CN115436518B - 一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法，包括以下步骤：（1）提取：取冬虫夏草于耐压玻璃管中，加入甲醇溶液，涡旋混匀后放入耐压腔体中，充入氮气使压力达到400 kPa后，加热使其由室温升至120℃，再升至200℃保持10 min，自然冷却至室温，取出提取液；（2）含量检测：取提取液，用甲醇溶液转移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，取10mL定容后的提取液于50 mL离心管，加入四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料，涡旋混匀后外加磁场分离得净化液，然后进行液相色谱‑高分辨质谱检测；本发明的方法配合超高效液相色谱‑四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱，可以将检测限达到1μg/kg。
Description
技术领域
本发明属于冬虫夏草及其制品中有效成分提取和检测技术领域，具体涉及一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法。
背景技术
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）属于线虫草科线虫草属真菌，是我国名贵中药材之一，具有极高的市场价值和药用价值。由于其稀缺性和高价值，人们不断寻找其替代品或制备成各种虫草制品，包括从冬虫夏草中分离出不同菌种，经深层发酵后培养人工菌丝体，或将其超微粉碎后制成含片、胶囊等。由于人工制造的虫草替代品或虫草制品可能与天然的冬虫夏草存在差异，人们通常使用虫草菌真菌特有的标志性成分——虫草素和虫草腺苷，来评价其市场价值和药用效果，并拓展到鉴别假冒冬虫夏草等用途上。由于冬虫夏草中虫草素和虫草腺苷的含量大多在0.01 %左右，人工替代品和制品中的含量可能更低，而当前虫草及其制品中虫草素和虫草腺苷的检测方法大多无法测定出如此低的含量，并还存在提取效率低、有效成分损失大、检测工序多时间长等问题，如：
NY/T 2116-2012《虫草制品中虫草素和腺苷的测定 高效液相色谱法》中规定了一种以水为溶剂，经超声提取后用高效液相色谱仪检测的方法。该方法需在超声波仪中超声提取3 h，且测定范围为30 mg/kg~1000 mg/kg，不仅操作时间长，而且检测低限过高，不能满足当前对虫草制品中虫草素和虫草腺苷的检测要求。
CN108948115B和CN104478978A的专利申请公开了一种使用酶解法提取蛹虫草腺苷的方法。此法操作步骤复杂，不仅需进行精密的梯度干燥和2 h以上的酶提取操作，且所需的虫草样品就超过1 kg，不适用于样品价值极高的冬虫夏草检测。
CN102558265B的专利申请公开了一种蛹虫草腺苷的提取方法，该方法操作过程繁琐，需将虫草样品经低温超微粉碎后先进行反复冻融3~7次，再进行3次连续微波加热提取，还需接种于培养基中进行35天以上的培养，耗时巨大，不利于推广和应用。
CN112007055A和CN102321135B等专利主要公开了制备虫草素提取物和生产虫草素标准品的方法，其技术路线主要是利用树脂和高速逆流色谱分离纯化虫草素，从而用于制备虫草素标准品等用途，与本发明研究的用于冬虫夏草中虫草素和虫草腺苷检测用途的前处理方法不同。
张铭雅等（“HILIC-MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的方法学”，《生物加工过程》，第17卷第4期，2019年，第430~436页）中报道了一种用HILIC-MS/MS测定虫草样品中多种物质的方法，但未提供所用的提取方法。
黄兰芳等（“HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量”，《中国中药杂志》，第29卷第8期，2004年，第762~764页）、谢显珍等（“液相色谱-电喷雾离子化-质谱测定蛹虫草子实体中腺苷含量”，《光谱实验室》，第26卷第3期，2009年，第631~634页）和杨钊等（“冬虫夏草及其代用品中腺苷和虫草素的LC-MS-MS定量分析研究”，《中国中药杂志》，第32卷第19期，2007年，第2018~2020页）报道了一种冬虫夏草中腺苷和虫草素的检测方法，均使用索氏提取器回流4 h进行提取，耗时长效率低，且未包含净化的方法。
王冠宇（“超高效液相色谱-质谱联用法测定虫草素和腺苷”，《品牌与标准化》，2022年第1期，第90~95页）使用液相色谱质谱法检测虫草素和腺苷，但提取方法和NY/T2116-2012完全一致，耗时达2 h以上，也未进行净化处理。
发明内容
针对目前的问题，本发明提供了一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法。
虫草素和虫草腺苷能溶于水或醇，但溶解度一般，研究表明，提高提取时的温度和压力能够促进虫草素和虫草腺苷的溶出，传统方法的提取温度无法超过100 ℃，因此需要进行长时间的加温回流、超声等操作，且整体提取效率不高。本发明将冬虫夏草置于密闭的压力容器中，充入氮气加压并梯度升温至200 ℃进行提取，全部提取操作在40 min内完成。此方法不仅极大的提高了提取效率、减少了提取时间，还加入氮气防止目标物在加温加压下发生氧化，梯度升温和加压控制能使提取后的冬虫夏草完全溶解于提取溶剂中，没有固体形态的残留。
为了减少提取时带入冬虫夏草中的其他成分而对检测分析造成干扰，本发明使用四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料对提取液进行净化。该方法不仅能减少非目标物的干扰，还能通过外加磁场下与提取液快速分离。实验结果表明，该方法配合超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱，可以将虫草素和虫草腺苷的检测限较NY/T 2116-2012提升30000 倍以上，达到1 μg/kg以下。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法包括以下步骤：
（1）虫草素和虫草腺苷提取：
取冬虫夏草或冬虫夏草制品于耐压玻璃管中，加入体积分数为20%的甲醇溶液，涡旋混匀30 s后，放入耐压腔体中，密封腔体，充入氮气使腔体内压力达到 400 kPa后关闭氮气，加热腔体，使其在10 min内由室温升至120 ℃，再以4 ℃/min的速率升至200 ℃并保持10 min，结束后腔体自然冷却至室温，取出提取液；
（2）虫草素和虫草腺苷含量检测：
取步骤（1）的提取液，用体积分数为20 %的甲醇溶液转移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，取10 mL定容后的提取液于50 mL离心管，加入300 mg四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料，涡旋混匀30 s后外加磁场分离，得到净化液，然后进行超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测。
进一步地，步骤（2）中四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料的制备方法为：将纳米四氧化三铁与乙二胺-N-丙基硅烷按质量比为2：1充分混合后，置于50 mL离心管中，加入无水乙醇，涡旋2 min混匀，以1000~2000 W功率超声1 h，室温下静置1 h后，3000~5000 r/min离心3~5 min，弃去上清液，将产物置于60 ℃下真空干燥4 h，取出过150 μm筛网，得到四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料。
进一步地，步骤（2）中液相色谱条件：色谱柱：Inert sustain-C18、100 mm×2.1mm×3 µm；柱温：35 ℃；流动相为水和甲醇；流速0.2 mL/min；采用体积分数为15%甲醇洗脱；进样量10μL。
进一步地，步骤（2）中高分辨质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，阳离子检测模式；鞘气流速：28 L/min；辅助气流速：8 L/min；吹扫气流速：0 L/min；喷雾电压：3200 V；毛细管温度：275 ℃；辅助气加热温度：300 ℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：100 ms，扫描范围100 m/z～300m/z，子粒子扫描分辨率：17500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50 ms。
本发明的显著优点在于：
（1）虫草素和虫草腺苷能溶于水或醇，但溶解度一般，传统方法只能通过长时间的加温回流、超声等操作，不仅操作时间长，还受提取时温度波动和提取效率不稳定的影响，导致检测结果存在较大的波动和偏差。本发明公开的提取方法使用加压、梯度升温的操作，能将温度升到200 ℃以上，并使用氮气防止样品在高温下的氧化反应，将提取时间从NY/T2116-2012等方法和文献中的3~4 h，减少到40 min以下，且提取效率得到极大提升，使固体的目标物完全转换为液态的提取液，没有固体形态的残留。
（2）冬虫夏草成分复杂，提取液中会含有多种有机酸、色素、金属离子等干扰物质，文献和传统检测方法均未涉及相关的净化处理，使方法的检测低限较高，无法满足冬虫夏草制品和替代品中痕量检测的要求。本发明公开的净化方法使用一种直接磁化制备的磁性复合吸附材料新方法，方法简单易行，可高效构建磁性复合吸附材料，所得磁性复合吸附材料净化效果好，在外加磁场下可与液相有效分离，且其原材料方便易得、无毒无害，操作过程简单环保，无需过多后续处理，节约成本、省时省力。
（3）本发明公开的高效提取与净化方法，能有效提升冬虫夏草及其制品中的虫草素和虫草腺苷检测效果，实验结果表明，本方法配合超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱，可以将检测限较NY/T 2116-2012提升30000 倍以上，达到1μg/kg以下，时间从3~4 h减少到40 min以下。
附图说明
图1为本发明的虫草素和虫草腺苷提取流程示意图；
图2为虫草腺苷和虫草素的一级质谱图；
图3为虫草素的二级谱图；
图4为虫草腺苷的二级谱图。
具体实施方式
为让本发明的上述特征和优点能更明显易懂，下文特举实施例，作详细说明。本发明的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。
实验材料与设备：
Ultimate 3000超高效液相色谱仪-Q-Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；电子天平XP205（德国Mettler）;超声波仪器KQ-300DE（中国昆山仪器）。
虫草腺苷和虫草素标准品均购自上海安谱实验科技股份有限公司；四氧化三铁（Fe3O4）颗粒：10~50 nm；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）；甲醇（色谱纯），超纯水（由milli-Q超纯水系统制备）。
标准溶液的配置：
准确称取适量腺苷和虫草素标准物质，分别用甲醇溶解后配制成1000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冷藏保存；准确吸取各标准储备液制备成20μg/L~200μg/L标准工作曲线。
实施例1
一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法包括以下步骤：
（1）虫草素和虫草腺苷提取：
称取0.5 g冬虫夏草于耐压玻璃管中，加入20 mL 20 %（v/v）甲醇溶液，涡旋混匀30 s后，放入耐压腔体中。密封腔体，充入高纯氮气并排开排气阀，至空气全排出（约1 min）后关闭排气阀，继续充入氮气至腔体内压力压到 400 kPa后关闭氮气阀门。加热腔体，使其在10 min由室温升至120 ℃，再以4 ℃/min的速率升至200 ℃并保持10 min。升温过程中观察并控制腔体内的压力小于1000 kPa，必要时打开排气阀释放多余的压力。加热结束后让腔体自然冷却至室温，打开排气阀排出多余气体后，取出提取液。
（2）取出处理后冷却至室温的样品，用20 %甲醇溶液（v/v）转移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀。取10 mL定容后的提取液于50 mL离心管，加入300 mg四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料，涡旋混匀30 s后外加磁场分离，取净化液，进行液相色谱-高分辨质谱检测。
本实施例中，四氧化三铁负载的磁性复合吸附材料（PSA/Fe3O4）的制备方法：将纳米四氧化三铁（Fe3O4，粒径为10~50 nm）与乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）按2：1（质量比）充分混合后，取3.0 g该混合物于50 mL离心管中，加入20 mL无水乙醇，涡旋2 min混匀，以1000~2000 W功率超声1 h，室温下静置1 h后，3000~5000 r/min离心3~5 min，弃去上清液，将产物置于60 ℃下真空干燥4 h，取出过150 μm筛网，得到PSA/Fe3O4。
本实施例中，步骤（2）中液相色谱条件：色谱柱：Inert sustain-C18、100mm×2.1mm×3 µm；柱温：35 ℃；流动相为水和甲醇；流速0.2 mL/min；采用体积分数为15%甲醇洗脱；进样量10μL。
本实施例中，步骤（2）中高分辨质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，阳离子检测模式；鞘气流速：28 L/min；辅助气流速：8 L/min；吹扫气流速：0 L/min；喷雾电压：3200 V；毛细管温度：275 ℃；辅助气加热温度：300℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：100 ms，扫描范围100 m/z～300 m/z，子粒子扫描分辨率：17500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50 ms。
效果验证：
1、保留时间、理论质量数与精确质量数
以化合物加合离子的理论单一同位素的精确质量数作为提取色谱图的依据，理论精确质量数与实测精确质量数的相对偏差越小，则筛查结果的可信程度越高。虫草腺苷和虫草素相关色谱和质谱信息见表1。
表1 腺苷、虫草素的保留时间、理论精确质量数和实测精确质量数
从表1可以看出，虫草腺苷和虫草素的质量数误差<3 mDa，按照欧2002/657/EC增加的LC/MS目标准则，筛查要求质量精度在±50 mDa之间，分辨率>10000，因此可根据保留时间、精确质量数对冬虫夏草中的虫草腺苷和虫草素进行快速筛查与确证。
2、线性范围和最低检出限.
将配制的20μg/L~200μg/L标准工作曲线上机检测，对结果进行线性拟合。采用基质空白提取液逐级稀释标准溶液至仪器所能检出的最低浓度，该浓度满足在较长一段时间内连续多次平行测定的相对标准偏差较低，具体结果见表2。
表2方法的线性方法、相关系数、检出限
3、回收率和精密度结果
本试验使用不含虫草素和虫草腺苷的香菇粉末做为替代品，向其添加检出限浓度水平的标准物质，按所述前处理和仪器分析方法进行检测，重复6次实验并进行回收率和精密度分析，结果见表3。
表3 回收率和精密度（n=6)
从表3可以看中，使用本发明开展的方法具有较好的准确度和精密度，满足方法学验证指标的要求，具有良好的操作性和稳定性。
不采用净化处理的方法时，受到样品中杂质的干扰和影响，使方法无法达到较低的检测限。当未采用本法所述的净化时，各文献中使用具有同等检测灵敏度的液质方法的检测限都在2 μg/kg以上，如“HILIC-MS/MS技术同时检测蛹虫草中虫草素、虫草酸、腺苷和肌苷含量的方法学”中的低限为2 μg/kg；“超高效液相色谱-质谱联用法测定虫草素和腺苷”为5 μg/kg；“HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量”和“液相色谱-电喷雾离子化-质谱测定蛹虫草子实体中腺苷含量中的低限均为100 μg/kg。
本发明采用的液相色谱-高分辨质谱检测冬虫夏草中的虫草腺苷和虫草素为首次应用。通常采用的检测方法包括液相色谱法（NY/T 2116-2012）和液质联用法（HPLC-ESI-MS测定冬虫夏草和蚕蛹虫草中腺苷和虫草素含量）。采用高分辨质谱法的优点是能够更准确的区分目标物和干扰杂质，能更准确的识别目标物.单从检测学的角度，液相色谱法和液质联用法也可以检测虫草，本发明的重点是提供了一种高效提取和净化的前处理方法，使用本方法后，提高了提取的效率，压缩了提取时间，并达到了良好的净化效果，使方法具有良好的灵敏度和操作性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (1)
1.一种冬虫夏草及其制品中虫草素和虫草腺苷含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）虫草素和虫草腺苷提取：
取冬虫夏草或冬虫夏草制品于耐压玻璃管中，加入体积分数为20 %的甲醇溶液，涡旋混匀30 s后，放入耐压腔体中，密封腔体，充入氮气使腔体内压力达到 400 kPa后关闭氮气，加热腔体，使其在10 min内由室温升至120 ℃，再以4 ℃/min的速率升至200 ℃并保持10 min，结束后腔体自然冷却至室温，取出提取液；
（2）虫草素和虫草腺苷含量检测：
取步骤（1）的提取液，用体积分数为20 %的甲醇溶液转移至100 mL容量瓶中并定容至刻度，摇匀，取10 mL定容后的提取液于50 mL离心管，加入300 mg四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料，涡旋混匀30 s后外加磁场分离，得到净化液，然后进行超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱检测；
步骤（2）中四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料的制备方法为：将纳米四氧化三铁与乙二胺-N-丙基硅烷按质量比为2：1充分混合后，置于50 mL离心管中，加入无水乙醇，涡旋2min混匀，以1000~2000 W功率超声1h，室温下静置1 h后，3000~5000 r/min离心3~5 min，弃去上清液，将产物置于60 ℃下真空干燥4 h，取出过150 μm筛网，得到四氧化三铁负载的磁性纳米吸附材料；
步骤（2）中液相色谱条件：色谱柱：Inert sustain-C18、100mm×2.1 mm×3 µm；柱温：35 ℃；流动相为水和甲醇；流速0.2 mL/min；采用体积分数为15%甲醇洗脱；进样量10μL；
步骤（2）中高分辨质谱条件：可加热点喷雾离子源HESI，阳离子检测模式；鞘气流速：28L/min；辅助气流速：8 L/min；吹扫气流速：0 L/min；喷雾电压：3200 V；毛细管温度：275℃；辅助气加热温度：300 ℃；扫描模式：一级全扫描+数据依赖的二级扫描Full scan+ddms2，母粒子扫描分辨率：70000，最大注入时间：100ms，扫描范围100 m/z～300 m/z，子粒子扫描分辨率：17500，触发阈值：1×105，最大注入时间：50 ms。
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