CN116297974A - 一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物megx和沙丁胺醇浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法，涉及分析检测技术领域。本发明将待测血浆样品、乙腈与内标物混合进行前处理，得到待测进样液；将所述待测进样液进行液相色谱‑串联质谱检测，得到待测血浆样品中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的浓度。本发明提供的方法前处理过程简单、分析通量高，采用液相色谱‑串联质谱检测方法首次实现了血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的同时检测；并且本发明提供的方法精密度好、准确度高，基质效应、回收率、稳定性、稀释线性等指标满足生物样品定量分析的要求，能够支持沙丁胺醇和利多卡因复方制剂或两者联合应用的临床前及临床药代动力学研究。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法。
背景技术
沙丁胺醇是临床上广泛应用的支气管扩张剂的平喘药，具有强大的平滑肌松弛特性，能有效地抑制组胺等致过敏性物质的释放、防止支气管痉挛，用于治疗反应性气道疾病，如哮喘和慢性阻塞性肺病。临床常用的途径和剂量包括雾化剂量0.2～0.8mg，口服剂量2～4mg。利多卡因是酰胺类局麻药和抗心律失常药，主要用于局麻、急性心梗和室性心动过速治疗。临床常用剂量和途径为静注、浸润麻醉，剂量为50～300mg。
近年来在临床治疗中、重度哮喘以及气管镜检查中反射性支气管收缩时发现，将沙丁胺醇和利多卡因联合雾化吸入较单纯用沙丁胺醇效果好，明显改善肺功能。但是，这些研究报道都属于超标签使用。众所周知，利多卡因体内广泛代谢转化，并且药物原型具有浓度依赖的心脏毒性和神经系统毒性，血药浓度的有效安全窗为1.4～6μg/mL以内。沙丁胺醇与利多卡因联合应用时是否存在相互作用，剂量-浓度关系如何，药物的体内分布是否有改变等问题需要开展系统的药代动力学研究来回答。
药代动力学研究首先需要建立稳健的血药浓度定量检测方法。已有现有技术单独检测利多卡因及其代谢物，或单独检测沙丁胺醇，而目前尚无同时检测利多卡因及其代谢物和沙丁胺醇血药浓度的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法。本发明实现了血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的同时检测。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法，包括以下步骤：
将待测血浆样品、乙腈与内标物混合进行前处理，得到待测进样液；所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1～1.5：4～6；
将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到色谱图，将色谱图中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比代入相应预定的校准曲线中，计算得到待测血浆样品中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的浓度；所述校准曲线分别为利多卡因的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中利多卡因浓度的关系曲线、MEGX的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中MEGX浓度的关系曲线、沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中沙丁胺醇浓度的关系曲线；
所述液相色谱-串联质谱检测中液相色谱条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸-水溶液、流动相B为甲酸-乙腈溶液，流动相A和流动相B中甲酸的体积百分含量为0.1％；流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序：0.0～0.3min，流动相B体积分数为1％；0.3～2.5min，流动相B体积分数由1％变化至90％；2.5～2.8min，流动相B体积分数为90％；2.8～3.0min，流动相B体积分数由90％变化至1％；3.0～4.0min，流动相B体积分数为1％；流动相体系流速：0.6mL/min；
所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件包括：利多卡因定量离子对为235.30/86.20，CE为21V，Q1为21V，Q3为18V；沙丁胺醇定量离子对为240.30/148.15，CE为20V，Q1为11V，Q3为29V；MEGX定量离子对为207.30/58.15，CE为15V，Q1为19V，Q3为11V；内标物定量离子对为241.35/86.20，CE为22V，Q1为22V，Q3为17V。
优选地，所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1～1.2：4～5。
优选地，所述内标物为2H6-盐酸利多卡因。
优选地，所述乙腈与内标物的用量比为1mL：1ng。
优选地，所述前处理包括将所述混合得到的混合物依次进行涡旋和离心，上清液作为待测进样液。
优选地，所述涡旋的时间为1～2min；所述离心的速度为10000～15000rpm，时间为10～15min。
优选地，所述液相色谱-串联质谱检测中采用的色谱柱为Phenomenex C18column，尺寸规格3.0mm×50mm，2.6μm；柱温为40℃。
优选地，所述液相色谱-串联质谱检测的进样量为5μL。
优选地，所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件还包括：
离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应检测模式；扫描方式为正离子扫描模式；干燥气流速为10L/min，加热气流速为10L/min，碰撞气压力为270kPa，离子源温度300℃，脱溶剂管温度526℃，加热模块温度400℃。
本发明提供了一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法，本发明以乙腈作为前处理试剂，并控制乙腈的加入量，对样品进行蛋白沉淀，过程简单，而且能够提高蛋白沉淀效率，降低基质效应，从而提高分析通量，并且前处理过程简单；本发明通过优化质谱条件中Q1、Q3和CE等几个主要参数，尽量提高低浓度范围药物(沙丁胺醇和MEGX)的响应值，同时适当降低高浓度范围药物(利多卡因)的响应值，从而满足同时检测三个化合物的目的；本发明通过优化色谱条件，包括流动相的梯度、流动相的起始比例和流速，使待测物灵敏度更高、色谱峰形更好。本发明首次实现了血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇血药浓度的同时检测，并且本发明提供的方法精密度、准确度和稳定性高，解决了现有技术因利多卡因和沙丁胺醇剂量以及浓度相差较大，同时检测原型药物及利多卡因主要代谢产物MEGX难度较大的问题，为因利多卡因和沙丁胺醇两药联合应用的临床前及临床药代动力学研究提供了技术支持；此外本发明提供的方法在普通药物代谢实验室即可开展。
附图说明
图1为实施例1中大鼠静注利多卡因与沙丁胺醇(1+0.025mg/kg)后利多卡因、沙丁胺醇和MEGX药-时曲线(n＝2)；
图2为实施例1中大鼠肺部给药不同剂量利多卡因与沙丁胺醇后利多卡因、沙丁胺醇和MEGX药-时曲线(n＝2)；
图3为实施例1中利多卡因校准曲线；
图4为实施例1中沙丁胺醇校准曲线；
图5为实施例1中MEGX校准曲线；
图6为实施例1中利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标2H6-利多卡因的大鼠血浆样品色谱图，图6中A、B、C对应的三行色谱图分别为空白大鼠血浆的色谱图，空白大鼠血浆外加5ng/mL利多卡因、1ng/mL沙丁胺醇和0.5ng/mL MEGX混合溶液的色谱图，大鼠静注给药2mg/kg利多卡因和0.05mg/kg沙丁胺醇后2h血浆样品的色谱图；A～C三行色谱图中，I对应利多卡因，II对应沙丁胺醇，III对应MEGX，IV对应内标；
图7为实施例2中利多卡因校准曲线；
图8为实施例2中沙丁胺醇校准曲线；
图9为实施例2中MEGX校准曲线；
图10为实施例2中利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标2H6-利多卡因的人血浆样品色谱图，图10中A、B对应的两行色谱图分别为空白人血浆的色谱图，空白人血浆外加5ng/mL利多卡因、1ng/mL沙丁胺醇和0.5ng/mL MEGX混合溶液的色谱图；A～B两行色谱图中，I对应利多卡因，II对应沙丁胺醇，III对应MEGX，IV对应内标。
具体实施方式
本发明提供了一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX(单乙基甘氨酰二甲苯胺)和沙丁胺醇浓度的方法，包括以下步骤：
将待测血浆样品、乙腈与内标物混合进行前处理，得到待测进样液；
将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到色谱图，将色谱图中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比代入相应预定的校准曲线中，计算得到待测血浆样品中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的浓度。
本发明将待测血浆样品、乙腈与内标物混合进行前处理，得到待测进样液。在本发明中，所述乙腈优选为HPLC级乙腈；所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1～1.5：4～6，更优选为1～1.2：4～5。在本发明中，所述内标物为2H6-盐酸利多卡因；所述乙腈与内标物的用量比优选为1mL：1ng；本发明优选先将乙腈与内标物混合，再加入到待测血浆样品中。在本发明中，所述前处理优选包括将所述混合得到的混合物依次进行涡旋和离心，上清液作为待测进样液；所述涡旋的时间优选为1～2min；所述离心的速度优选为10000～15000rpm，更优选为12000rpm，时间优选为10～15min。在本发明中，所述乙腈作为与水互溶的有机溶剂，与待测血浆样品充分涡旋以后，能够将样品中的血浆蛋白充分变性，经离心后，变性蛋白沉淀，达到去除蛋白的作用。本发明采用蛋白沉淀法进行待测样品前处理，方法简单，并能提高分析通量。
得到待测进样液后，本发明将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测(即LC-MS/MS)，得到色谱图。在进行液相色谱-串联质谱检测前，本发明优选将所述待测进样液与水混合；所述水优选为纯水，所述待测进样液与水的体积比优选为1:1。
在本发明中，所述液相色谱-串联质谱(即LC-MS/MS)检测中液相色谱条件包括：
流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸-水溶液、流动相B为甲酸-乙腈溶液，流动相A和流动相B中甲酸的体积百分含量为0.1％；流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序：0.0～0.3min，流动相B体积分数为1％；0.3～2.5min，流动相B体积分数由1％变化至90％；2.5～2.8min，流动相B体积分数为90％；2.8～3.0min，流动相B体积分数由90％变化至1％；3.0～4.0min，流动相B体积分数为1％；流动相体系流速：0.6mL/min。
在本发明中，所述液相色谱-串联质谱检测中采用的色谱柱优选为PhenomenexC18 column，尺寸规格3.0mm×50mm，2.6μm；柱温优选为40℃；所述液相色谱-串联质谱检测的进样量优选为5μL。
在本发明中，所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件包括：
利多卡因定量离子对(m/z)为235.30/86.20，CE为21V，Q1为21V，Q3为18V；沙丁胺醇定量离子对(m/z)为240.30/148.15，CE为20V，Q1为11V，Q3为29V；MEGX定量离子对(m/z)为207.30/58.15，CE为15V，Q1为19V，Q3为11V；内标物定量离子对为241.35/86.20，CE为22V，Q1为22V，Q3为17V；所述Q1和Q3分别指质谱仪碰撞池前端和后端四极杆预杆偏置电压，CE指碰撞池电压。
在本发明中，所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件还优选包括：离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应检测模式；扫描方式为正离子扫描模式；干燥气(Drying Gas)流速为10L/min，加热气(Heating Gas)流速为10L/min，碰撞气(CID Gas)压力为270kPa，离子源(Interface)温度300℃，脱溶剂管(Desolvation)温度526℃，加热模块(Heat block)温度400℃。
得到色谱图后，本发明将色谱图中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比代入相应预定的校准曲线中，计算得到待测血浆样品中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的浓度。在本发明中，所述校准曲线分别为利多卡因的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中利多卡因浓度的关系曲线、MEGX的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中MEGX浓度的关系曲线、沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中沙丁胺醇浓度的关系曲线。
在本发明中，所述校准曲线的获取方法优选包括以下步骤：
(a)在空白血浆样品中加入不同浓度的利多卡因标准品、利多卡因代谢物MEGX标准品和沙丁胺醇标准品，涡旋混匀，得到系列浓度的标准工作液；
(b)将所得系列浓度的标准工作液、乙腈与内标物混合进行前处理，得到标准进样液；
(c)将所述标准进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到系列浓度标准进样液色谱图，以系列浓度的标准工作液中利多卡因标准品、MEGX标准品、沙丁胺醇标准品的浓度为横坐标，以对应的色谱图中多卡因、MEGX、沙丁胺醇与内标物的峰面积之比为纵坐标，加权(1/X2)最小二乘法进行回归，得到回归方程，即为对应的校准曲线。
在本发明中，所述步骤(b)～(c)的条件及操作与上述技术方案相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.建立同时检测大鼠血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法：
试剂和材料：盐酸利多卡因标准品(批号：100341-202104)、硫酸沙丁胺醇标准品(批号：402A022)和单乙基甘氨酰二甲苯胺(MEGX)标准品(批号：22P043-B2)，内标物：2H6-盐酸利多卡因(批号：21J170-A2)，乙腈为HPLC级。
使用仪器：LC-MS/MS 8060(日本岛津公司)。
检测方法：
(1)血浆样品前处理方法及配制校准曲线：
采用蛋白沉淀法处理含药大鼠血浆，具体操作为取20μL大鼠血浆样品，加入2μL空白乙腈混匀后，加入100μL含内标物(1ng/mL)的乙腈，涡旋震荡1min，再12000rpm离心10min；定量取上清液50μL加入50μL纯水混匀后注入LC-MS/MS进行分析检测。
取20μL空白大鼠血浆加入2μL含不同浓度标准品的乙腈工作液模拟含药血浆样品配制校准曲线，混匀后其他步骤同前。其中，不同浓度标准品的乙腈工作液是将利多卡因标准品(25000ng/mL)、沙丁胺醇标准品(5000ng/mL)和MEGX标准品(2500ng/mL)的混合溶液用乙腈经逐步稀释得到的，稀释后的溶液中利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的浓度分别为5000ng/mL+1000ng/mL+500ng/mL，2000ng/mL+400ng/mL+200ng/mL，1000ng/mL+200ng/mL+100ng/mL，500ng/mL+100ng/mL+50ng/mL，200ng/mL+40ng/mL+20ng/mL，100ng/mL+20ng/mL+10ng/mL，50ng/mL+10ng/mL+5ng/mL，20ng/mL+4ng/mL+2ng/mL，10ng/mL+2ng/mL+1ng/mL。
LC-MS/MS检测的色谱条件：
色谱柱：Phenomenex C18 column，尺寸规格3.0mm×50mm，2.6μm；柱温：40℃；
流动相：流动相A为甲酸-水溶液、流动相B为甲酸-乙腈溶液，流动相A和流动相B中甲酸的体积百分含量为0.1％；流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序：0.0～0.3min，流动相B体积分数为1％；0.3～2.5min，流动相B体积分数由1％变化至90％；2.5～2.8min，流动相B体积分数为90％；2.8～3.0min，流动相B体积分数由90％变化至1％；3.0～4.0min，流动相B体积分数为1％；流速：0.6mL/min；
进样量：5μL。
质谱条件：
离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应检测模式；扫描方式为正离子扫描模式；干燥气流速10L/min，加热气流速10L/min，碰撞气压力270kPa，离子源温度300℃，脱溶剂管温度526℃，加热模块温度400℃。利多卡因、沙丁胺醇、MEGX及内标2H6-利多卡因的质谱检测条件如表1所示：
表1利多卡因、沙丁胺醇、MEGX及内标2H6-利多卡因的质谱检测条件
(2)沙丁胺醇和利多卡因复方制剂大鼠体内血浆动力学预实验：大鼠静注利多卡因和沙丁胺醇(1mg/kg+0.025mg/kg)和吸入给药高、低两个剂量(分别为0.5mg/kg+0.0125mg/kg和2mg/kg+0.05mg/kg)后，在0～4h内不同时间点采血，测定血浆中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇浓度及其范围。根据随行校准曲线测得不同时间点的血药浓度结果如表2所示，药-时曲线图如图1、图2所示。
表2大鼠静注给药和吸入给药不同浓度利多卡因与沙丁胺醇后利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的血药浓度(ng/mL)
根据大鼠体内药代动力学预试验结果，为保证沙丁胺醇和利多卡因复方制剂的大鼠体内药代动力学研究，最终确定大鼠校准曲线浓度范围为利多卡因1～500ng/mL，沙丁胺醇0.2～100ng/mL，MEGX 0.1～50ng/mL，结合10倍稀释线性验证，能够将定量上线再扩大10倍，满足高剂量给药后利多卡因血药浓度高的要求。
2.同时检测大鼠血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法验证
(1)配制校准曲线及质控样品
配制不同浓度的标准品工作液使大鼠血浆样品中最终药物浓度分别为利多卡因1、2、5、10、20、50、100、200和500ng/mL，沙丁胺醇0.2、0.4、1、2、4、10、20、40和100ng/mL，MEGX 0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50ng/mL。血浆中4个QC(质控)样品(最低定量下限LLOQ、低浓度质控LOQ、中浓度质控MOQ、高浓度质控HOQ)的最终浓度分别为利多卡因1、3、40和400ng/mL，沙丁胺醇0.2、0.6、8和80ng/mL，MEGX 0.1、0.3、4、40ng/mL。
利多卡因、沙丁胺醇和MEGX校准曲线分别如图3、图4和图5所示，所述校准曲线为以上述大鼠血浆样品中最终药物浓度为横坐标，以对应的色谱图中相应药物与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制而成，其中利多卡因校准曲线为Y＝0.238107X+0.0120513(r＝0.9991274，r2＝0.9982555)、沙丁胺醇校准曲线为Y＝0.132575X+0.00498662(r＝0.9987609，r2＝0.9975233)，MEGX校准曲线为Y＝0.0529752X-0.000983079(r＝0.9990233，r2＝0.9980475)。
(2)待测血浆样品中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇血药浓度检测方法：
取20μL大鼠血浆加入2μL空白乙腈，涡旋混匀后加入100μL含内标物(1ng/mL)的乙腈，涡旋混匀1min，再12000rpm离心10min；定量取上清液50μL，加入50μL纯水混匀后注入LC-MS/MS进行分析。
图6为实施例1中利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标2H6-利多卡因的大鼠血浆样品色谱图，图6中A、B、C对应的三行色谱图分别为空白大鼠血浆的色谱图、空白大鼠血浆外加5ng/mL利多卡因、1ng/mL沙丁胺醇和0.5ng/mL MEGX混合溶液的色谱图、大鼠静注给药2mg/kg利多卡因和0.05mg/kg沙丁胺醇后2h血浆样品的色谱图；A～C三行色谱图中，I对应利多卡因，II对应沙丁胺醇，III对应MEGX，IV对应内标。大鼠血浆内源性干扰组分的响应均低于药物定量下限响应的20％，并且低于内标响应的5％。由图6可知，利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标的保留时间分别为1.72min、1.40min、1.64min与1.72min，大鼠血浆中的内源性物质不干扰药物与内标的测定。
(3)方法的精密度与准确度表征
对检测方法的精密度与准确度进行表征，方法为：配制利多卡因、沙丁胺醇和MEGX在大鼠血浆中定量下限浓度(LLQC)以及低浓度质控(LOQ)、中浓度质控(MOQ)、高浓度质控(HOQ)4个质控样品(n＝6)，三个分析批(n＝18)，均随行制备校准曲线，测试样品的批内和批间精密度(RSD)和准确度(RE)。验证标准为质控样品(LOQ、MOQ、HOQ)的RSD≤15％和RE在±15％范围内，LLQC为RSD≤20％和RE在±20％范围内。
以LC-MS/MS检测方法检测大鼠血浆利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的精密度(RSD)和准确度(RE)，数据如表3～5所示：
表3利多卡因大鼠血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
表4沙丁胺醇大鼠血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
表5MEGX大鼠血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
(3)样品稳定性考察
对样品储存方法的稳定性进行表征，方法为：配制空白大鼠血浆低、中、高(LOQ、MOQ、HOQ)质控浓度(n＝3)，考察含药血浆样品4℃储存24h，-20℃储存6天的稳定性，验证标准为质控样品的RSD≤15％和RE在±15％范围内。
以LC-MS/MS检测方法检测大鼠血浆利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的稳定性，数据如表6～8所示：
表6利多卡因大鼠血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
表7沙丁胺醇大鼠血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
表8MEGX大鼠血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
(5)方法的稀释线性考察
对检测方法的稀释可靠性进行表征，方法为：取空白大鼠血浆配制6份利多卡因、沙丁胺醇和MEGX浓度分别为2500、500、250ng/mL混合血浆样品，再用空白大鼠血浆稀释至250、50、25ng/mL，考察含药血浆样品稀释准确度，验证标准为血浆样品的RE在±15％范围内。通过对检测方法稀释线性进行验证，能够扩大本方法的检测范围。以LC-MS/MS检测方法检测大鼠血浆利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的稀释可靠性，数据如表9所示：
表9利多卡因、沙丁胺醇和MEGX大鼠血浆中的稀释线性(n＝6)
实施例2
同时检测人血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度：
试剂和材料：盐酸利多卡因标准品(批号：100341-202104)、硫酸沙丁胺醇标准品(批号：402A022)和单乙基甘氨酰二甲苯胺(MEGX)标准品(批号：22P043-B2)，内标物：2H6-盐酸利多卡因(批号：21J170-A2)，乙腈为HPLC级。
使用仪器：LC-MS/MS 8060(日本岛津公司)。
检测方法：
(1)校正曲线和质控样品配制：
根据文献报道的人体内利多卡因、沙丁胺醇的血浆动力学研究结果，确定校准曲线浓度范围为利多卡因1～500ng/mL，沙丁胺醇0.05～25ng/mL，MEGX 0.1～50ng/mL。
取20μL空白人血浆加入2μL含不同浓度标准品的乙腈工作液，涡旋混匀后加入100μL含内标物(1ng/mL)的乙腈，涡旋混匀1min，再12000rpm离心10min；定量取上清液50μL加入50μL纯水混匀后注入LC-MS/MS进行分析。其中，不同浓度标准品工作液是将利多卡因标准品(25000ng/mL)、沙丁胺醇标准品(1250ng/mL)和MEGX标准品(2500ng/mL)的混合溶液用乙腈逐步稀释得到的，稀释后的溶液中利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的浓度分别为5000ng/mL+250ng/mL+500ng/mL，2000ng/mL+100ng/mL+200ng/mL，1000ng/mL+50ng/mL+100ng/mL，500ng/mL+25ng/mL+50ng/mL，200ng/mL+10ng/mL+20ng/mL，100ng/mL+5ng/mL+10ng/mL，50ng/mL+2.5ng/mL+5ng/mL，20ng/mL+1ng/mL+2ng/mL，10ng/mL+0.5ng/mL+1ng/mL。
不同浓度的标准品工作液使人血浆样品中最终药物浓度分别为利多卡因1、2、5、10、20、50、100、200和500ng/mL，沙丁胺醇0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10和25ng/mL，MEGX0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50ng/mL。血浆中4个QC(质控)样品(最低定量下限LLOQ、低浓度质控LOQ、中浓度质控MOQ、高浓度质控HOQ)的最终浓度为利多卡因1、3、40和400ng/mL，沙丁胺醇0.05、0.15、2和20ng/mL，MEGX 0.1、0.3、4、40ng/mL。
色谱条件和质谱条件与实施例1相同。
利多卡因、沙丁胺醇和MEGX校准曲线分别如图7、图8和图9所示，所述校准曲线为以上述人血浆样品中最终药物浓度为横坐标，以对应的色谱图中相应药物与内标物的峰面积之比为纵坐标绘制而成，其中利多卡因校准曲线为Y＝0.197817X-0.00139575(r＝0.9993223，r2＝0.9986451)、沙丁胺醇校准曲线为Y＝0.105434X+0.00138831(r＝0.9982566，r2＝0.9965162)，MEGX校准曲线为Y＝0.0496919X+0.00157051(r＝0.9960625，r2＝0.9980293)。
图10为实施例2中利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标2H6-利多卡因的人血浆样品色谱图，图10中A、B对应的两行色谱图分别为空白人血浆的色谱图，空白人血浆外加5ng/mL利多卡因、1ng/mL沙丁胺醇和0.5ng/mL MEGX混合溶液的色谱图；A～B两行色谱图中，I对应利多卡因，II对应沙丁胺醇，III对应MEGX，IV对应内标。人血浆内源性干扰组分的响应均低于药物定量下限响应的20％，并且低于内标响应的5％。由图10可知，利多卡因、沙丁胺醇、MEGX和内标的保留时间分别为1.72min、1.40min、1.64min与1.72min，人空白血浆中的内源性物质不干扰药物与内标的测定。
(3)方法精密度与准确度表征
对检测方法的精密度与准确度进行表征，方法为：配制利多卡因、沙丁胺醇和MEGX在人血浆中LLQC以及低、中、高浓度(LOQ、MOQ、HOQ)4个质控样品(n＝6)，三个分析批(n＝18)，均随行校准曲线，测试样品的批内和批间精密度(RSD)和准确度(RE)。验证标准为质控样品的RSD≤15％和RE在±15％范围内，LLQC为RSD≤20％和RE在±20％范围内。
以LC-MS/MS检测方法检测人血浆利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的精密度(RSD)和准确度(RE)，数据如表11～13所示：
表10利多卡因人血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
表11沙丁胺醇人血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
表12MEGX人血浆LC-MS/MS方法的精密度和准确度
(4)样品稳定性考察
对样品储存方法的稳定性进行表征，方法为：配制空白人血浆低、中、高质控浓度(n＝3)，考察含药血浆样品4℃储存24h，-20℃储存6天的稳定性，验证标准为质控样品的RSD≤15％和RE在±15％范围内。
以LC-MS/MS检测方法检测人血浆利多卡因、沙丁胺醇和MEGX的稳定性，数据如表13～15所示：
表13利多卡因人血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
表14沙丁胺醇人血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
表15MEGX人血浆中的稳定性(Mean±SD,n＝3)
由以上实施例可以看出，本发明实现了血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的同时检测，并且精密度、准确度和稳定性高，因大鼠实验需要高剂量给药，血药浓度在超出校准曲线范围后，大鼠血浆样品的稀释可靠性符合生物样品的分析要求，从而能够为因利多卡因和沙丁胺醇两药联合应用的临床前研究及临床研究提供技术支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种同时检测血浆中利多卡因及其代谢物MEGX和沙丁胺醇浓度的方法，包括以下步骤：
将待测血浆样品、乙腈与内标物混合进行前处理，得到待测进样液；所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1～1.5：4～6；
将所述待测进样液进行液相色谱-串联质谱检测，得到色谱图，将色谱图中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比代入相应预定的校准曲线中，计算得到待测血浆样品中利多卡因、MEGX和沙丁胺醇的浓度；所述校准曲线分别为利多卡因的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中利多卡因浓度的关系曲线、MEGX的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中MEGX浓度的关系曲线、沙丁胺醇的特征峰面积与内标物的峰面积之比和血浆中沙丁胺醇浓度的关系曲线；
所述液相色谱-串联质谱检测中液相色谱条件包括：流动相体系为流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸-水溶液、流动相B为甲酸-乙腈溶液，流动相A和流动相B中甲酸的体积百分含量为0.1％；流动相梯度洗脱，梯度洗脱程序：0.0～0.3min，流动相B体积分数为1％；0.3～2.5min，流动相B体积分数由1％变化至90％；2.5～2.8min，流动相B体积分数为90％；2.8～3.0min，流动相B体积分数由90％变化至1％；3.0～4.0min，流动相B体积分数为1％；流动相体系流速：0.6mL/min；
所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件包括：利多卡因定量离子对为235.30/86.20，CE为21V，Q1为21V，Q3为18V；沙丁胺醇定量离子对为240.30/148.15，CE为20V，Q1为11V，Q3为29V；MEGX定量离子对为207.30/58.15，CE为15V，Q1为19V，Q3为11V；内标物定量离子对为241.35/86.20，CE为22V，Q1为22V，Q3为17V。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测血浆样品与乙腈的体积比为1～1.2：4～5。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内标物为2H6-盐酸利多卡因。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乙腈与内标物的用量比为1mL：1ng。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述前处理包括将所述混合得到的混合物依次进行涡旋和离心，上清液作为待测进样液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述涡旋的时间为1～2min；所述离心的速度为10000～15000rpm，时间为10～15min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测中采用的色谱柱为PhenomenexC18column，尺寸规格3.0mm×50mm，2.6μm；柱温为40℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测的进样量为5μL。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液相色谱-串联质谱检测中质谱条件包括：
离子源为电喷雾离子源；检测方式为多反应检测模式；扫描方式为正离子扫描模式；干燥气流速为10L/min，加热气流速为10L/min，碰撞气压力为270kPa，离子源温度300℃，脱溶剂管温度526℃，加热模块温度400℃。
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