CN105929069B - 液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱方法以及索氏提取、微波法提取青风藤中生物碱方法 - Google Patents

液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱方法以及索氏提取、微波法提取青风藤中生物碱方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱方法以及索氏提取、微波法提取青风藤中生物碱方法,液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:样品溶液的制备；样品的分析；质谱条件；其中所述的样品溶液为对照品溶液、将青风藤进行索氏提取后所得到的溶液或者将青风藤进行微波提取后所得到的溶液；本发明的优点在于：本发明的色谱条件能够使各生物碱均得到很好的保留；本发明的液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法不仅为青风藤的分析提供了一种新的方法，而且为青风藤中药品质的鉴定和应用提供参考；本发明的微波法提取青风藤中生物碱的方法，提取时间短、节约溶剂、提取高效。

Description

液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱方法以及索氏提取、 微波法提取青风藤中生物碱方法
技术领域
本发明涉及一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱方法以及索氏提取、微波法提取青风藤中生物碱方法。
背景技术
中药一直都是中华民族的瑰宝，而在中药的质量控制、中药对照品的制备、新的活性物质发现等方面，液相色谱都发挥着重要的作用。中药的成分复杂，一种中药可能含有上万个化合物，因此对中药的质量控制等工作也提出了巨大的挑战。液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)是以液相色谱作为分离手段，以质谱作为鉴定工具的一种新型的分离分析技术。中药中化学成分比较复杂，其中某些成分稳定性比较差，因而采用常规的分离检测技术难度较大。在使用HPLC-MS联用技术进行中药化学成分的分析时，不仅可以得到目标物质的保留时间、在线紫外光谱的信息，而且还可以同时得到分子量及特征结构碎片等丰富的信息，因此在这种联用技术在复杂的中药分析、中药质量控制、中药代谢等方面已经得到广泛的应用。
混合样品通过高效液相色谱自动进样系统进样，由于各物质在流动相中的分配系数(K)值不同，在色谱柱中得到分离。从色谱仪中流出的组分依次经过接口进入质谱仪的离子源处并被离子化，然后离子在质量分析器中聚焦，根据各物质的核质比不同而分离，分离后的离子信号被转变为电信号，传送至计算机数据处理系统，根据质谱峰的强度和位置对实际样品中的成分和结构进行分析。
由于中药的体系比较复杂，物质之间分配系数(K)相差可能会很大，在液相的分离过程中需要通过连续改变流动相中溶剂的比例以改变流动相的极性，进而使各目标成分在分离过程中都有合适的K值，达到较短的时间内获得目标物质较好的分离的效果，因此梯度洗脱的优化是复杂体系分离中必不可少的部分。
青风藤作为中药的代表，是一种较为常用的中草药，性平，味苦、辛，归肝、脾经。具有祛风湿、通经络、利小便的功效，主要被应用于风湿痹痛，关节肿胀以及麻痹瘙痒等的治疗。近年来，随着风湿、类风湿病发病率的不断上升，对青风藤的研究逐渐深人，研究表明青风藤中主要成分是生物碱，此外还含有β-谷甾醇、豆甾醇、十六烷酸酯等。文献报道青风藤中的生物碱以青藤碱为主，还含有木兰花碱、绿心树碱、四氢表小檗碱以及异粉防己碱等，目前在对青风藤中生物碱的分析方面，研究较多的方法有薄层色谱扫描法、高效液相色谱法等，但是利用液相色谱质谱联用研究青风藤中生物碱进行分析还不常见，另外生物碱极性大，在色谱柱中不容易保留，需要找合适的方法来使生物碱达到很好的保留效果。在对青风藤中生物碱提取方面的研究中，研究较多的的方法有回流提取法以及超声提取法等，但是这些提取方法的提取效率不够高，提取操作繁琐，耗时。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、准确、快速的液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法以及索氏提取、微波法提取青风藤中生物碱的方法。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：4～8mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件：0-7min：55-45％B；7-25min：45-25％B；25-26min：25-10％B；26-30min：10％B；30-31min：10-55％B；31-35min：55％B；
流速：0.3～0.5mL/min；
柱温：30～35℃；
进样量：5～10μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：6～8L/min，温度为300～350℃；雾化气(N2)压力为35～40psi；毛细管电压：3.0～3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V～-400V；
本发明所述的生物碱主要为青藤碱、木兰花碱、绿心树碱、四氢表小檗碱以及异粉防己碱这5种生物碱
步骤(1)中的样品溶液为对照品溶液，所述的对照品溶液的配制方法如下：将待分析的青风藤中的生物碱标准品溶解在1.00～1.5mL的无水乙醇中，配置成10-3mol/L的母液并置于3～5℃冰箱中保存，分析前用甲醇或高纯水将母液稀释至所需要的浓度。
步骤(1)中的样品溶液为将青风藤进行索氏提取后所得到的溶液，所述的索氏提取的具体方法为：称取过50～70目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用70～80mL的65～75％的乙醇回流提取8～10h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入70～80mL的65～75％的乙醇回流提取5～6h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在90～100℃条件下旋转蒸发2～3h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用60～70％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3～5℃冰箱中保存，分析前，先用高纯水稀释至所需的浓度。
步骤(1)中的样品溶液为将青风藤进行微波提取后所得到的溶液，所述的微波提取的具体方法为：精确称取过50～70目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:30～1:40的65％～75％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为450～550W、提取温度为55～65℃条件下，提取10～20min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于3～5℃冰箱保存，分析前，先用高纯水稀释至所需的浓度。
在HPLC-MS最佳条件的摸索上本发明的发明人进行了以下尝试：
1)色谱柱的选择：本发明的发明人考察了不同长度、内径、填充材料的色谱柱对五种生物碱分离效果的影响，包括：Agilent ZORBAX 300SB-C8(4.6×150mm，5μm)、AgilentZORBAX SB-C18(3.0×150mm，5μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×250mm，5μm)。在使用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×250mm，5μm)型号的色谱柱时，五种生物碱的分离效果最好，因此发明人选用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0×250mm,5μm)。
2)流动相种类及浓度的优化：反相色谱法的流动相极性大于固定相，一般是用甲醇、乙腈或四氢呋喃等极性的有机溶剂与水组成的二元或者多元体系。在二元流动相体系中一般使用水作为基础溶剂，与一定比例的甲醇或乙腈混合而成。发明人尝试了甲醇-水和乙腈水这两种二元流动相，但是绿心树碱和异粉防己碱不能很好的保留。
为了使五种生物碱均达到很好的保留效果，发明人尝试采用了离子抑制色谱法，在反相色谱中通过调节流动相的pH，抑制样品组分的解离，增加样品在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。发明人尝试了甲醇-醋酸铵缓冲溶液与乙腈-醋酸铵缓冲溶液作为流动相，实验结果如图1所示：在用甲醇-醋酸铵缓冲溶液作为流动相时能得到相对较好的分离与响应，同时结果显示流动相中醋酸铵的浓度为5mM时能得到较好的分离与响应，因此本发明采用甲醇-醋酸铵作为流动相，且选择5mM醋酸铵为最佳浓度，其中图1中：A为醋酸铵浓度为15mM时所得的谱图；B为醋酸铵浓度为10mM时所得的谱图；C：为醋酸铵浓度为5mM所得的谱图；实验条件：采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温30℃，进样量10μL，流动相为甲醇(A)-醋酸铵缓冲(B)，流速0.5ml/min，线性梯度洗脱程序见表1，5种生物碱的浓度均为10-4mol/L；另外图1中，峰1为Magnoflorine木兰花碱，峰2为Sinomenine青藤碱，峰3为Curine绿心树碱，峰4为Sinactine四氢表小檗碱，峰5为Isotetrandrine异粉防己碱。
3)梯度洗脱的影响：由于本发明样品中的五种生物碱的性质差异较大，采用等度洗脱时，不能得到所有物质的有效保留，因而尝试采用梯度洗脱以达到满意的效果。发明人尝试了不同比例的甲醇缓冲溶液作为流动相时对五种生物碱分离的影响，在最佳的比例条件下，对比了乙腈-缓冲溶液与甲醇缓冲溶液对物质分离的影响。结果发现在使用甲醇-醋酸铵(5mM)缓冲溶液作为流动相，见表1的线性梯度洗脱程序进行目标物质的分析时，五种物质的分离效果最好，在此分离条件下，最佳色谱图见图2，其中图2中：峰1为Magnoflorine木兰花碱，峰2为Sinomenine青藤碱，峰3为Curine绿心树碱，峰4为Sinactine四氢表小檗碱，峰5为Isotetrandrine异粉防己碱；实验条件：采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温30℃，进样量10μL，流动相为甲醇(A)-5mM醋酸铵缓冲(B)，流速0.5ml/min，线性梯度洗脱程序见表1，5种生物碱的浓度均为10-4mol/L。
表1线性梯度洗脱程序表
4)本发明的发明人还进行了作为流动相的缓冲溶液的pH值的优化：
生物碱的分离与流动相的pH值也有很大的关系。对于弱酸，当流动相的pH值小于它的pKa值时，组分以离子形式存在，容量因子k值变小，保留时间tR减小；反之，当流动相的pH>pKa值时，组分以分子形式存在，容量因子k值变大，保留时间tR增大；因此，调节流动相的pH值可以在较大的范围内改变分离的选择性。由于Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)使用的pH范围为2-7.5之间(pH>8可能使载体硅胶溶解；pH<2可能使键合相的键合基团脱落)，发明人试了各物质在pH为5.5-7.5之间的响应，如图3所示，在图3中，曲线1为Magnoflorine木兰花碱，曲线2为Sinomenine青藤碱，曲线3为Curine绿心树碱，曲线4为Sinactine四氢表小檗碱，曲线5为Isotetrandrine异粉防己碱，实验条件：采用AgilentZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温30℃，进样量10μL，流动相为甲醇(A)-5mM醋酸铵缓冲(B)，流速0.5ml/min，线性梯度洗脱程序见表1，其中5种生物碱的浓度均为10- 4mol/L。
从图3可以看出，在pH值为6.5时，各物质的响应最好。实验中发现使用5mM的醋酸铵(pH＝6.4)也能达到以上的分离效果。为了使操作更加简便，本发明优选采用5mM的醋酸铵与甲醇配合作为流动相。
5)本发明的发明人还对柱温及进样量的影响，最终优选30℃和10μL作为最佳的柱温及进样量，
6)质谱条件的优化：经多次实验后，选择的最佳质谱条件为：离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为35～40psi；毛细管电压：3.0～3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V～-400V；在最佳质谱条件下得到的五种生物碱的离子峰([M+H]+)见图4至图8。
一种索氏提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：称取过50～70目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用70～80mL的65～75％乙醇回流提取8～10h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入70～80mL的65～75％的乙醇回流提取5～6h，提取液冷却后，与第一次提取液合并入蒸发烧瓶中，在90～100℃条件下旋转蒸发2～3h，得到浓缩液。待浓缩液冷却后，用60～70％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3～5℃冰箱中保存。分析前，先用高纯水稀释至所需的浓度，然后用0.22或0.45μm微孔滤膜过滤。
一种微波法提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：精确称取过50～70目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:30～1:40的65％～75％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为450～550W、提取温度为55～65℃条件下，提取时间10～20min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于3～5℃冰箱保存，分析前，先用高纯水稀释至所需的浓度，然后用0.22或0.45μm微孔滤膜过滤，所得的提取液采用HPLC-MS进行定性与定量，数据显示这种工艺下，微波提取10～20min的效果与索氏提取16～24h的效果相当。
微波提取的效率与溶剂、温度、时间、料液比和功率等因素有关。本发明的发明人为了筛选最佳的提取条件，先采用单因素法选择最佳的提取溶剂，然后用正交设计优化时间、温度、功率、料液比微波提取条件，因素及水平见表4。以提取木兰花碱和青藤碱的总含量作为指标，对提取条件进行优化。精确称取青风藤粉末1.0g(过60目样品筛)于150mL的烧瓶中，按照正交试验设计的条件进行提取。冷却后抽滤，得滤液。然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，用高纯水稀释10倍后，用0.22μm微孔滤膜过滤，采用HPLC-MS进行定性与定量，其中色谱条件为：采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm，5μm)色谱柱，柱温为30℃的条件下进样量10μL，以甲醇(A)-5mM醋酸铵缓冲(B)＝55:45(V/V)为流动相，在0.5ml/min的最佳分离流速进行等度洗脱。质谱条件：采用大气压电喷雾离子源，离子阱质量分析器。离子的检测模式为正离子模式；离子扫描的范围为100-700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为40psi；毛细管电压：3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V。经优化得到的最佳提取条件为：提取溶剂为70％乙醇，提取时间15min，温度60℃，料液比为1:35，最佳功率为500W。
表4 MAE条件正交优化表L16(45)
提取溶剂的选择：
在微波提取的过程中，提取溶剂的极性对提取的效果有很大的影响。由于微波是一种能量形式，在其传输过程中可以对提取液中的极性物质产生作用，使提取液中的极性物质瞬间极化，并产生大量的热量。在提取过程中为了保证微波的提取效率和在较低的温度下使目标成分扩散到提取液中，一般使用的提取溶剂不仅要有较小的介电常数，而且溶剂对目标成分要有较大的溶解能力。为了达到最佳的提取效果，发明人对提取溶液的类型进行了选择，如30％的乙醇、50％的乙醇、70％的乙醇、100％的乙醇、水、30％的甲醇、50％的乙甲醇、70％的甲醇、100％的甲醇，发现使用不同的提取溶剂(30％-100％无水乙醇、30％-100％甲醇、水)进行微波提取的效率不同，其中70％的乙醇体取效率最好。
其他微波提取条件优化：
在通常情况下，微波提取效率会随着提取温度的提高而提高，但是在较高的温度下，可能会使会导致目标化合物的分解或者其他种类的化合物被提取出来，降低提取的选择性，因此在微波提取时应选择合适的提取温度。
本发明的发明人选择L16(45)的正交设计表，进行正交试验。表4中对微波的时间、温度、功率、料液比进行了正交设计，以考察这4个因素对微波辅助提取的影响。由于青风藤中药中木兰花碱和青藤碱的含量较高，因此以木兰花碱和青藤碱的总量作为衡量指标，经HPLC测定其提取总量，见表5。
表5 微波提取条件L16(45)正交试验分析结果
为了消除试验中由于掌握不匀所带来的干扰以及外界条件所引起的系统误差，发明人并没有按照表5中的试验顺序进行试验，而是采取随机打乱的办法完成了表5中所有的组合。
表5中，Kij＝第j列上水平号为i的各因素试验之和。kij＝Kij/s，其中s为第j列上水平号i出现的次数，在本实验中数值为4。kij表示第j列上的因素取水平i时，进行试验所得的试验结果的平均值。
Rj为第j列的极差或者其所在因素的极差Rj＝max{kij}-min{kij}。一般来说各列的极差是不一样的，这也就表明各因素的水平改变对实验的结果影响不同。极差越大，说明这个因素的水平改变对试验的影响越大。极差最大的那一列的因素也就是最主要的因素。从表5中可以看出：R3>R1>R2>R4，即因素主次顺序为：温度>时间>功率>料液比。
空白列的极差体现的是除温度、时间、功率和料液比之外的其他因素对试验的影响。如果空白列的极差比其他列都要高就说明因素之间存在不可忽视的交互作用或者其他对实验有重要影响的因素。在本实验中空白列的极差值比较小，说明所选因素合适。在实验中，因素水平对应的指标越大越好，因此本试验的最佳方案为：微波时间15min，功率500W，提取温度为60℃，料液比为1:35。在最佳的微波提取条件下，经高效液相色谱测定木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.46mg/g、6.52mg/g。本试验的因素与指标的关系见图9，图9中，正交试验A、B、C、D各因素及水平见表4。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：因为生物碱的极性大，在色谱柱中不容易保留，利用本发明的色谱条件能够使各生物碱均得到很好的保留。另外，该液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，利用梯度洗脱，缩短了分析时间。青藤碱、木兰花碱、绿心树碱、四氢表小檗碱以及异粉防己碱在30min内完全分离，本发明的液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法不仅为青风藤的分析提供了一种新的方法，而且为青风藤中药品质的鉴定和应用提供参考；本发明的微波法提取青风藤中生物碱的方法，提取时间短、节约溶剂、提取高效。
附图说明
图1是本发明进行流动相种类及浓度的优化时所得的谱图。
图2是本发明探究梯度洗脱程序时所得的谱图。
图3是本发明进行作为流动相的缓冲溶液的pH值优化时所得的谱图。
图4是木兰花碱的离子峰。
图5是青藤碱的离子峰。
图6是绿心树碱的离子峰。
图7是四氢表小檗碱的离子峰。
图8是异粉防己碱的离子峰。
图9是本发明进行微波提取条件优化时正交试验因素与指标的关系图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例一：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为对照品溶液，对照品溶液的配制方法如下：分别将适量的五种生物碱标准品溶解在1.50mL的无水乙醇中，配置成10-3mol/L的母液并置于5℃冰箱中保存；分析前，取一定量的各种母液，用甲醇将各母液分别稀释至8.0×10-5mol/L，然后混合这5种稀释后的溶液得5种生物碱的标准混合液，5种生物碱的标准混合液采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：4mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样量：5μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：6L/min，温度为300℃；雾化气(N2)压力为35psi；毛细管电压：3.0KV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-400V。
实施例二：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为对照品溶液，对照品溶液的配制方法如下：分别将适量的五种生物碱标准品溶解在1.00mL的无水乙醇中，配置成10-3mol/L的母液并置于4℃冰箱中保存；分析前，取一定量的各种母液，用甲醇将各母液分别稀释至10-4mol/L，然后混合这5种稀释后的溶液得5种生物碱的标准混合液；5种生物碱的标准混合液采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为40psi；毛细管电压：3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V。
实施例三：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为对照品溶液，对照品溶液的配制方法如下：分别将适量的五种生物碱标准品溶解在1.25mL的无水乙醇中，配置成10-3mol/L的母液并置于3℃冰箱中保存；分析前，取一定量的各种母液，用甲醇将各母液分别稀释至1.2×10-4mol/L，然后混合这5种稀释后的溶液得5种生物碱的标准混合液，5种生物碱的标准混合液采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：8mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.4mL/min；
柱温：32℃；
进样量：8μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：7L/min，温度为320℃；雾化气(N2)压力为38psi；毛细管电压：3.3kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-450V。
在实施例一至实施例三中，其中实施例二的实验条件为最优条件，因此，本发明的发明人将实施例二中的5种生物碱的标准混合液重复进样5次，并连续5天对这一浓度的样品进行分离，考察检测方法的重现性。测得迁移时间和峰面积的日内相对标准偏差(RSD)和日间RSD详细结果见表2。
表2迁移时间和峰面积的重现性实验(n＝5)
实施例四：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行索氏提取后所得到的溶液，所述的索氏提取的具体方法为：称取过70目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用70mL的65％的乙醇回流提取10h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入70mL的65％的乙醇回流提取6h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在100℃条件下旋转蒸发2h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用70％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于5℃冰箱中保存；分析前，取青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：4mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样量：5μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：6L/min，温度为300℃；雾化气(N2)压力为35psi；毛细管电压：3.0kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-400V。
实施例五：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行索氏提取后所得到的溶液，所述的索氏提取的具体方法为：称取过60目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用80mL的70％的乙醇回流提取8h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入80mL的70％的乙醇回流提取5h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在90℃条件下旋转蒸发3h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用60％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于4℃冰箱中保存；分析前，取青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为40psi；毛细管电压：3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V。
实施例六：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行索氏提取后所得到的溶液，所述的索氏提取的具体方法为：称取过50目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用75mL的75％的乙醇回流提取9h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入75mL的75％的乙醇回流提取5.5h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在95℃条件下旋转蒸发2.5h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用65％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3℃冰箱中保存；分析前，取青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：8mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.4mL/min；
柱温：32℃；
进样量：8μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：7L/min，温度为320℃；雾化气(N2)压力为38psi；毛细管电压：3.3kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-450V。
在实施例四至实施例六中，实施例五的实验条件为最优实验条件，发明人利用实施例五的索氏提取条件，对青风藤进行三次平行索氏提取，并分别测定所得的提取液中的木兰花碱和青藤碱的含量，同时测得三次平行实验的相对标准偏差(RSD)在1.0-3.8％之间，详细见表3。
表3木兰花碱和青藤碱的测定结果和相对标准偏差
实施例七：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行微波提取后所得到的溶液，所述的微波提取的具体方法为：精确称取过50目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:30的65％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为450W、提取温度为55℃条件下，提取10min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于3℃冰箱保存。分析前，取青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：4mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.3mL/min；
柱温：35℃；
进样量：5μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：6L/min，温度为300℃；雾化气(N2)压力为35psi；毛细管电压：3.0kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-400V。
实施例八：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行微波提取后所得到的溶液，所述的微波提取的具体方法为：精确称取过60目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:35的70％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为500W、提取温度为60℃条件下，提取15min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。分析前，取青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为40psi；毛细管电压：3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V。
实施例九：
一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，它包括以下步骤:
(1)样品溶液的制备:所述的样品溶液为将青风藤进行微波提取后所得到的溶液，所述的微波提取的具体方法为：精确称取过70目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:40的75％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为550W、提取温度为65℃条件下，提取20min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于5℃冰箱保存。分析前，取青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，过滤之后采用HPLC-MS进行定性与定量分析；
(2)样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：8mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.4mL/min；
柱温：32℃；
进样量：8μL；
(3)质谱条件：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：7L/min，温度为320℃；雾化气(N2)压力为38psi；毛细管电压：3.3kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-450V。
在实施例七至实施例九中，其中实施例八的实验条件为最优实验条件，在实施例八的最佳实验条件下，测定了微波提取青风藤中木兰花碱和青藤碱的含量，实验测得木兰花碱、青藤碱的含量分别为：3.46mg/g、6.52mg/g。
实施例十：
一种索氏提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：称取过70目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用70mL的65％的乙醇回流提取10h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入70mL的65％的乙醇回流提取6h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在100℃条件下旋转蒸发2h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用70％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于5℃冰箱中保存。将所得的青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，得索氏提取液中木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.01mg/g、5.98mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
实施例十一：
一种索氏提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：称取过60目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用80mL的70％的乙醇回流提取8h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入80mL的70％的乙醇回流提取5h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在90℃条件下旋转蒸发3h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用60％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于4℃冰箱中保存。将所得的青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，测得木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.19mg/g、6.15mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
实施例十二：
一种索氏提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：称取过50目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用75mL的75％的乙醇回流提取9h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入75mL的75％的乙醇回流提取5.5h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在95℃条件下旋转蒸发2.5h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用65％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3℃冰箱中保存。将所得的青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，测得木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.08mg/g、6.05mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
实施例十三：
一种微波法提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：精确称取过50目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:30的65％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为450W、提取温度为55℃条件下，提取10min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于3℃冰箱保存。将所得的青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，测得木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.35mg/g、6.21mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
实施例十四：
一种微波法提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：精确称取过60目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:35的70％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为500W、提取温度为60℃条件下，提取15min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。将所得的青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，测得木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.46mg/g、6.52mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL。
实施例十五：
一种微波法提取青风藤中生物碱的方法，它包括以下工艺步骤：精确称取过70目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:40的75％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为550W、提取温度为65℃条件下，提取20min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于5℃冰箱保存。将所得的青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经高效液相色谱测定，测得木兰花碱和青藤碱的含量分别为：3.40mg/g、6.33mg/g，其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
实施例十六：索氏提取与微波提取提取效率对比试验：
为了对比索氏提取与微波提取的提取效率，发明人做了实施例十一的平行试验以及实施例十四的平行试验，并对所得索氏提取液以及微波提取液进行HPLC-MS测定，测定结果见表6。具体操作如下：
称取过60目筛的青风藤中药粉末1.0g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用80mL的70％的乙醇回流提取8h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入80mL的70％的乙醇回流提取5h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在90℃条件下旋转蒸发3h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用60％的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于4℃冰箱中保存。将所得的青风藤索氏提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经HPLC-MS测定；
精确称取过60目筛的青风藤粉末1.0g置于150mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:35的70％的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为500W、提取温度为60℃条件下，提取时间15min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于4℃冰箱保存。将所得的青风藤微波提取液，先用高纯水稀释10倍后，用0.22μm的有机微孔滤膜对其进行过滤，再经HPLC-MS测定；
其中色谱条件为：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18(3.0mm×250mm,5μm)；
流动相为：A相：甲醇、B相：5mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件见表1：
表1线性梯度洗脱程序表
流速：流速0.5mL/min；
柱温：30℃；
进样量：10μL；
质谱条件为：
离子源：电喷雾电离源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100～700m/z；干燥气(N2)流速：8L/min，温度为350℃；雾化气(N2)压力为40psi；毛细管电压：3.5kV；毛细管出口电压：100V；终板偏置电压：-500V。
表6索氏提取与微波提取提取效率对比
从表中的数据可知微波提取15min的效果与16h的索氏提取的效果相当，而且索氏提取得重复两次提取(残渣得重新提取一遍)，可见微波提取比索氏提取更加快速、高效，另外，微波提取还具有溶剂用量少、操作便捷的优点。

Claims (1)

1.一种液相色谱质谱联用测定青风藤中生物碱的方法，其特征在于：它包括以下步骤:
（1）样品溶液的制备；
（2）样品的分析：
色谱条件：
色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18 ，3.0mm×250mm, 5μm；
流动相为：A相：甲醇、B相：4~8 mM醋酸铵水溶液；
梯度洗脱条件：0-7min ：55-45％ B ；7-25min ：45-25％ B ；25-26min ：25-10％ B ；26-30min ：10％ B ；30-31min ：10-55％ B ；31-35min ：55％ B ；
流速：流速0.3~0.5 mL/min；
柱温：30 ~35℃；
进样量：5~10 μL；
（3）质谱条件：
离子源：电喷雾电离源ESI；扫描方式：正离子扫描；离子扫描的范围为100~700 m/z；干燥气N2流速：6-8 L/min，温度为300~350 ℃；雾化气N2压力为35~40 psi；毛细管电压： 3.0~3.5 kV；毛细管出口电压：100 V；终板偏置电压： -500 V~-400 V；
其中，步骤（1）中的样品溶液为对照品溶液，所述的对照品溶液的配制方法如下：将待分析的青风藤中的生物碱标准品溶解在1.00~1.5 mL的无水乙醇中，配置成10-3 mol/L的母液并置于3~5℃冰箱中保存；
或者步骤（1）中的样品溶液为待测品溶液；
所述待测品溶液的制备方法具体为：称取过50~70目筛的青风藤中药粉末1.0 g，装于滤纸筒中，将开口端折叠封住，放于索氏提取筒中，用70~80 mL的65~75%的乙醇回流提取8~10 h，冷却后将提取液倾倒入旋转蒸发烧瓶中，残渣中加入70~80 mL的65~75%的乙醇回流提取5~6 h，提取液冷却后，与第一次提取液合并加入蒸发烧瓶中，在90~100℃条件下旋转蒸发2-3 h，得到浓缩液，待浓缩液冷却后，用60~70%的无水乙醇溶液于25mL容量瓶中定容，放于3~5℃冰箱中保存；
所述待测品溶液的制备方法或者具体为：精确称取过50~70目筛的青风藤粉末1.0 g置于150 mL的烧瓶中，往烧瓶中加入料液比为1:30~1:40的65%~75%的乙醇溶液，得青风藤乙醇溶液，将青风藤乙醇溶液在微波功率为450~550W、提取温度为55~65℃条件下，提取10~20min，冷却后用真空抽滤泵抽滤，得滤液，弃去药渣，然后将滤液转移至25mL容量瓶中定容，于3~5℃冰箱保存。
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