CN115308327B - 定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法及检测试剂盒 - Google Patents

定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法及检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法及检测试剂盒，使用甲硝唑作为检测物去甲青藤碱的内标(IS)，NaOH调节血浆pH值后，使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样品进行预处理，建立LC‑MS/MS方法定量检测血浆中去甲青藤碱浓度，液相色谱采用AgilentEclipseXDB‑C18柱为固定相，乙腈/乙酸铵缓冲液为流动相，75/25(V/V)等度洗脱，质谱采用电喷雾离子源(ESI)，使用多离子反应监测(MRM)对去甲青藤碱进行定量。去甲青藤碱的最低定量限可达3ng/mL。本发明方法对样品检测的专一性强，灵敏度高，操作简便，各项方法学考证指标均能达到美国FDA的相关技术要求。

Description

定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法及检测试剂盒
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及血浆中去甲青藤碱的液质联用(高效液相色谱串联质谱技术)定量检测方法的建立及方法验证。
背景技术
中药青风藤为防己科植物青藤Sinomenium acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.及毛青藤S.acutum(Thunb.)Rehd.et Wils.var.cinereum Rehd.et Wils.的干燥根茎，最初记载于《本草纲目》：“治风湿流注，历节鹤膝，麻痹瘙痒，损伤疮肿。入药酒中用”。中医将青风藤用于风湿性疾病已有上千年历史。青风藤的主要活性化学成分是青藤碱，具有免疫抑制、抗炎和镇痛等药理作用。对青藤碱进行体内代谢研究，发现一种与青藤碱中药同源，且具有生物活性的主要代谢物——去甲青藤碱。去甲青藤碱分子式为C18H21NO4，分子量为315，化学结构式为：
本实验室在前人基础上改良化学合成了去甲青藤碱单体，经实验证实此化合物纯度＞99％，在术后痛和神经病理性疼痛动物模型中都有良好的镇痛作用，证实去甲青藤碱将是一个非常有前景的吗啡烷类镇痛药物。
目前，去甲青藤碱还处于临床前期研究阶段，缺乏其药物代谢动力学研究，而建立生物样本中去甲青藤碱的定量检测方法是其药物代谢动力学研究前提。而目前并没有关于去甲青藤碱的定量方法，因此急需建立可靠、灵敏的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定血浆中去甲青藤碱的浓度的方法，为去甲青藤碱的药物代谢动力学的研究提供技术支持。
发明内容
本发明是为解决上述问题而进行的，目的在于建立高效液相色谱串联质谱技术检测大鼠血浆中去甲青藤碱的浓度，为去甲青藤碱的药物代谢动力学的研究提供基础。
本发明的第一方面，提供了一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法，采用超高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：使用甲硝唑作为检测物去甲青藤碱的内标，使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样品进行预处理后，建立LC-MS/MS方法定量检测血浆中去甲青藤碱浓度。
其中，液相色谱采用4.6×12.5mm、5μmAgilent Eclipse XDB-C18柱偶联4.6×150mm、5μmAngilent Eclipse XDB-C18柱为固定相，乙腈/乙酸铵缓冲液为流动相，以体积比75/25进行等梯度洗脱；质谱采用正离子电喷雾电离源模式，使用多离子反应监测对去甲青藤碱进行定量，离子选择通道Q1、Q3，去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239。
通过实验验证，本发明方法对去甲青藤碱的定量范围为3-1000ng/mL，最低检出限为3ng/mL。
具体检测操作步骤如下：
(1)血浆样品预处理：向体积为v的血样样本中加入300ng/mL、体积为1\10v的内标工作液，立即涡旋30s；然后加入体积为1\10v的1M NaOH溶液，涡旋1min；接着将10000v乙酸乙酯分两次加入，分别涡旋8min，10000转/分离心10分钟，合并上清，30℃水浴下氮吹至吹干，1.1v 75％乙腈复溶，进行LC-MS/MS分析。
(2)内标甲硝唑溶液的配置：用色谱级甲醇配制成1mg/mL浓度的甲硝唑溶液，-20℃保存；使用时用甲醇稀释成浓度为300ng/mL的工作液，4℃保存待用。
(3)色谱分析条件
色谱柱：采用Agilent Eclipse XDB-C18(5μm,4.6×12.5mm)偶联AgilentEclipse XDB-C18(5μm,4.6×150mm)；
流动相：流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液，流动相B为乙腈；流动相体积比例：A:B＝25:75；
洗脱条件：流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：2μL，典型保留时间：去甲青藤碱:4.5min；内标:4.8min。
(4)质谱分析
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多离子反应监测的质谱扫描模式；气帘气压力，40psi；雾化气压力，50psi；辅助加热气压力，50psi；喷雾电压，4000V；温度，
350℃；气体均为N2；
去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239，去簇电压160V，碰撞电压27V，出场电压12V；内标甲硝唑[M+H]+m/z 172/128，去簇电压103V，碰撞电压19V，出场电压9V；离子通道范围均为±1.0amu。
(5)浓度检测方法和检测限：
按内标法以峰面积计算血中去甲青藤碱的含量。本发明最低定量限为3ng/mL。定量范围为3-1000ng/mL，线性相关系数在0.995以上。定量下限精密度小于20％，其余质控日内、日间精密度均小于15％，准确度85％-115％之间，稳定性良好。
本发明的第二方面，提供了一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的试剂盒，包括洗脱液、对照品母液、质控液、稀释液。检测时直接采用这些溶液进行检测操作即可。
其中，洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，分别作为高效液相色谱的流动相A和流动相B，流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液，流动相B为乙腈；
对照品母液为用色谱级甲醇精密配制的去甲青藤碱储备液，浓度为1mg/mL，用时用甲醇稀释成不同浓度的去甲青藤碱标准工作液；
质控液为浓度为3、6、60、800ng/mL的去甲青藤碱标准工作液；
稀释液为色谱级甲醇。
本发明的有益保障及效果如下：
本发明根据去甲青藤碱以及内标甲硝唑的物理性质，进行样品处理、色谱分离和质谱检测，建立了相对经济、高效的大鼠血浆中去甲青藤碱提取方法，具有如下技术优势：
(1)血浆样本预处理方面：本方法采用乙酸乙酯液液萃取法，使用乙酸乙酯作为萃取剂，取上清氮吹后，75％乙腈复溶进行样本预处理。相对甲醇和乙腈沉淀蛋白方法来说，本发明方法内源性物质产生的基质干扰最小，同时相对于采用C18固相萃取小柱，其回收率高，操作简单，经济，且灵敏度高，满足方法学验证。
(2)内标选择方面，本发明使用甲硝唑为内标，按内标法以峰面积计算血中去甲青藤碱的含量。经过验证，本发明最低定量限为3ng/mL，定量范围为3-1000ng/mL，线性相关系数在0.995以上；定量下限精密度小于20％，其余质控日内、日间精密度均小于15％，准确度85％-115％之间，稳定性良好。
(3)方法精准度方面：本发明方法对样品检测的专一性强，灵敏度高，操作简便，各项方法学考证指标均能达到美国FDA的相关技术要求。用建立的LC-MS/MS方法测定大鼠单次口服去甲青藤碱不同浓度后不同时间点的血药浓度，得到去甲青藤碱的药动学参数。
附图说明
图1是去甲青藤碱与内标甲硝唑的化学结构以及其二级子离子质谱图(MS2模式)：其中，(A)是去甲青藤碱的化学结构及其在MS2模式下的二级子离子质谱图，说明去甲青藤碱在本方法质谱参数条件下其子离子239的丰度最高，所以选择检测通道MRM为m/z316/239；(B)是内标甲硝唑的化学结构及其二级子离子质谱图，可以由图判断选择其MRM为m/z172/128。
图2是应用本发明LC-MS/MS方法检测血样中去甲青藤碱的典型色谱图：其中(A)是空白血浆的色谱图，MRM 316/239通道为去甲青藤碱，MRM 172/128通道为内标甲硝唑；(B)是加入定量下限(LLOQ)的去甲青藤碱和甲硝唑的模拟血浆样品的色谱图，可见去甲青藤碱出峰时间为4.5min，而内标出峰时间为4.8min；(C)大鼠单次灌胃20mg/kg去甲青藤碱，给药后5min眼眶采集血样的色谱图。
图3是应用建立的LC-MS/MS方法测定大鼠单次口服给药去甲青藤碱10mg/kg、20mg/kg和40mg/kg后不同时间点血药浓度，得到平均血药浓度-时间曲线图。
具体实施方式
为了更加清楚的说明本发明，下面结合实施例来对本发明进行进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。
实施例1：检测条件和方法
1、试剂配制：
(1)标准曲线：用色谱级甲醇精密配制去甲青藤碱储备液，浓度为1mg/mL，然后用甲醇稀释成不同浓度的去甲青藤碱标准工作液。分别取各浓度的去甲青藤碱标准工作液10μL，加入90μL的空白血浆，分别配制成浓度为3，10，30，100，300，1000ng/mL的标准曲线溶液，共6个浓度点。
(2)质控(QC)样品：取适当浓度的去甲青藤碱标准工作液10μL，加入90μL的空白血浆，配制成浓度为3，6，60，800ng/mL的去甲青藤碱为质控样品。
(3)内标：甲硝唑(metronidazole)用色谱级甲醇配制成1mg/mL的浓度，-20℃保存。并用甲醇稀释成浓度为300ng/mL的工作液，4℃保存待用。
(4)流动相：流动相A为水相，即含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液。精密称取0.77g的色谱级乙酸铵，然后用纯化水溶解，最后定容至1000mL，即为10mM的乙酸铵溶液，再加入3.5mL的乙酸，然后0.22μM微孔滤膜过滤，即得流动相A，流动相B为色谱级乙腈。色谱分离时，按照流动相A:B＝25:75(V/V)进行等度洗脱。
2、血样采集：
利用肝素抗凝的毛细管从大鼠眼眶后静脉丛采集500μL血液于EDTA2K抗凝的1.5mL离心管，然后4000转/分离心10分钟，精密移取上清血浆，-20℃保存。
3、样品预处理：
取100μL的血样(标准曲线血样、质控血样或者给药后血样)，加入10μL的内标工作液(300ng/mL)，立即涡旋30s，然后加入10μL的1M NaOH溶液，涡旋1min，接着1000mL乙酸乙酯分两次加入，分别涡旋8min，10000转/分离心10分钟，合并上清，30℃水浴下氮吹至吹干，110μL 75％乙腈复溶，进行LC-MS/MS分析。
4、LC-MS/MS测定条件
(1)色谱条件
色谱仪：Agilent 1290
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 column(5μm,4.6×150mm)+Agilent EclipseXDB-C18(5μm,4.6×12.5mm)
流动相：流动相A：含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液
流动相B：乙腈
流动相比例：A:B＝25:75(V/V)
流速：0.3mL/min
柱温：30℃
进样量：2μL
典型保留时间：去甲青藤碱:4.5min；内标:4.8min
(2)质谱条件：
仪器：AB Qtrp5500
离子源：电喷雾离子源(ESI)
扫描方式：正离子MRM扫描
离子源参数：离子源:电喷雾(ESI)；气帘气(CUR):40psi；雾化气(GS1):50psi；辅助加热气(GS2):50psi；喷雾电压(Ion spray voltage):4000V；温度(Temperature):350℃；气体均为N2，其余条件见下表1。去甲青藤碱及内标甲硝唑的色谱图参见图1；不同样本(空白血浆、模拟血浆样品、大鼠单次灌胃20mg/kg去甲青藤碱)的色谱结果参见图2。
表1去甲青藤碱及甲硝唑质谱分析条件
5、计算方法
按内标法以峰面积计算血浆中去甲青藤碱的含量。
6、结果
检测去甲青藤碱的方法学包括选择性与特异性、线性及定量下限、精密度与准确度、萃取回收率与基质效应、稳定性，结果均符合规定。
实施例2、方法学验证
采用实施例1所列的检测条件和方法，对测定方法进行了方法学的验证。在3-1000ng/mL去甲青藤碱浓度范围内，线性关系良好(r>0.995)，定量下限为3ng/mL。定量下限精密度小于20％，其余质控日内、日间精密度均小于15％，准确度为-7.92～9.93％，去甲青藤碱提取回收率为73.55～81.88％，RSD<15％，内标提取回收率为94.19％，RSD为2.38％，去甲青藤碱基质效应92.95～103.96％，内标基质效应为89.73％，稳定性良好。
方法学验证结果表明已建立的LC-MS/MS能快速、灵敏、准确可靠的大批量检测大鼠给予去甲青藤碱后血药浓度的检测，具体分析如下：
1、特异性以及灵敏度：
参见图2，通过对来自六只不同大鼠空白血浆与定量下限质控(LLOQ)的血样的LC-MS/MS色谱图进行比较分析，在去甲青藤碱和内标的保留时间处，空白血浆中未观察到内源性干扰峰，说明此方法特异性和选择性高，灵敏度高，LLOQ可达3ng/mL。
2、标准曲线和定量范围
按实施例1配制方法配制标准曲线，标准曲线方程为y＝0.00827x-0.00652(r＝0.99955)(weighting:1/x)，准确度为96.88-104.58％，精密度为2.07～9.86％，详见表2：
表2标准曲线精密度及准确度结果
3、准确度与精密度
按实例1配制4个浓度的质控血样(3，6，60，800ng/mL)，每个浓度5个复管，同一天内按上述血样处理方法以及色谱串联质谱条件进行检测，得到日内精密度与准确度，同时连续测定3天，得到日间精密度与准确度。日内、日间准确度在-7.92～9.93％之间，精密度均控制在15％以内，结果见表3：
表3日内及日间精密度与准确度
4、稳定性实验
按实例1配制3个浓度的质控血样(6，60，800ng/mL)，分别在4种条件下进行稳定性考察，每种条件下每个浓度都要做5份，稳定性条件分别为自动进样器24h稳定性，短期6h稳定性，长期30天稳定性以及反复冻融3次稳定性。结果详见表4，结果说明去甲青藤碱在上述的四种条件下均是稳定的。
表4稳定性实验结果
5、提取回收率以及基质效应
按实例1配制3个浓度的质控血样(6，60，800ng/mL)，每个浓度准备5份。第1套质控样品即按照实例1方法进行配制，然后进行血样处理；第2套质控样品则是将空白血浆用1MNaOH和乙酸乙酯处理后，取上清氮吹，90μL75％乙腈水复溶后，加入相应的去甲青藤碱标准工作液以及内标工作液；第3套质控样品则是将90μL75％乙腈水溶液加入相应浓度的去甲青藤碱标准品，然后加入内标。
第1套样品所检测得到平均峰面积与第2套样品相比即得到提取回收率，第2套样品平均峰面积与第3套样品相比即得到基质效应，具体结果见表5。结果显示去甲青藤碱低、中、高三个浓度质控的平均回收率为73.55～81.88％，其变异系数即精密度为2.41～7.59％，基质效应为92.95～103.96％，精密度为2.68～10.99；内标回收率为94.19％，基质效应为89.73％。结果说明该处理方法提取回收率和基质效应均能满足要求。
表5提取回收率以及基质效应结果汇总
实施例3动物模型实验
大鼠口服去甲青藤碱后不同时间血药浓度的检测以及药代动力学参数计算。取18只SD大鼠(220～250g)，雌雄参半，按照10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg灌胃给药，然后于给药前和给药后0.083、0.167、0.333、0.75、1、2、3、4、6、8、12和24h眼眶取血于EDTA2K抗凝离心管内，离心后得到血浆，然后按实施例1的方法，测定血样中去甲青藤碱浓度，结果参见图3，并应用PKsolver软件使用统计矩法计算其药动学参数，具体结果参见表6。
表6大鼠动物模型药动学结果
表中，Cmax表示达峰浓度；Tmax表示达峰时间；AUC(0-t)表示0时刻到采样结束时间点血药浓度-时间曲线下面积；AUC(0-∞)表示0时刻到无穷大时间血药浓度-时间曲线下面积；MRT表示药物平均滞留时间；t1/2z表示半衰期；CLz/F表示清除率与生物利用度比值。
根据其半衰期约4h，我们测定了给药后24h的样品浓度(均高于LLOQ)，满足4个半衰期的时间，符合要求。因此，本文所建立的LC-MS/MS方法可以灵敏、准确、可靠的检测血样中去甲青藤碱的浓度，并成功应用于去甲青藤碱口服给药后药代动力学的研究。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法，其特征在于，采用高效液相色谱-串联质谱进行检测，包括以下步骤：使用甲硝唑作为检测物去甲青藤碱的内标，使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样品进行预处理后，建立LC-MS/MS方法定量检测血浆中去甲青藤碱浓度，
其中，使用乙酸乙酯液液萃取法对血浆样品进行预处理的方法如下：向体积为v的血样样本中加入300ng/mL、体积为1\10v的内标工作液，立即涡旋30s；然后加入体积为1\10v的1M NaOH溶液，涡旋1min；接着将10000v乙酸乙酯分两次加入，分别涡旋8min，10000转/分离心10分钟，合并上清，30℃水浴下氮吹至吹干，1.1v 75％乙腈复溶，进行LC-MS/MS分析，
液相色谱采用4.6×12.5mm、5μm Agilent Eclipse XDB-C18柱偶联4.6×150mm、5μmAngilent Eclipse XDB-C18柱为固定相；进行色谱分析时，流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液，流动相B为乙腈；流动相体积比例：A:B＝25:75；洗脱时，流速：0.3mL/min，柱温：30℃，进样量：2μL，典型保留时间：去甲青藤碱:4.5min；内标:4.8min，
质谱采用正离子电喷雾电离源模式，使用多离子反应监测对去甲青藤碱进行定量，离子选择通道Q1、Q3，去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239。
2.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法，其特征在于：
其中，内标甲硝唑溶液的配置方法如下：用色谱级甲醇配制成1mg/mL浓度的甲硝唑溶液，-20℃保存；使用时用甲醇稀释成浓度为300ng/mL的工作液，4℃保存待用。
3.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法，其特征在于：
其中，进行质谱分析时，在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多离子反应监测的质谱扫描模式；气帘气压力，40psi；雾化气压力，50psi；辅助加热气压力，50
psi；喷雾电压，4000V；温度，350℃；气体均为N2；
去甲青藤碱[M+H]+m/z 316/239，去簇电压160V，碰撞电压27V，出场电压12V；内标甲硝唑[M+H]+m/z 172/128，去簇电压103V，碰撞电压19V，出场电压9V；离子通道范围均为±1.0amu。
4.根据权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度的方法，其特征在于：
其中，去甲青藤碱的定量范围为3-1000ng/mL。
5.一种适用于权利要求1所述的定量检测血浆中去甲青藤碱浓度方法的检测试剂盒，其特征在于，包括洗脱液、对照品母液、质控液、稀释液。
6.根据权利要求5所述的适用于定量检测血浆中去甲青藤碱浓度方法的检测试剂盒，其特征在于：
其中，所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，分别作为高效液相色谱的流动相A和流动相B，流动相A为含10mM的乙酸铵以及0.35％乙酸的水溶液，流动相B为乙腈；
所述对照品母液为用色谱级甲醇精密配制的去甲青藤碱储备液，浓度为1mg/mL，用时用甲醇稀释成不同浓度的去甲青藤碱标准工作液；
所述质控液为浓度为3，6，60，800ng/mL的去甲青藤碱标准工作液；
所述稀释液为色谱级甲醇。
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