CN102242044B - 一种蝉花酒及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蝉花酒及其制备，本发明的蝉花酒为以蝉拟青霉的孢梗束和/或菌质为原料经基酒浸泡获得，或者以所述蝉拟青霉的孢梗束的提取物和/或菌质的提取物为原料与饮用酒调配获得。本发明的蝉花酒充分利用原料，有效保留了菌质中有活性的次生代谢成份，保证了产品中活性成分的完整性，产品品质稳定，生产成本低。

Description

一种蝉花酒及其制备

技术领域

本发明属于中药和天然药物技术领域，具体涉及一种蝉花酒及其制备与应用。

背景技术

本发明属于一种虫草酒的制备，特别涉及一种用混合法配制的虫草酒及其制备方法。一直以来，虫草酒作为养生保健饮品在人们养生保健方面做出了巨大的贡献。然而，传统的制备方法主要有渗滤法和冷浸法，这些方法周期长，一般需要6个月，而且浸出物少，提取效率低下，成品性能指标不稳定；往往只使用菌丝体或孢梗束，而对菌质直接丢弃，造成大量有活性次生代谢物损失，提取有效成分单一不全、原料利用率低；成品形态单一，口感较差等。由此使得虫草的生产和加工受到了很大的限制，随着人们生活水平的提高，对保健饮料的要求越来越高，已有的虫草酒不能满足人们的多种保健和治疗需要。

蝉花(Paecilomyces cicadae)属虫生性药用真菌，药用已有1000多年历史，是我国传统的名贵药材之一，具有多方面的药用价值，它是某些蝉若虫受蝉拟青霉菌Paecilomycescicadae寄生后的产物，是一种菌虫复合体。主要成分：虫草多糖、虫草酸、虫草素、尿嘧啶、甾醇、生物碱、维生素、无机盐矿质元素等。蝉花具有调节人体免疫的功能，提高食欲，促进睡眠，增强自身抗病的能力。在这些成分当中，虫草多糖具有独特的生物活性，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效，免疫调节作用成为研究开发的热点。腺苷能抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用。腺苷还具有抗血小板聚集、抗辐射和抗肿瘤等作用。不仅如此，蝉花中的活性成分ISP-1具有双向免疫调节活性，可以大大的提高器官移植手术的成功率，以及对患者的康复也有着明显的积极效果。临床证明，蝉花汤在治疗肾功能衰竭方面也有明显的疗效。制备具有上述功能的蝉花保健酒，使人们在日常饮酒的同时就能达到预防疾病的目的，具有重大的意义。然而，野生的蝉花价格昂贵，产量稀少，无法满足人们日益增长的需求，无法应用于蝉酒的批量生产之中。

本发明的目的旨在克服现有自然蝉花资源上的短缺，采用固体发酵技术，提供一种优质高产蝉花人工培养品即孢梗束及其菌质的浸泡酒及其制备方法，该方法对原材料进行了充分的利用，减少了成本，制备过程中对蝉花活性成分浸出物较多，且制备成酒后性质稳定，生产周期短，工艺合理等优点，为名贵中药材在饮品中的广泛应用创造了条件。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种蝉花酒及其制备方法和应用。

本发明的蝉花酒为以蝉拟青霉的孢梗束和/或菌质为原料经基酒浸泡获得，或者以所述蝉拟青霉的孢梗束的提取物和/或菌质的提取物为原料与饮用酒调配获得。

所述蝉拟青霉的孢梗束为人工培养获得的蝉拟青霉的发酵产物中的孢梗束，用剪刀从孢梗束基部剪下可采集到新鲜的孢梗束。

所述蝉拟青霉的菌质为人工培养获得的蝉拟青霉的发酵产物中除去孢梗束后的菌丝体与剩余物质，发酵后从培养基上用剪刀剪下新鲜的孢梗束后的剩余物质即使菌质。

本发明的蝉花酒可包括下列重量份的原料：

基酒                       80-95重量份；

蝉拟青霉的孢梗束和/或菌质  5-20重量份。

所述基酒可为大麦酒或古道酒。大麦酒或古道酒可为现有市售的各种大麦酒或古道酒，如产自云南的大麦酒或古道酒。较佳的，所述大麦酒或古道酒的酒的度数在38°及以上，如38°、52°。

上述原料组分的蝉花酒的制备方法包括下列步骤：

1.将干燥的蝉拟青霉孢梗束和/或菌质按照与基酒的重量比为5-10∶80-95在容器中混合均匀，或者将新鲜的蝉拟青霉孢梗束和/或菌质按照与基酒的重量比为10-20∶80-95在容器中混合均匀；

2.容器封口，并在室温下静置20天以上，较佳为20-30天；

3.过滤：采用滤纸抽提过滤获得澄清滤液即为蝉花酒。一般过滤2次即可澄清。

所述干燥的蝉拟青霉孢梗束和/或菌质的含水量为5-10％(含水量即水份在总重量中所占的重量百分含量)。干燥的蝉拟青霉孢梗束和/或菌质可在45℃-60℃下烘干获得。

进一步优化的，本发明的蝉花酒也可包括下列重量份的原料：

蝉拟青霉孢梗束提取液 2～5份

蝉拟青霉菌质提取液   15～18份

饮用酒               77～83份。

所述蝉拟青霉孢梗束提取液与蝉拟青霉菌质提取液的重量比为：1∶9～1∶3。

所述蝉拟青霉孢梗束提取液或蝉拟青霉菌质提取液为分别以蝉拟青霉的孢梗束或菌质为原料提取获得。

所述提取方法为：先将原料(干燥的或新鲜的蝉拟青霉孢梗束或蝉拟青霉菌质)经水提取后分离水提液，将水提后的原料再经醇的水溶液多次提取后分离醇提液，而后合并提取液并浓缩。

所述干燥的蝉拟青霉孢梗束或菌质的含水量为5～10％。可采用在45℃-60℃下烘干获得。

所述新鲜的蝉拟青霉孢梗束或菌质色泽浅黄，具香味。

所述提取方法中，水提取时所用的水是饮用水，醇的水溶液是以粮食为原料酿造的饮用酒配制，如荞麦、高粱、为原料酿造的饮用酒，优选酒精含量为38°以上的荞麦、高粱、古道酒；

较佳的，所述提取方法中，水提取的方法为：将原料与水以重量体积比1∶7～30Kg/L混合，于45-55℃下提取2～4小时，分离水提液。

较佳的，所述提取方法中，经醇的水溶液多次提取的方法为：将水提后的原料用不同浓度(重量百分比浓度均位于20-70％的范围)的乙醇水溶液回流提取。如分别经浓度为20％、50％、70％的乙醇水溶液回流提取，分离醇提液。

较佳的，所提取方法中，合并水提液与醇提液后采用减压浓缩获得相对密度为1.0±0.1的提取液。

优化配方的蝉花酒的制备方法包括下列步骤：

将蝉拟青霉孢梗束提取液和蝉拟青霉菌质提取液按比例混合均匀配成母液，将母液按比例采用饮用酒勾兑并调味，而后过滤获得蝉花酒。

较佳的，蝉拟青霉孢梗束提取液和蝉拟青霉菌质提取液按重量比1∶9～1∶3混合配成母液。

采用饮用酒勾兑并调味后，还可包括加入母液重量1±0.2％的澄清剂。所述澄清剂选自101果汁澄清剂、甲壳素类澄清剂、ZTC1+1澄清剂等。

过滤可采用过滤装置进行。

本发明的蝉花酒可作为保健品或饮品饮用。

进一步的，本发明还对人工培养获得蝉拟青霉发酵产物的方法进行了优化，包括如下步骤：

1)菌种制备：包括斜面种培养和一级种培养；

其中，斜面种制备包括如下步骤：将分离纯化的蝉拟青霉菌株移植到PSA培养基斜面试管中，在22℃～25℃下培养5～7天，挑选长势较好的作为斜面种；也可采用现有的蝉拟青霉菌斜面种。

一级种制备包括如下步骤：将斜面种接入马铃薯蔗糖培养液中，在22℃～25℃，振荡频率为130～150r/min的条件下培养3～7天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后作为一级种备用；

2)接种：将步骤1)中制得的一级种接入到置有固体培养基的培养器皿中；

3)发酵：接种后的培养器皿移至培养室，在20℃～25℃，空气相对湿度为60％～80％的条件下培养30天～50天；

4)蝉花孢梗束和菌质的采收：一般当蝉花孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收。

较佳的，步骤1)中，所述PSA培养基中含有如下组分：每1000ml培养基中含有马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g。其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min～30min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/5～1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

较佳的，步骤1)中，所述马铃薯蔗糖培养液中含有如下组分：每1000ml培养液中含有马铃薯200g、蔗糖20g。其制备方法为：将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸15min～30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的20％～30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

较佳的，步骤2)中，所述接种的步骤为：当培养器皿中的固体培养基的温度冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，按照3～5％的接种量将一级种接入培养器皿中。

较佳的，步骤2)中，所述固体培养基的制备原料包括：

基质       42～46重量份；

甘蔗渣     2～10重量份；

贝壳粉     0.1～0.5重量份；

蚕蛹粉     2～5重量份；

硝酸钾     0.1～0.5重量份；

水         44～56重量份；

其中，所述基质选自如下组合中的一种：玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物；小麦；大麦；粟和蔗糖的混合物；大米和蔗糖的混合物；高粱和蔗糖的混合物。

优选的，所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物中，以所述玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物的总重量计，玉米粉、麸皮和蔗糖的重量百分比分别为：玉米粉43％～55％、麸皮44％～55％、蔗糖1％～2％。

优选的，所述粟和蔗糖的混合物中，以所述粟和蔗糖的混合物的总重量计，粟和蔗糖的重量百分比分别为：粟98％～99％、蔗糖1％～2％。

优选的，所述大米和蔗糖的混合物中，以所述大米和蔗糖的混合物的总重量计，大米和蔗糖的重量百分比分别为：大米98％～99％、蔗糖1％～2％。

优选的，所述高粱和蔗糖的混合物中，以所述高粱和蔗糖的混合物的总重量计，高粱和蔗糖的重量百分比分别为：高粱98％～99％、蔗糖1％～2％。

优选的，所述固体培养基的制备方法为：先将除蔗糖外的基质煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉等按照比例混合均匀。

优选的，所述固体培养基中还含有蛋白胨(鱼粉)，且所述蛋白胨(鱼粉)的重量份为0.5重量份。

优选的，步骤2)中，所述固体培养基的碳氮比为80～98。

较佳的，步骤3)中，在固体发酵后期孢梗束生长阶段要求采光，培养过程中需保持空气流通。

较佳的，步骤4)中，所述采收的具体步骤为：去掉透气封口膜，用工具将培养物取出分离孢梗束，烘干分级，干燥后用薄膜袋真空包装，菌质置于-20℃贮存。

采用上述人工培养方法获得的人工栽培蝉拟青霉方法简便、生产成本低、栽培周期短，初步研究表明，所得培养物具有质量高、稳定性好，多糖含量为野生蝉花多糖含量的2倍以上。

本发明的蝉花酒具有：

调节人体免疫的功能，提高食欲，促进睡眠，增强自身抗病的能力。抑制中枢神经元的兴奋性，可以扩张冠状及周围血管、增加冠状动脉血流量、降低血压、减慢心率等作用，还具有抗血小板聚集、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗衰老等功效。

和现有技术相比，本发明具有以下优点：

对孢梗束和菌质均进行了利用，有效保留了菌质中有活性的次生代谢成份，保证了产品中活性成分的完整性，且充分利用原材料。用饮用酒对原料中的活性成分进行醇提取，保证了活性成分的提取效率，提高了原材料的有效使用率，产品的品质稳定，降低了生产成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1蝉拟青霉发酵产物的获得

1、菌种的制备和培养：

(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；

①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；

②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后在无菌条件下把备用的斜面种接入锥形瓶中，在22℃，振荡频率为130r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

本实施方式采用的PSA培养基配比为每1000ml培养基：马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸20min，过滤，加入蔗糖与琼脂，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至试管内，装量为试管长的1/4，塞上棉塞，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，趁热将试管摆放在斜面板上冷却。

本实施方式采用的马铃薯蔗糖培养液配比为每1000ml培养液：马铃薯200g、蔗糖20g，其制备方法为将去皮马铃薯切丁置于容器内加水1000ml，煮沸30min，过滤，加入蔗糖，补足水至1000ml，加热溶解，然后分装至锥形瓶内，装量为锥形瓶容量的30％，塞上棉塞，再用牛皮纸包裹，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，取出冷却至20℃以下。

(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％，用透气封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质42重量份，甘蔗渣2重量份，贝壳粉0.1重量份，蚕蛹粉2重量份，硝酸钾0.1重量份，蛋白胨(鱼粉)为0.5重量份，水为56重量份，其中基质由玉米粉、麸皮和蔗糖组成，且以基质的总重量计，玉米粉的重量百分比为55％、麸皮的重量百分比为44％、蔗糖的重量百分比为1％。其制备方法为：先将玉米粉、麸皮煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、蛋白胨、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均匀。

(3)灭菌：将培养盒放入灭菌锅中，于0.15MPa压力下灭菌30min；

(4)接种：在固体培养基冷却至20℃以下后，在无菌条件下接种，每300ml一级种接50-60只培养盒；

(5)发酵：接种后的培养盒移至培养室在20℃-25℃，相对湿度60％-80％下培养30d-50d，后期孢梗束生长阶段要求采光，每天需适时通气，保持培养室内空气新鲜；

(6)采收：当蝉花孢梗束高度达9cm左右、表面有少量分生孢子出现时即可采收；采收时，去掉封口膜，取出蝉拟青霉人工培养物，用剪刀剪下新鲜的孢梗束并收集，剩余即为新鲜菌质，为长期保存，可将孢梗束与菌质烘干分级，用薄膜袋真空包装。

2、产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由分生孢子梗、分生孢子、菌丝体与培养基的混合物三部分组成。经药理学实验证明，本实施例中经培养后的蝉拟青霉的培养产物具有调节免疫、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能的作用，同时与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本发明的蝉拟青霉人工培养物价格相对低廉，生态要求相对比较低，因此可以大力开发蝉花其人工培养物，具有极强的实际应用价值。

实施例2蝉拟青霉发酵产物的获得

1、菌种的制备和培养：

(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；

①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在25℃下培养7天，挑选长势好的备用；

②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后接入锥形瓶中，在25℃，振荡频率为150r/min的条件下培养3天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

马铃薯蔗糖琼脂培养基及马铃薯蔗糖培养液制备同实施例1。

(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％-25％，用封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣5重量份，贝壳粉0.4重量份，蚕蛹粉2.5重量份，硝酸钾0.1重量份，水为44重量份；其中基质为小麦。其制备方法为：先将小麦煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉，蚕蛹粉按照比例混合均匀。

(3)灭菌、接种、固体发酵及采收步骤均同实施例1。

2、产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由分生孢子梗、分生孢子、菌丝体与培养基的混合物三部分组成。经药理学实验证明，本实施例中经培养后的蝉拟青霉的培养产物具有调节免疫、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能的作用，同时与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本发明的蝉拟青霉人工培养物价格相对低廉，生态要求相对比较低，因此可以大力开发蝉花其人工培养物，具有极强的实际应用价值。

实施例3蝉拟青霉发酵产物的获得

1、菌种的制备和培养：

(1)菌种制备：制备马铃薯蔗糖琼脂培养基或马铃薯蔗糖培养液备用；

①斜面种制备：从云南三江源头采集的野生蝉花通过组织分离纯化获得，转管后，在22℃下培养5天，挑选长势好的备用；

②一级种制备：将马铃薯蔗糖培养液装入锥形瓶中，置于灭菌锅内0.15MPa压力下灭菌30min，冷却后接入锥形瓶中，在23℃，振荡频率为130r/min的条件下培养5天，至锥形瓶内出现大量菌丝球后备用；

马铃薯蔗糖琼脂培养基及马铃薯蔗糖培养液制备同实施例1。

(2)配料装盒：配制固体培养基，将配好的培养基装入培养盒中，装料量为15％，用封口膜封口；本实施方式所述的固体培养基配比为基质46重量份，甘蔗渣10重量份，贝壳粉0.5重量份，蚕蛹粉5重量份，硝酸0.5重量份，水为44重量份；其中基质为粟和蔗糖组成，且以基质的总重量计，粟的重量百分比为98％、蔗糖的重量百分比为2％。其制备方法为：先将粟煮熟，将蔗糖、硝酸钾在水中溶解，再与甘蔗渣、贝壳粉、蚕蛹粉按照比例混合均匀。

(3)灭菌、接种、固体发酵及采收步骤均同实施例1。

2、产量及性质检测：

本实施例中所得的培养产物由分生孢子梗、分生孢子、菌丝体与培养基的混合物三部分组成。经药理学实验证明，本实施例中经培养后的蝉拟青霉的培养产物具有调节免疫、解热镇痛、镇静催眠、滋补强壮、改善肾功能的作用，同时与天然蝉花相比，由于天然蝉花对生长环境要求较高，产量较少，而本发明的蝉拟青霉人工培养物价格相对低廉，生态要求相对比较低，因此可以大力开发蝉花其人工培养物，具有极强的实际应用价值。

实施例1-3中制得的培养产物中多糖含量的测定：

1、试剂

A液：0.1％葡萄糖标准液

精确称量烘干后葡萄糖0.1g，用蒸馏水定容到100ml，浓度为0.1％。

B液：5％苯酚溶液。

精取称取5g重蒸酚，用蒸馏水定容到100ml。

2、样品的前处理

精确称取野生蝉花、实施例1-3中制得的人工培养蝉拟青霉孢梗束各0.5g，加入10ml蒸馏水，超声萃取10min，然后放入90℃水浴锅，热水浸提2h，4000r/min离心10min，获得上清液。重复上述步骤一次，合并上清液，用于多糖检测。

3、样品多糖测定

1)样液稀释12.5倍。

2)用加样抢精确吸取1ml稀释后样液，加入1ml蒸馏水，再加入5％苯酚溶液，摇匀。加入5ml98％浓硫酸。摇匀。冷却至室温后检测。

3)采用紫外可见分光光度计检测，波长490nm。

4、标准曲线绘制

精确吸取0.1％葡萄糖标准液(A液)0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0ml到试管中，试管编号为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，其中1号试管为空白对照液。分别加水至2.0ml，分别精确加入5％苯酚溶液1.0ml，摇匀迅速加入浓硫酸5.0ml，摇匀，冷却至室温，用紫外可见分光光度法在490nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：y＝0.1475^＊x+0.0226，R2＝0.9915。质量浓度在0.1-0.6mg/ml范围内相关性较好.

5、计算公式

多糖含量＝a·C·V/W

a：稀释倍数，C：由回归方程计算得到的浸提液中糖浓度(mg·mL。)，V：体积(ml)；W：为样品的重量(mg)。

6、检测结果

表1样品测试结果

表1中的结果证明：本实施例中制得的蝉花培养产物中的多糖含量比野生蝉花高，且产物质量稳定，具有很高的实际应用价值。

实施例4：蝉花酒的制备

取实施例1获得的新鲜蝉拟青霉孢梗束和菌质

将蝉拟青霉孢梗束和菌质分别烘干，烘干条件为55℃，48h，含水量5-10％，获得干燥的蝉拟青霉孢梗束和菌质；

按下列重量百分配比配制蝉花酒：

按配方将蝉拟青霉孢梗束和/或菌质加入至大麦酒或古道酒中，搅拌均匀，封口，22℃静置20-30d；采用滤纸过滤2次得澄清蝉花酒；调制口感即得成品。

成品检测：

采用高效液相色谱法对腺苷进行测定；采用苯酚-硫酸比色法对虫草多糖进行测定；采用高碘酸钠比色法对虫草酸进行测定。

检测结果表明人工培养的蝉花制备的蝉花酒其腺苷、虫草酸、虫草多糖的含量均较野生蝉花制备的蝉花酒要高。

实施例5：蝉花酒的制备

按下列步骤制备：

A.孢梗束和菌质提取液的制备

取实施例1获得的新鲜蝉拟青霉孢梗束和菌质

将蝉拟青霉孢梗束和菌质分别烘干，烘干条件为55℃，48h，含水量5-10％，获得干燥的蝉拟青霉孢梗束和菌质；

孢梗束和菌质提取液的制备：

原料：分别采用新鲜的或烘干的蝉拟青霉孢梗束或菌质

步骤：

1)水提：以料水比1∶7(W/V)，于50℃下反应2～4小时，水采用饮用水；

2)醇提：将水提取后的原料分别用浓度为20％、50％、70％的乙醇水溶液回流提取；

3)合并步骤1和2获得的提取液，减压浓缩成相对浓度为1.0的浸膏，即分别获得孢梗束提取液和菌质提取液并对提取液中活性成分进行测定，检测结果表明人工培养的蝉花制备的蝉花酒其腺苷、虫草酸、虫草多糖的含量均较野生蝉花制备的蝉花酒要高。

B.母液的制备

按孢梗束提取液和菌质提取液1∶9比例混合即得母液。

C.蝉花酒的勾兑及调制

利用调配好的母液进行调酒过程，所述的调酒过程是：以调配好的母液和52度的古道酒按照20∶80的比例进行前期调配，然后再进行蝉酒口味调配、过滤后即为成品。成品酒调酒完成后，采用过滤装置进行处理。

实施例6：蝉花酒的制备

按下列步骤制备：

A.孢梗束和菌质提取液的制备

取实施例1获得的新鲜蝉拟青霉孢梗束和菌质

将蝉拟青霉孢梗束和菌质分别烘干，烘干条件为55℃，48h，含水量5-10％，获得干燥的蝉拟青霉孢梗束和菌质；

孢梗束和菌质提取液的制备：

原料：分别采用新鲜的或烘干的蝉拟青霉孢梗束或菌质

步骤：

1)水提：以料水比1∶30(W/V)，于50℃下反应2～4小时，水采用饮用水；

2)醇提：将水提取后的原料分别用浓度为20％、50％、70％的乙醇水溶液回流提取；

3)合并步骤1和2获得的提取液，减压浓缩成相对浓度为1.0的浸膏，即分别获得孢梗束提取液和菌质提取液并对提取液中活性成分进行测定，检测结果表明人工培养的蝉花制备的蝉花酒其腺苷、虫草酸、虫草多糖的含量均较野生蝉花制备的蝉花酒要高。

B.母液的制备

按孢梗束提取液和菌质提取液1∶3比例混合即得母液。

C.蝉花酒的勾兑及调制

利用调配好的母液进行调酒过程，所述的调酒过程是：以调配好的母液和52度的大麦酒按照23∶77比例进行前期调配，然后再进行蝉酒口味调配、过滤后即为成品。成品酒调酒完成后，采用过滤装置进行过滤处理。

实施例7毒性检测

泡酒原料孢梗束、菌质的急性毒理实验

1、检测方法：(1)按体重要求选雌、雄实验小鼠。(2)实验时用成品的10倍浓缩液供试，酒度与产品相同，溶剂为蒸馏水作为受试样品，将受试样品采用最大耐受剂量法对实验动物染毒，小鼠逐只称重，在24小时内对小鼠两次灌胃，时间间隔6小时。(3)染毒后观察动物的一般状态、体重变化、中毒症状和死亡情况等，观察期为一周。(4)实验末再次对动物称重。对死亡动物及到期处死的动物进行尸体解剖，肉眼观察大体病理改变情况。(5)实验全程及观察内容均做了详细记录，按最大耐受剂量法试验结果求得小鼠急性经口MTD。

2、检测结果：

1)：试验期间，实验动物主要体征表现：观察期内各组动物活动正常，毛色光泽度好，未见任何中毒体征和死亡；到期处死动物，大体解剖肉眼观察各脏器情况，未见异常。

2)：雌性小鼠：MTD＞10000mg/kg；雄性小鼠：MTD＞10000mg/kg。急性经口毒性试验的最大耐受剂量MTD均大于10000mg/kg。按急性毒性分级，属实际无毒类，属于实际无毒级。

实施例8MTT法检测不同浓度的蝉花酒对淋巴细胞增殖能力的影响

1、实验材料与方法

11样品：实施例5所得蝉花酒，为褐色液体。

1.2实验动物及环境：昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重19-22克，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，饲以常规饲料。生产许可证号：SCXK(沪)2007-0005。饲养室温度20-25℃，相对湿度：40-70％。按照水对照组、酒基对照组(52度的古道酒)和低、中、高剂量组，雌雄各6只。

1.3剂量选择：蝉花酒人体推荐量为每人每日50ml，将样品浓缩20倍，即实验用推荐量为2.5ml/d，每人按照60kg体重计算，相当于0.04ml/d/kg，按照相当于人体推荐量的5倍、10倍、20倍确定小鼠的低、中、高剂量，即各组小鼠每日食用量0.2ml/kg/d、0.4ml/kg/d、0.8ml/kg/d，经口每日一次灌胃于受试小鼠。对照组分别以等体积蒸馏水和酒基对照组代替受试物，各组受试物均用酒基调整至酒精度为10％(V/V)，连续给予30天后测免疫指标。

1.4实验方法：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小瓶皿中，制成细胞悬液。用Hank’s液洗涤2次，每次1000rpm离心10min，然后将细胞悬浮于1mlRPMI1640的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为3×10⁶个/ml，将细胞接种至24孔板里，每孔1ml，在其中一孔加75μlConA液，另一孔作为对照，培养72h使细胞贴壁，去除0.8ml上清液，加入0.8ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入50μl/孔(终浓度5mg/mL)的MTT，培养4h后，去除上清，加入1ml酸性异丙醇，振荡器上震荡溶解，在570nm波长下，酶标仪测定OD值，并计算实验孔OD值与对照孔OD值之差，以此表示淋巴细胞的增殖能力。

2、实验结果

组别	动物数(只)	淋巴细胞增殖能力(OD差值)	P值
				水对照组	12	0.064±0.027
酒基对照组	12	0.064±0.029	0.987
				低剂量组	12	0.081±0.042	0.327
中剂量组	12	0.106±0.080*	0.017
				高剂量组	12	0.113±0.047**	0.005

*P＜0.05，**P＜0.01

结果表明，经口给予小鼠不同剂量的蝉花酒30d，经统计学处理，其淋巴细胞增殖能力在酒基对照组与水对照组、低剂量组间比较，差异无显著性(P＜0.05)，在中、高剂量组与水对照组间比较，差异均有显著性(P＜0.05，P＜0.01)，即蝉花酒可增强小鼠淋巴细胞转化能力，具有增强免疫功能的效果。

Claims (9)

1.一种蝉花酒，为以蝉拟青霉的孢梗束和/或菌质为原料经基酒浸泡获得，或者以所述蝉拟青霉的孢梗束的提取物和/或菌质的提取物为原料与饮用酒调配获得，

所述蝉花酒包括下列重量份的原料：

基酒                    80-95重量份；

蝉拟青霉的孢梗束和菌质  5-20重量份；

蝉花酒采用包括下列步骤的方法制得：

1）将干燥的蝉拟青霉孢梗束和菌质按照与基酒的重量比为5-10：80-95在容器中混合均匀，或者将新鲜的蝉拟青霉孢梗束和菌质按照与基酒的重量比为10-20：80-95在容器中混合均匀；

2）容器封口，并在室温下静置20天以上；

3）过滤：过滤获得澄清滤液即为蝉花酒；

或者，所述蝉花酒包括下列重量份的原料：

蝉拟青霉孢梗束提取液  2～5重量份

蝉拟青霉菌质提取液    15～18重量份

饮用酒                77～83重量份；

所述蝉拟青霉孢梗束提取液或蝉拟青霉菌质提取液为分别以蝉拟青霉的孢梗束或菌质为原料提取获得，所述提取方法为：先将原料经水提取后分离水提液，将水提后的原料再经醇的水溶液多次提取后分离醇提液，而后合并提取液并浓缩；所述提取方法中，水提取的方法为：将原料与水以重量体积比1：7～30Kg/L混合，于45-55℃下提取2～4小时，分离水提液；经醇的水溶液多次提取的方法为：将水提后的原料用重量百分比浓度为20-70%的乙醇水溶液多次回流提取,多次乙醇水溶液回流提取时，采用不同浓度的乙醇水溶液。

所述蝉花酒采用包括下列步骤的方法制得：

将蝉拟青霉孢梗束提取液和蝉拟青霉菌质提取液按比例混合均匀配成母液，将母液按比例采用饮用酒勾兑并调味，而后过滤获得蝉花酒；

所述蝉拟青霉的孢梗束及菌质均来源于人工培养获得的蝉拟青霉的发酵产物；

所述人工培养的蝉拟青霉发酵产物经包括下列步骤的方法制得：

1）菌种制备：包括斜面种培养和一级种培养；

2）接种：将步骤1）中制得的一级种接入到置有固体培养基的培养器皿中；

3）固体发酵：接种后的培养器皿移至培养室，在20℃～25℃，空气相对湿度为60%～80%的条件下培养30天～50天；

4）孢梗束和菌质的采收；

所述步骤1）中，斜面种培养采用PSA培养基，一级种培养采用马铃薯蔗糖培养液；

所述步骤2）中，固体培养基的制备原料包括：

其中，所述基质选自如下组合中的一种：玉米粉、麸皮和蔗糖的混合物；小麦；大麦；粟和蔗糖的混合物；大米和蔗糖的混合物；高粱和蔗糖的混合物。

2.如权利要求1所述蝉花酒，其特征在于，所述基酒选自大麦酒或古道酒。

3.如权利要求1所述蝉花酒，其特征在于，所述蝉拟青霉孢梗束提取液与蝉拟青霉菌质提取液的重量比为：1:9-1:3。

4.如权利要求1所述蝉花酒，其特征在于，所述提取方法中，合并提取液后采用减压浓缩获得相对密度为1.0±0.1的提取液。

5.如权利要求1所述蝉花酒，其特征在于，所述固体培养基中还含有蛋白胨0.5重量份。

6.如权利要求1所述蝉花酒，其特征在于，所述步骤3）中，在固体发酵后期孢梗束生长阶段要求采光，培养过程中保持空气流通。

7.如权利要求1或2所述蝉花酒的制备方法，包括下列步骤：

1）将干燥的蝉拟青霉孢梗束和菌质按照与基酒的重量比为5-10：80-95在容器中混合均匀，或者将新鲜的蝉拟青霉孢梗束和菌质按照与基酒的重量比为10-20：80-95在容器中混合均匀；

2）容器封口，并在室温下静置20天以上；

3）过滤：过滤获得澄清滤液即为蝉花酒。

8.如权利要求1、3-6任一权利要求所述蝉花酒的制备方法，包括下列步骤：

将蝉拟青霉孢梗束提取液和蝉拟青霉菌质提取液按比例混合均匀配成母液，将母液按比例采用饮用酒勾兑并调味，而后过滤获得蝉花酒。

9.如权利要求8所述蝉花酒的制备方法，在采用饮用酒勾兑并调味之后过滤之前，增加加入母液重量0.8-1.2%的澄清剂的步骤。