可以在3-7天内减轻或消除症状。

附图说明

图1显示为实施例1中制备的粗级虫草真菌袪痘浓缩液体制剂。

图2显示为实施例1中制备的虫草真菌胞外多糖/糖肽的干粉制剂。

图3显示为实施例1中制备的虫草真菌胞外多糖/糖肽的可注射精制干粉制剂。

图4显示为1号志愿者使用袪痘凝胶前后的影像。

图5显示为2号志愿者使用袪痘凝胶前后的影像。

图6显示为3号志愿者使用袪痘凝胶前后的影像。

图7显示为4号志愿者使用袪痘凝胶前后的影像。

图8显示为5号志愿者使用袪痘凝胶前后的影像。

图9显示为虫草真菌胞外代谢产物HPLC图谱，上图：折射探测器即糖探测器的图谱，显示有两个主要吸收峰，已排除是葡萄糖和半乳糖。在保留时间(RT)7.66分钟的吸收峰是糖胺，RT20分钟的吸收峰可能是糖酸。下图：紫外线探测器可检测到许多非糖结构的分子化合物。

图10a扫描电子显微镜的糖肽3D表面结构，即分子结构的侧链是与目标靶点例如皮肤接触和作用的部位。画了4个区域检测元素组成。

图10b显示为能量色散X射线光谱仪测得图10a中区域1的元素组成，氧/碳比＝2.85。

图10c显示为能量色散X射线光谱仪测得图10a中区域2的元素组成，氧/碳比＝2.51。

图10d显示为能量色散X射线光谱仪测得图10a中区域3的元素组成，氧/碳比＝3.26。

图10e显示为能量色散X射线光谱仪测得图10a中区域4的元素组成，氧/碳比＝2.14。

糖肽表面或侧链的主要元是碳和氧，4个区域的平均氧/碳比＝2.69，非常接近游离型羧基侧链(R-COO-)的理论氧/碳比＝2.67。可以得出结论：糖肽表面或侧链的袪痘功能基团是酸性游离羧基。已知非抗生素袪痘药物，例如维甲酸/异维A酸，壬二酸、或水杨酸，它们的功能基团均为酸性游离羧基。

图11虫草真菌胞外多糖/糖肽的3D模型图；多糖链由N-乙酰-D-半乳糖胺或N-乙酰基-D-葡糖胺或N-乙酰神经氨酸与糖胺的残糖组成，将多肽链或脂链包裹在核心。外侧为酸性游离羧基，pKa＝4.0-4.2。

图12a显示虫草真菌胞外代谢产物与白蛋白作用；左边试管：对照样品，即白蛋白澄清溶液加热至75℃保持10分钟后变浑浊，表明蛋白质已变性。

右边试管：白蛋白澄清溶液含有1000毫克虫草真菌胞外代谢产物，加热至75℃保持10分钟后蛋白质溶液仍保持澄清，表明蛋白质在1000毫克虫草真菌胞外代谢产物保护下完全没有变性。

图12b显示双氯芬酸与白蛋白作用结果。

右1瓶子：对照样品，即白蛋白澄清溶液加热至75℃保持10分钟后变浑浊，表明蛋白质已变性。

左1至左3瓶子：在白蛋白澄清溶液加入不同含量的双氯芬酸，加热至75℃保持10分钟。其中当双氯芬酸含量达到30.5毫克(0.5g)时，蛋白质溶液可保持澄清，表明蛋白质在30.5毫克双氯芬酸保护下完全没有变性。

图12c显示为双氯芬酸钠-蛋白质样品标准曲线。

图13a显示为虫草真菌胞外多糖/糖肽对痤疮丙酸杆菌(P.acnes)最小抑菌浓度(MIC)实验结果示意图，其中试管1、2和3均澄清，不混浊。而其余的试管都是混浊的。C1(阳性对照)非常混浊。C2(阴性对照)不混浊。所以，虫草真菌源袪痘制剂G2的最小抑菌浓度(MIC)是62,500ug/ml或62.5mg/ml或6.25g/100ml或6.25％。

图13b显示为虫草真菌胞外多糖/糖肽对痤疮丙酸杆菌(P.acnes)最小杀菌浓度(MBC)实验结果示意图，从试管1至8的混合物划线的平板均观察到痤疮丙酸杆菌的菌落；C1(阳性对照)观察到菌落生长；C2(阴性对照)没有观察到菌落生长。因此，虫草真菌源袪痘制剂G2的最小杀菌浓度(MBC)为250,000ug/ml或250mg/ml或25克/100ml或25％。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

发酵：单一虫草真菌菌种通过多级固体培养、多级液体培养产生真菌细胞包括菌丝体和孢子，以及胞外代谢产物的过程。

提取物或产品包括：由原始材料提取和分离出的一种产品、一种浓缩物、一种乳状液；通过干燥、研磨或压缩原始材料而生产的一种产品，例如成为一种粉状、一种饼状、或从原始材料衍生出的任何产品和原料包括浆液和沉淀物。

虫草菌胞外代谢产物、虫草真菌胞外多糖或糖肽、虫草菌多糖肽制剂可以指代同一种物质。

对于此处所述的发明，商业化袪痘原料制剂由至少一种虫草真菌菌种通过系列工艺步骤制得，包括：(1)主要是液体发酵液可以是固体发酵、(2)主要收获虫草真菌发酵母液即真菌细胞外代谢产物，也包括真菌细胞包括菌丝体和孢子、(3)将发酵母液通过浓缩、脱色、95-99％酒精澄淀、或结晶(4)精制工艺生产各类原料制剂包括：外用粗级制剂、可注射精制制剂；制剂形态包括：浓缩液体和粉状。

实施例1 虫草真菌单一菌种的纯化和驯化

从菌虫复合体例如野生冬虫夏草上分离得到的真菌会有时候是共生型，即含有許多共生的細菌或其它生物，但再琼脂培养基上会表现出是单一菌种。用固体发酵没有问题，但使用液体深层发酵，經常出现偶發性不明发酵污染。所以，所有分离得到的真菌菌种需要进行纯种分离。以冬虫夏草(Cordyceps sinensis)、或称中华被毛孢(Hirsutellasinensis)、或称蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutella hepiali Chen et Shen)为例。

纯种分离步骤：

1)从野生分离之虫草菌种(共生型生物种类)

2)在蛋白胨葡萄糖液体培养基加入氯霉素和庆大霉素；接种后在25℃下和摇瓶机上培养3-4周

3)接种孟加拉国红氯霉素琼脂培养基；在25℃下培养3周，在此出现的单菌落为纯种真菌

4)挑出和编号单菌落；接种在YM琼脂斜面25℃下培养3周

5)挑出的纯种虫草真菌菌种，编号AA

由于虫草菌分类系统：真子囊菌亚纲(Euascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales),麦角科(Claviceptaceae),虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)，属于丝状真菌，所以在形态上很容易与酵母区分。

打破共生体系得到虫草真菌纯种后，可进一步筛选快速生长和有效成份含量更高的虫草菌菌种。

一般未经驯化的虫草真菌的生物发酵周期为2-3周，这个速度不利于大工业生产的要求。设定的指标定为：琼脂固体培养基为7天、摇瓶培养为5天、液体深层发酵罐培养低于72小时，这样商业化生产的周期为每周两批，利于大生产。

菌种驯化：

可采用两种方法对菌种驯化：自然诱导法和紫外线诱变法。

自然诱导法：

1)AA编号虫草菌种接种土豆汁琼脂培养基在25℃下培养，每天观察发现最早出现的单菌落，然后传代

2)不断重复这样的筛选过程；得到653株单菌落，编号改为CSX或HHX系列。

紫外线诱变法：

1)AA编号虫草菌种接种蛋白胨葡萄糖液体培养达到细胞浓度108/毫升；然后在280nm的紫外线下照射30分钟；

2)接种土豆汁琼脂培养基在25℃下培养，每天观察发现最早出现的单菌落，然后传代；

3)不断重复步骤2；得到245株单菌落，编号改为CSX或HHX系列。

上述两种方法均筛选获得了符合上述条件的菌种。

虫草菌有效成份筛选方法：

菌株培养条件：采用实施例2的方法培养菌株

5种活性成分分析：还原性有机酸、多酚、多糖、3’-脱氧腺苷(虫草素)、腺苷

上述活性成分可采用现有技术分析。

筛选出5种活性成分含量高的菌株作为优选菌株，取名为CS-X100或HHX-100，后续试验采用的菌株为从自然诱导法驯化获得的菌株中筛选获得。图1为CS-X100或HH-X100菌体细胞的参考标准图谱。

CS-X100或HH-X100虫草菌株再经过一段时间的稳定性培养还可达到更优的商业化生产状态：琼脂固体培养基为5天；摇瓶培养为3天；液体深层发酵罐培养48小时。

实施例2 液体深层培养生产虫草真菌菌体细胞

发酵方法：

步骤一：为了生产虫草真菌菌体细胞，将分离的CSX系列或HHX系列菌株(本实施例选用CS-X100或HHX-100)首先在固体培养基上培养。25℃下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面或平板琼脂培养基(见表a)上培养3天。

步骤二：1升液体培养基(表b)装入5升锥形瓶，在121℃消毒20分钟后，接种3-6个冬虫夏草菌种斜板，然后在下列情况下生长：pH值5.5(接种前调节)、25℃、摇瓶旋转速度150rpm、培养时间36小时。

步骤三：培养二级种子使用搅拌生物反应器75升(或更大)，发酵培养基(表c)装液量50升或以上，在121℃下消毒30分钟，接种2升一级种子细胞(4％的接种量)，生长条件如下：pH值5.5(接种前调节)；25℃；通气量：1:0.2-1:0.9体积/体积/立方米(1500-2700升/小时每50公升液量)；搅拌速度：200rpm；48小时。

步骤四：培养虫草真菌菌体细胞，使用800升(或更大)搅拌式反应器，装600升(或75％)发酵培养基液量(见表c)接种50升或更多的二级种子(8％接种量)。发酵罐和培养基接种前需在121℃下消毒30分钟。生长条件如下：pH值5.5；25-29℃；搅拌速度：200rpm；通气量：1:0.5-1:1.1体积/体积/立方米(18-36立方米/小时每600公升液量)；培养期：48小时。

步骤五：当菌体细胞成长已达到其指数生长后期，或已达到成倍繁殖的生产目的，打开生物反应器的底部阀门收获全发酵物以及发酵母液，获得虫草菌体细胞，每600升发酵培养基获得含15％干物质的100公斤湿菌体。此处获得的虫草菌体细胞是菌丝体和孢子的混合物。

表a马铃薯葡萄糖琼脂培养基

组成部分	含量
		马铃薯提取物	4.0克
葡萄糖	20.0克
		琼脂	15.0克
pH	5.6
		蒸馏水	到1升

表b摇瓶培养基

组成部分	含量克/升
		葡萄糖	40.0
麦芽糖粉	40.0
		KH2PO4	1.5
MgSO4.7H20	0.3
		酵母提取物/蛋白胨	20.0
水	到1升

表c液体培养基

实施例3 粗级虫草真菌袪痘浓缩液体制剂的制备

收获400公斤上述发酵工艺所产生的发酵母液，即虫草真菌胞外代谢产物，含固形物6％，即24公斤；在真空浓缩器中将其浓缩至16％固形物。在大约150公斤液体中加入0.48公斤的活性碳，比例是固形物的2％，在80℃下搅拌作用30分钟，然后过滤或离心除去活性碳，继续用真空浓缩器将滤液浓缩至固形物65°Bx，得到25公斤。将25升99％的酒精与25公斤的浓缩液混合，搅拌作用4小时，然后将酒精相与沉淀相分离。沉淀相小量加水后置入真空浓缩器中彻底除去残留酒精并浓缩至固形物65°Bx或干物质62％，得到19公斤终产品-粗级虫草真菌袪痘浓缩液体制剂，包括液体制剂、干粉以及可注射精制干粉制剂，产品编号：CSE-Poly-G2(见图1～3)。所述液体制剂中固形物含量为60％。

实施例4 虫草真菌可注射精制干粉制剂的制备

收获400公斤上述发酵工艺所产生的发酵母液，即虫草真菌胞外代谢产物，含固形物6％，即24公斤，在真空浓缩器中将其浓缩至32公斤，含固形物75％。然后加入32升99％酒精，在室温或25℃下混合搅拌4小时，然后过滤或离心除去上清液酒精。沉淀部分再加入16升酒精清洗2小时后过滤或离心除去上清液酒精，获得24升沉淀部分，即粗级多糖/糖肽。

将沉淀部分加水调至含固形物5％，然后浓缩至固形物8％并彻底除去残留酒精，获得多糖稀溶液225升。在225升多糖稀溶液加入36公斤活性炭(16％v/v)，80-90℃下搅拌作用20分钟后，过滤或离心得到135升脱色液，含固形物3％。

将135升脱色液浓缩至45升，含固形物9％。在此9％固形物的脱色液中加入90升99％酒精，置于搅拌罐内在室温或25℃下，高速搅拌作用4小时，搅拌速率400rpm，过滤或离心获得白色多糖结晶。白色晶体颗粒放置于常温下或冷冻干燥挥发掉残余酒精，得精制干粉制剂410克。

实施例5 袪痘凝胶和修复面膜的配制

袪痘凝胶和修复面膜都是以粗级虫草真菌袪痘浓缩液体制剂CSE-Poly-G2(实施例1中制备)为唯一活性成份，其他辅料包括异戊二醇，戊二醇，己二醇，对羟基苯乙酮，黄原胶和水。这些辅料主要赋予终产品可应用的体态、粘性和防腐功能。袪痘凝胶含有CSE-Poly-G2高达80％，主要是确保痤疮患者可以在3-7天内减轻或消除症状。痘痘修复面膜含CSE-Poly-G2在10％左右，主要用于痤疮患处的修复和痘痕平复。

将上述活性制剂CSE-Poly-G2与其他辅料按配方比例混合后搅拌均匀，灭菌后装入软管制成袪痘凝胶，或痘痘修复面膜。

实施例6 自愿试用者痤疮消除功效人体实验

方法：挑选30位各个年龄段的中国男女性试用者对袪痘凝胶进行使用前后的评价。向每个试用者提供管实施例3中制备的袪痘凝胶和调查问卷。试用者要求在使用前后拍摄照片并填写调查问卷，最后收到有效答卷18个(表1)，其中有7位试用者提供了使用前后的照片(见图4～8)。

在18位试用者中，5位评价为不太有效或无效，其余的均评价为有效或非常有效，所以，总有效率为72.22％。同时与试用者交谈后可以归纳这种袪痘凝胶的功效为三方面：1.将袪痘凝胶涂抹在痤疮患处，立即可以减轻或消除痤疮肿胀或疼痛的感觉；2.痤疮包括阻塞型(黑头/白头)，炎症型(脓疮)都会在10天内消失，尤其特殊的是不会脓液排出，脓疮会自我消失，3.对痘痕淡化或消除有一定的效果，但需要一段时间才会显现。

实施例7 高效液相色谱法(HPLC)鉴定虫草真菌胞外代谢产物的单糖组成:

测定方法：

高效液相色谱法(HPLC)鉴定由专利号：201511007965.4中所公开的方法实施。

结果：

图9的测试结果表明，这种胞外代谢产物的主体是多糖结构，由两种单糖基组成，但与标准对比已排除单糖基是葡萄糖和半乳糖。这种胞外代谢产物的多糖的残基是糖酸，例如N-乙酰-D-半乳糖胺或N-乙酰基-D-葡糖胺或N-乙酰神经氨酸，与糖胺即葡萄糖胺的键合，并具有较强的还原性。由于这种虫草菌胞外代谢产物含有蛋白质，所以它可能与肽链或是脂类键合或复合。

实施例8 扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪鉴定结构和元素组成:

测定方法：

将实施例一中的粗级浓缩液体制剂稀释至10％固形物，然后加入21％的活性碳，在80℃下搅拌作用30分钟，过滤得到澄清液，然后冷冻干燥获得干剂，进行扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪鉴定分析。

结果：

图10a～10e的测试结果显示，扫描电子显微镜图像显示糖肽3D表面具有典型大分子生物聚合物的结构；能量色散X射线光谱仪测得的糖肽3D表面元素组成的结果表明，糖肽表面或侧链的主要元素是碳和氧；4个区域的平均碳/氧比＝2.69，非常接近侧链的游离型羧基(R-COO-)的理论碳/氧比＝2.67。

根据HPLC、电子显微镜、X射线光谱仪的数据和pKa值(4.0-4.2)，可以建立多糖/糖肽的3D模型，参见图11。糖肽球状表面由多糖侧链组成并含有大量的酸性游离羧基，而肽链处在结构的中心。多糖侧链的游离羧基是虫草真菌胞外糖肽的袪痘功能基团，这种具有双重功能结构的虫草真菌胞外糖肽具有一种完美构像，即酸性侧链是抑制痤疮的活性基团，而主体的多糖/多肽链由于带有天然产物的特征从而减少或消除酸性化合物对皮肤或人体其他器官的副作用。

实施例9 虫草真菌袪痘糖肽的抗炎症测试

样品配制：

(1)PBS缓冲液:

用盐酸将pH调到6.8。

(2)0.5％蛋白溶液：用PBS缓冲液溶解鸡蛋白蛋白或血清白蛋白，配制成0.5％的蛋白澄清溶液。

(3)双氯芬酸标准溶液：用PBS缓冲液制备含3.05mg、6.1mg、30.5mg双氯芬酸钠的标准溶液。

(4)虫草真菌袪痘糖肽溶液：将实施例1中制备的粗级虫草真菌袪痘浓缩液体制剂的稀释液(10％固形物)500ml,加入21％活性碳脱色过滤后得到150ml澄清液含5％固形物,调节pH至6.8。

蛋白质热变形反应：

对照样品：20毫升0.5％蛋白溶液+20毫升缓冲液。

双氯芬酸钠-蛋白质样品：20毫升0.5％蛋白溶液+20毫升不同浓度的双氯芬酸标准溶液。

糖肽-蛋白质样品：20毫升0.5％蛋白溶液+20毫升虫草真菌袪痘糖肽溶液。

所有样品在28℃下平衡15分钟，然后在75℃水浴锅中作用10分钟。冷却后用光电比色计在660nm下读得光吸收值(OD)，并计算蛋白质变性抑制率，结果如表1。

蛋白质变性抑制率(％)＝对照OD–样品OD/对照OD

表1 蛋白质变性抑制率

实验结果表明(12a～12b)：对照样品加热至75℃保持10分钟后变浑浊，表明蛋白质已变性。糖肽-蛋白质样品(含1000毫克糖肽)加热至75℃保持10分钟后蛋白质溶液仍保持澄清，表明蛋白质在1000毫克虫草糖肽保护下完全没有变性。对于不同浓度的双氯芬酸钠-蛋白质样品，其中当含量达到30.5毫克时，(根据双氯芬酸钠-蛋白质样品标准曲线，图12c)蛋白质溶液可保持澄清，表明蛋白质在30.5毫克双氯芬酸保护下完全没有变性。

已知蛋白质热稳定性与抗炎症活性相对应，所以虫草糖肽的抗炎症活性是双氯芬酸的3.05％，或表述为1克双氯芬酸相同32.8克虫草糖肽的抗炎活性。

实施例10：虫草真菌源袪痘制剂对痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)测试:

测定方法：

(1)虫草真菌源袪痘制剂(CSE-Poly-G2)-培养基原液：CSE-Poly-G2加入到胰蛋白酶大豆肉汤培养液中，配制成浓度含250,000ug G2/ml培养液。

(2)对原液进行2倍稀释制备浓度梯度：管1-8

(3)接种痤疮丙酸杆菌：在管1-8种接种10ul痤疮丙酸杆菌原种。

(4)阳性对照C1：1ml无菌胰蛋白酶大豆肉汤+10ul痤疮丙酸杆菌。

(5)阴性对照C2：1ml无菌胰蛋白酶大豆肉汤+0.2mlG2-培养基原液(试管1)，不添加任何痤疮丙酸杆菌。

(6)将所有试管在37℃培养72小时。

(7)观察浊度：浓度最低，无浊度的试管G2的最小抑菌浓度(MIC)。

(8)所有培养后的试管(1-8，C1，C2)划线接种到胰蛋白酶大豆琼脂平板上。

(9)将所有琼脂平板在37℃培养72小时。

(10)观察琼脂平板上痤疮丙酸杆菌的生长菌落以确定最低杀菌浓度(MBC)。

结果：

测试结果见图13a和13b，从而可以得出结论虫草真菌源袪痘制剂G2以干物质计的最小抑菌浓度(MIC)是6.25％，它的最小杀菌浓度(MBC)为25％。

实施例11 虫草真菌源袪痘制剂的成份质量指标

表3 虫草胞外多糖外用制剂

形态	浓缩液体含固形物62-65％
		颜色	黑色，深棕色
气味	正常发酵味
		pH	4.0-4.2
溶解性	溶解于水
		保质期	在铝制食用蒸煮袋中保持两年

表4 虫草胞外多糖精制可注射制剂

形态	结晶粉末状
		颜色/气味	无色、无味
pH	4.0-4.2
		溶解性	溶解于水
保质期	在密闭容器中保持2年

表5 化学成份分析

抗炎症活性(双氯芬酸钠计)	大于3.0g/100g
		多糖含量	大于90g/100g
蛋白质	大于5g/100g

*干物质计

表6卫生数据

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (19)

1.一种虫草属真菌细胞代谢产物用在制备护肤品中的用途，所述护肤品具有祛痘的作用，所述虫草菌种类包括以下任意一种或几种：冬虫夏草、中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被毛孢、蛹虫草、虫草藻、大团囊虫草、亚香棒虫草、珊瑚虫草、蝉花、虫草实蝇。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌细胞代谢产物是祛痘作用的主要有效成分或唯一有效成分。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述虫草属真菌细胞代谢产物的主要成分是多糖和/或糖肽。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述多糖或糖肽是若干单糖分子组成的多糖链；所述糖肽是蛋白质稳定剂。

5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述虫草属真菌细胞代谢产物具有抑制和/或杀灭痤疮丙酸杆菌的功效，最小抑菌浓度是6.25％，最小杀菌浓度为25％。

6.根据权利要求1所述的的用途，其特征在于：所述虫草属真菌细胞代谢产物具有以下理化性质中的任意一项或几项：

(1)具有一种球形3D结构；

(2)球状表面含有酸性游离羧基的多糖侧链；

(3)pKa＝4.0～4.2。

7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌细胞代谢产物对痤疮的作用包括以下任意一种或几种：(1)镇痛；(2)消除脓疮型青春痘；(3)使痘痕愈合。

8.根据权利要求1～7所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌细胞代谢产物是以虫草属真菌的菌丝体与孢子的细胞外代谢产物为原料经醇提制得。

9.根据权利要求1～7所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌的菌丝体与孢子细胞经固体发酵阶段与液体发酵阶段人工培养获得，收集菌丝体与孢子分泌至细胞外代谢产物而获得。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述人工培养的虫草属真菌为虫草属真菌纯种且经驯化。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述驯化方法选自以下：

方法一：

将虫草属真菌纯种在固体培养基上接种培养，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，如此反复多次驯化虫草属真菌纯种；

方法二：

将虫草属真菌纯种接种液体培养基培养至对数期，经紫外照射后接种固体培养基，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，反复多次选择最早长出的单菌落传代培养以驯化虫草属真菌纯种。

12.一种祛痘制剂，所述祛痘制剂中包含以下任意一种或几种虫草属真菌细胞代谢产物：冬虫夏草、中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被毛孢、蛹虫草、虫草藻、大团囊虫草、亚香棒虫草、珊瑚虫草、蝉花、虫草实蝇。

13.根据权利要求12所述的祛痘制剂，其特征在于：所述祛痘制剂是外用制剂、口服制剂或精制可注射制剂。

14.一种护肤品，所述护肤品包含以下任意一种或几种虫草属真菌细胞代谢产物冬虫夏草、

中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被毛孢、蛹虫草、虫草藻、大团囊虫草、亚香棒虫草、珊瑚虫草、蝉花、虫草实蝇。

15.根据权利要求14所述的护肤品，其特征在于：所述虫草属真菌细胞代谢产物的主要成分是多糖和/或糖肽。

16.根据权利要求14所述的护肤品，其特征在于：所述虫草属真菌细胞代谢产物是所述护肤品的唯一有效成分、主要有效成分或者辅助成分。

17.根据权利要求14所述的护肤品，其特征在于：所述护肤品中还包括其他人体可接受的辅料。

18.根据权利要求14所述的护肤品，其特征在于：所述护肤品是凝胶、精华、水合液、面膜、面霜或者外用膏剂的形式。

19.一种祛痘方法，所述方法包括利用虫草属真菌细胞代谢产物作用于人体，所述虫草属真菌种类至少包括以下任意一种：冬虫夏草、中华被毛孢、蝙蝠蛾拟青霉、蝙蝠蛾被毛孢、蛹虫草、虫草藻、大团囊虫草、亚香棒虫草、珊瑚虫草、蝉花、虫草实蝇。