CN104277099B - 一种虫生真菌抗菌肽的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用，本发明的虫生真菌抗菌肽制品选用虫生真菌蝉花虫草为原料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经Sephadex G‑15柱层析、DEAE‑Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G‑50柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。该抗菌肽制品主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有抑菌活性。本发明具有简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性强的特点。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用。本发明涉及生物活性物质分离纯化的技术领域。
背景技术
青霉素等抗生素的发现给病原菌感染性疾病的治疗带来了革命性飞跃。与此同时人们也意识到病原微生物将最终会产生抗性。但令人惊讶的是病原菌抗性产生的速度和抗性的广泛性。近年来，在临床治疗中结构新颖的抗生素发现匾乏，抗药菌群迅猛发展，使某些感染性疾病成为临床治疗的难题。抗生素、化学防腐剂作为病原菌抑制剂添加到食品、饲料和化妆品中由来已久。但随着抗生素和化学防腐剂的广泛使用和人们对食品质量和环境质量的要求不断提高，它们的副作用也就日益表现出来，面临着被淘汰的局面。据美国卫生基金会和国家癌症研究所新公布的一份报告表明在全世界每年罹患癌症的500万人中，有50％左右与食品污染有关，而其中有30％左右受害于食品中的抗生素或化学防腐剂。为了应对以上种种问题，人们在不断研究和开发新型天然抗菌药物和抗菌防腐添加剂。近年来出现的抗菌肽就是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药物、食品防腐保鲜添加剂和饲料添加剂。
抗菌肽是一类小分子阳离子肽类生物活性物质，广泛存在微生物、植物、动物及人体内。到目前为止，已从生物界分离得到800多种抗菌肽。虽然抗菌肽具有广泛的抗性(抗细菌、真菌、病毒、原虫等活性)，但是对正常的哺乳动物细胞无毒性。抗菌肽并不诱发抗性突变的产生，多数抗菌肽的水溶性较好，对热稳定，对较大离子强度、较低或较高的pH都有较强的耐受性。因而抗菌肽可以作为医用和食品方面抗菌性的抗生素的替代药物或添加剂。抗菌肽的开发与应用研究已成为国内外研究的热点。
基于抗菌肽的重要作用，许多学者开展新型抗菌肽的寻找及制备研究。寻找和制备抗菌肽有三种途径：化学合成，生物工程(重组技术)和从生物中筛选天然的抗菌肽类。化学合成常受到合成起始点的基础结构的限制。生物工程也存在如不正确转录而导致折叠不准确的蛋白质等问题。从生物中筛选抗菌肽具有来源丰富、物质天然等优点，因而倍受抗菌肽研究工作者的青睐。
微生物在人类的生产和生活中具有广阔的应用范围，如治疗药物、精细化工、农用药物、发酵及食品工程等。近年来微生物来源的生物抗菌物质已经逐步得到开发和利用，这些抗菌物主要来源于细菌、真菌及放线菌。真菌是由不同进化途径的类群组成，现已发现69000种。真菌被用作药物，在我国已有悠久的历史，它不仅是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的组成部份，而且已成为当今探索和发掘新药的重要领域。目前国内外学者已经发现了许多具有新颖结构和抗菌活性的真菌抗菌活性物质，主要包括萜类及其皂苷、生物碱类、芳香类、甾体类、酚类和酚酸类以及肽类等。
这些抗菌物质多为从植物内生真菌中分离纯化出来的，而从虫生真菌中分离报道的则还没有。虫生真菌是指那些在正常生理条件下就能直接侵入寄主体内，增殖和快速引起死亡以及一些不引起昆虫致命疾病,但可降低寄主活力并使其衰弱的真菌类群。虫生真菌种类多，数量大，代谢类型复杂，可以产生多种生理功能特异的生物活性物质，这种代谢产物的多样性为人类开发新的药品及其它领域的利用提供了重要的新资源途径。
发明内容
针对现有技术中存在的问题与不足，本发明的目的在于提供一种虫生真菌抗菌肽制品及其制备方法和应用。本发明具有制备的抗菌肽纯度高、活性高的特点。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明提供了一种虫生真菌抗菌肽制品的制备方法：本发明选用虫生真菌蝉花虫草为原材料，优化的发酵培养液发酵培养后，经纱布过滤除菌丝后离心收集上清；上清旋转蒸发浓缩后乙醇沉淀去多糖，去除多糖的上清经硫酸铵盐析收集沉淀。沉淀溶于灭菌水后经柱层析纯化后得到虫生真菌抗菌肽制品。
在一些优选的方式中，本发明使用的虫生真菌为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草(Ophiocordyceps sobolifera)022007-9号菌株。蝉花虫草又被称作为蝉拟青霉，是一种虫生真菌。
在另一些优选的方式中，一种从保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草(Ophiocordyceps sobolifera)022007-9菌株提取抗菌肽的方法，包括：(1)菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d。用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度待用；
(2)发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到筛选出的250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的为：蛋白胨5g/L，蔗糖20g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水。
(3)发酵液的处理：经过步骤(2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12 000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，后在4℃下，12 000rpm/min离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目。
(4)硫酸铵盐析：将步骤(3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，后在4℃下，12 000rpm离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液；
(5)将经过步骤(4)溶于灭菌蒸馏水的沉淀进行Sephadex G-15柱层析、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-50柱层析分离纯化得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。
一些优选的方式中，所述的Sephadex G-15柱层析方法是：将上述溶于灭菌蒸馏水的(1mL)沉淀上样于Sephadex G-15柱(2.6×10cm)，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL/min，检测波长为280nm，收集第II个峰组分获得的样品II，冷干后低温下冻存。
在一些优选的方式中，所述的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析是：将经过Sephadex G-15柱层析后活性峰样品(II)1mL上样于DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱(2.6×10cm)，流速3mL/min，检测波长280nm。分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1mol/L NaCl缓冲液(pH 6.5)进行洗脱，收集第1峰组分获得得样品1，冷干后低温冻存。
在一些优选的方式中，所述的Sephadex G-50柱层析是将1mL生物上述样品1上样于Sephadex G-50柱(1.6×30cm)，以0.05mol/L NaCl缓冲液(pH 6.5)作为流动相洗脱，流速0.4mL/min，检测波长为280nm，收集所示标记为G1组分。冷干后即为所述的虫生真菌抗菌肽制品，低温冻存。
本发明提供的上述制备方法制备的虫生真菌抗菌肽制品，是由分子量较小的肽类组成的，主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类，外在形态表现为淡黄色粉末状。
本发明还提供了一种虫生真菌抗菌肽制品作为原料的应用，采用上述方法制备的抗菌肽制品能用作医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品。
发明人对本发明抗菌肽制品进行了以下的检测或测定：
本发明采用常规的高效液相色谱(HPLC)和N-三(羟甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS－PAGE)对制备的抗菌肽进行组成及纯度检测；利用Lambert等(1989)的平板打孔穴抑菌法对制备的抗菌肽进行抗菌活性测定；
本制备工艺生产的虫生真菌抗菌肽制品具有如下特征：该抗菌肽是从虫生真菌蝉花虫草中制备得到的一种由多种肽类组成的混合物，主要是一些分子量小于5.8kDa的小分子肽类。产品为淡黄色粉末状，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)等都具有抑菌活性，而且表现出很好的抗菌性。
生物保藏说明
该真菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCC NO.8989，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Ophiocordyceps sobolifera，中文名称为：蝉花虫草，保藏日期为：2014年4月03日。
有益效果
本发明具有原料来源丰富，价格低廉，简便快速，制备的抗菌肽纯度高、活性高，抗菌效果好于常用的天然肽类防腐剂(如Nisin)和化学防腐保鲜剂(如脱氢醋酸钠)。本发明产品与化学合成抗菌剂相比具有无毒，无残留，不受合成起始点的基础结构的限制；选择可以食用的虫生真菌蝉花虫草作为原材料，具有较高的食用安全性；本发明制备方法可大规模工厂化生产，生产周期短，生产成本较低，且不受外在环境的影响。制备的抗菌肽制品可广泛应用于医药原料、食品、果蔬防腐保鲜以及饲料添加剂和护肤品等领域。
附图说明
图1是虫生真菌抗菌肽的Sephadex G-15柱层析图。
图2是虫生真菌抗菌肽的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析图。
图3是虫生真菌抗菌肽的Sephadex G-50柱层析图。
图4是虫生真菌抗菌肽制品组成及纯度Tricine-SDS－PAGE检测，其中M：蛋白质分子量标准；1：浓缩发酵液；2：盐析后沉淀；3：阴离子交换层析后活性组分(图2中“1”组分)；4：Sephadex G-50柱层析后活性组分(图3中“G1”)。
图5是虫生真菌抗菌肽制品组成及纯度HPLC分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。
选用虫生真菌蝉花虫草作为原材料，经发酵培养后制备虫生真菌抗菌肽的方法包括以下实施例1、2、3、4和5所述过程。
实施例1不同发酵培养液虫生真菌蝉花虫草产生活性肽的影响
(1)虫生真菌菌种：蝉花虫草(O.sobolifera)022007-9菌株；
(2)菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d。用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度待用；
(3)发酵培养：将6×107孢子悬浮液体1毫升分别接种到以下三种不同的250mL的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d，各3个重复，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；各3个重复；选用的发酵培养液：
①马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水1L；
②蛋白胨5g，蔗糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L；
③蛋白胨5g，葡萄糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸馏水1L。
摇床结束后分别取滤液和菌丝体，测定菌丝体干重及滤液对细菌的抗菌活性。不同的发酵培养液对发酵液抗菌活性的影响见表1。从表中数据我们可以看出，在①和②发酵培养液之间，无论是从抑菌圈直径，还是从单位重量的菌丝体产生的抑菌圈直径(即抗菌效价)，②发酵培养液产生的抗菌肽的效果要优于①发酵培养液，在抗菌效价上提高了39.62％。在②和③发酵培养液之间(即氮源固定，碳源变化)，从表可以看出不同的碳源既可以影响菌体的生长，又可以影响抗菌效价。从抗菌效价上，②培养液的效果明显优于③培养液，抗菌效价提高58.53％。
综合以上分析，我们确定实验室条件下蝉花虫草022007-9菌株产生抗菌肽的较佳发酵培养液为②发酵培养液，即蛋白胨5g(0.5％)，蔗糖20g(2％)，KH2PO4 1g(0.1％)，MgSO4·7H2O 0.5g(0.05％)，蒸馏水1L。
表1不同的发酵培养液对发酵液抗菌活性的影响
实施例2虫生真菌抗菌肽制品的制备步骤
虫生真菌抗菌肽制品的制备步骤如下：
(1)虫生真菌菌种：蝉花虫草(O.sobolifera)022007-9菌株；
(2)菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d。用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液(种子)，血球计数法计算孢子浓度待用；
(3)发酵培养：将6×107孢子1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；
所述的步骤(3)中采用发酵培养液为：蛋白胨5g，蔗糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸馏水1L。
(4)发酵液的处理：发酵液经双层纱布(孔径：100目)过滤除菌丝后，随后在4℃下，12 000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质。按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍。按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，随后在4℃下，12 000rpm离心30min。收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；
(5)硫酸铵盐析：将上述灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，随后在4℃下，12000rpm离心30min。收集沉淀。沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液；
(6)上述溶于灭菌蒸馏水的沉淀经柱层析分离纯化得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。
第一步，Sephadex G-15柱层析。方法是：将上述溶于灭菌蒸馏水的沉淀(1mL)上样于Sephadex G-15柱(2.6×10cm)，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL/min，检测波长为280nm，收集第II个峰组分(得样品II)，见附图1，冷干后低温下冻存。
第二步，DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析。将Sephadex G-15柱层析后活性峰样品(II)1mL上样于DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱(2.6×10cm)，流速3mL/min，检测波长280nm。分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1mol/L NaCl缓冲液(pH 6.5)进行洗脱，收集第1峰组分(得样品1)，见附图2，冷干后低温冻存。
第三步，Sephadex G-50柱层析。方法是将上述样品1(1mL)上样于Sephadex G-50柱(1.6×30cm)，以0.05mol/L NaCl缓冲液(pH 6.5)作为流动相洗脱，流速0.4mL/min，检测波长为280nm，收集附图3所示标记为G1组分。冷干后即为所述的生真菌抗菌肽制品，低温冻存。
实施例3样品的Tricine-SDS-PAGE电泳检测
纯化样品的纯度及分子量估算参考等(1987)的Tricine-SDS-PAGE电泳方法进行[H,von Jagow G.Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1to100kDa.Analytical Biochemistry,1987,166:368-379]。4％浓缩胶，16.5％分离胶。将样品和样品缓冲液按1:1(体积比)混合，沸水浴加热5min，5,000×g离心7min。
上清每孔上样15μL。30伏电压电泳至样品完全从浓缩胶进入分离胶时，电压加至80伏电泳，当溴酚蓝指示剂迁移至分离胶底部时，停止电泳。
染色20-30min(染色液:50％甲醇，10％乙醇，0.2％G-250)，在脱色液(10％甲醇，10％冰醋酸)脱色20-30min，脱色完毕，把胶放在水中观察拍照。Tricine-SDS-PAGE电泳结果如图4所示。由图可以看出，与未纯化的浓缩发酵液(图4第1泳道)相比，G1组分(图4第4泳道)显示出了较高的纯度，分子量主要是一些低于5.8kDa的小肽(图中箭头所示的小肽分子量约为5.8kDa)，进一步表明蝉花虫草发酵液中存在小分子量的抗菌肽类。
实施例4HPLC(高效液相色谱)检测
制备的样品自动进样器进样，上样体积10μL，色谱柱：SunFireTM C18(4.6×250mm,5μM,Waters),系统：Agilent Technologies 1200series。用2％乙腈水溶液(含0.05％三氟乙酸)冲洗8分钟。然后2％-60％乙腈水溶液(含0.05％三氟乙酸)梯度洗脱60分钟；最后100％乙腈冲洗8分钟。流速：0.5mL/min。柱温：室温。220nm波段检测。结果见图5。由图可知，制备的抗菌肽制品经SunFireTM C18分析柱RP-HPLC层析分离后，各个色谱峰分离效果较好。该制品纯度较高，仅含有6个主要的峰组分。
实施例5抗菌活性测定
参照Lambert等(1989)的平板打孔穴抑菌法[Lambert J,Keppi E,Dimarcq JL,etal.Insect immunity:isolation from immune blood of the dipteran Phormiaterranovae of two insect antibacterial peptides with sequence homology torabbit lung macrophage bactericidal peptides.Proceedings of The NationalAcademy of Science of the United States of America,1989,86:262-266]：取缺乏营养的LB固体培养基约20mL，融化后冷却至45℃左右，加入30μL的生测菌(OD600＝0.3)，摇匀，倒入玻璃培养皿。培养基完全凝固后，在平板上打孔，孔径6mm，每孔加入待测样品100μL，以同体积的水作为对照(阴性)，常用肽类防腐剂Nisin和化学防腐保鲜剂脱氢醋酸钠作为阳性对照，室温下待样品完全扩散后，于37℃培养箱中培养过夜，观察并测量抑菌圈直径。结果显示(表2)：制备的抗菌肽制品对革兰氏阴性菌(Escherichia coli K12D31)和革兰氏阳性菌(Staphylococcus aureus)均具有抗菌活性，且效果要好于常用的天然肽类防腐剂(Nisin)和化学防腐保鲜剂(脱氢醋酸钠)。
表2蝉花虫草抗菌肽、Nisin和脱氢醋酸钠对细菌的抑制作用
*：+++：抑菌圈直径＞20mm；++：20mm＞抑菌圈直径＞10mm；+：抑菌圈直径＜10mm；—：没有明显的抑制抵抗作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种从虫生真菌制备抗菌肽制品的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)、菌种活化及种子制备：挑取保藏菌株的成熟孢子在PSA斜面上培养，25±1℃活化7～10d；用灭菌蒸馏水加入斜面中，将孢子冲洗下来，用力震摇3～5min，制成孢子悬浮液，血球计数法计算孢子浓度待用；其中，所述的菌株为保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.8989的蝉花虫草(Ophiocordyceps sobolifera)022007-9号菌株；
(2)、发酵培养：将孢子浓度为6×107的孢子悬浮液1毫升接种到250毫升的发酵培养液中，摇床转速120rpm，25±1℃条件下培养7d；其中，所述的发酵培养液的组成为：蛋白胨5g/L，蔗糖20g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为蒸馏水；
(3)、发酵液的处理：经过步骤(2)发酵的发酵液经双层纱布过滤除菌丝后，在4℃下，12000rpm离心30min除去发酵液中较大颗粒物质；按10︰1体积比加入无水乙醇，64℃下旋转蒸发浓缩至50倍；按1︰3体积比加入无水乙醇，充分搅拌后，在4℃冰箱内静置过夜沉淀多糖，随后在4℃下，12 000rpm离心30min；收集上清，64℃下旋转蒸发至干后用灭菌蒸馏水重溶；其中纱布的孔径为100目；
(4)、硫酸铵盐析：将步骤(3)用灭菌蒸馏水重溶后的样品在4℃条件下缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌使硫酸铵的饱和度达到60％，搅拌半个小时，静置过夜，随后在4℃下，12000rpm离心30min；最后收集沉淀；沉淀溶于灭菌蒸馏水中，经0.45μM膜过滤后，保留滤过液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：步骤(5)，将经过步骤(4)溶于灭菌蒸馏水的沉淀分别依次进行Sephadex G-15柱层析，DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析和Sephadex G-50柱层析分离纯化，从而得到所述的虫生真菌抗菌肽制品。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的Sephadex G-15柱层析方法为：将经过步骤(4)的硫酸铵盐析后沉淀溶于灭菌蒸馏水的1mL样品上样于2.6×10cm的Sephadex G-15柱，以纯水作为流动相洗脱，流速4mL/min，检测波长为280nm，收集第II个活性峰组分并获得样品II。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析的步骤包括：将所述的样品II 1mL上样于2.6×10cm的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱，流速3mL/min，检测波长280nm；分别以0.05、0.1、0.3、0.5和1mol/L NaCl，pH 6.5的缓冲液进行洗脱，收集第1峰活性组分获得样品1。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述的Sephadex G-50柱层析是将所述的样品1的1mL样品上样于1.6×30cm的Sephadex G-50柱，以0.05mol/L NaCl，pH 6.5的缓冲液作为流动相洗脱，流速0.4mL/min，检测波长为280nm，收集活性洗脱液组分即为所述的虫生真菌抗菌肽制品。
6.根据权利要求1-5之一获得的抗菌肽制品在制作医药原料，食品、果蔬防腐保鲜剂，饲料添加剂和护肤品中的用途。
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