CN104991027B - 降低lc‑ms测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种降低LC‑MS测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法。具体地说，本申请涉及一种用于液相色谱‑质谱分析测试中降低液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐含量的方法，该方法包括如下步骤：(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份；(2)使所述洗脱馏份与助剂充分混合；(3)使所得混合液通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；和，任选的(4)将所得清液进行浓缩，即得。本申请方法可以有效地降低高效液相色谱洗脱液中的缓冲盐含量，从而使得该洗脱液在用于后续的质谱测定时减少对质谱仪的损耗。本发明采用简单的处理方法，可以实现LC‑MS法的LC洗脱馏份中不挥发性缓冲盐浓度的大大降低，并且目标物质不会损耗。

Description

降低LC-MS测试物中不挥发性缓冲盐含量的方法

技术领域

本申请属于分析化学技术领域，涉及一种液相色谱-质谱法中的相关操作，特别是涉及一种用于降低液相色谱-质谱(LC-MS)法测试物中缓冲盐含量的方法。本申请方法可以有效地降低高效液相色谱洗脱液中的缓冲盐含量，从而使得该洗脱液在用于后续的质谱测定时减少对质谱仪的损耗。本发明采用简单的处理方法，可以实现LC-MS法的LC洗脱馏份中不挥发性缓冲盐浓度的大大降低，并且目标物质不会损耗。

背景技术

质谱分析是一种测量离子质荷比(质量-电荷比)的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。

质谱技术是一种鉴定技术，在有机分子的鉴定方面发挥非常重要的作用。它能快速而极为准确地测定生物大分子的分子量，使蛋白质组研究从蛋白质鉴定深入到高级结构研究以及各种蛋白质之间的相互作用研究。

随着质谱技术的发展,质谱技术的应用领域也越来越广。由于质谱分析具有灵敏度高，样品用量少，分析速度快，分离和鉴定同时进行等优点，因此，质谱技术广泛的应用于化学，化工，环境，能源，医药，运动医学，刑事科学技术，生命科学，材料科学等各个领域。

质谱仪种类繁多，不同仪器应用特点也不同,一般来说，在300℃左右能汽化的样品，可以优先考虑用气相色谱-质谱(GC-MS)进行分析，因为GC-MS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。如果在300℃左右不能汽化，则需要用LC-MS分析，此时主要得分子量信息，如果是串联质谱，还可以得一些结构信息。如果是生物大分子，主要利用LC-MS和MALDI-TOF分析，主要得分子量信息。对于蛋白质样品，还可以测定氨基酸序列。质谱仪的分辨率是一项重要技术指标，高分辨质谱仪可以提供化合物组成式，这对于结构测定是非常重要的。双聚焦质谱仪，傅立叶变换质谱仪，带反射器的飞行时间质谱仪等都具有高分辨功能。

质谱分析法对样品有一定的要求。进行GC-MS分析的样品应是有机溶液，水溶液中的有机物一般不能测定，须进行萃取分离变为有机溶液，或采用顶空进样技术。有些化合物极性太强，在加热过程中易分解，例如有机酸类化合物，此时可以进行酯化处理，将酸变为酯再进行GC-MS分析，由分析结果可以推测酸的结构。如果样品不能汽化也不能酯化，那就只能进行LC-MS分析了。对于极性样品，一般采用ESI源，对于非极性样品，采用APCI源。

液相色谱-质谱联用仪(liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，简称LC-MS，是液相色谱与质谱 联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。

色谱-质谱联用技术是当代最重要的分离和鉴定的分析方法之一。色谱的优势在于分离，色谱的分离能力为混合物分离提供了最有效的选择，但色谱方法难以得到结构信息，其主要靠与标样对比达到对未知物结构的推定；在对复杂混合未知物的结构分析方面显得薄弱；在常规的紫外检测器上对于无紫外吸收化合物的检测和大量未知化合物的定性分析还需依赖于其他手段。质谱法能提供丰富的结构信息，用样量又是几种谱学方法中用量最少的，但其样品需经预处理(纯化、分离)，程序复杂、耗时长。长期以来，人们为解决这两种技术的弱点发展了许多技术，其中色谱-质谱联用技术是最具发展和应用前景的技术之一。目前应用较多的是气相色谱-质谱(GC-MS)联用。但是GC要求样品具有一定的蒸气压，只有20％的药品可不经过预先的化学处理而能满意地用气相色谱分离，多种情况下所研究的药物需要经过适当的预处理和衍生化，以使之成为易汽化的样品才能进行GC-MS分析。而HPLC可分离极性的、离子化的、不易挥发的高分子质量和热不稳定的化合物，同时LC-MS联机弥补了传统LC检测器的不足，具有高分离能力，高灵敏度，应用范围更广和具有极强的专属性等特点，越来越受到人们的重视。据估计已知化合物中约80％的化合物均为亲水性强、挥发性低的有机物，热不稳定化合物及生物大分子，这些化合物广泛存在于当前应用和发展最广泛、最有潜力的领域，包括生物、医药、化工和环境等方面，它们需要用LC分离。因此，LC与MS的联用可以解决GC-MS无法解决的问题。

液相色谱-质谱联用仪是液相色谱与质谱联用的仪器。它结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力。是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。联机的关键是适用接口的开发，必须在试样组分进入离子源前去除溶剂，目前，多采用履带式加热传送带。

液相色谱质谱联用仪(liquid Chromatograph Mass Spectrometer)，简称LC-MS，是有机物分析市场中的高端仪器。液相色谱(LC)能够有效的将有机物待测样品中的有机物成分分离开，而质谱(MS)能够对分开的有机物逐个的分析，得到有机物分子量，结构(在某些情况下)和浓度(定量分析)的信息。强大的电喷雾电离技术造就了LC-MS质谱图十分简洁，后期数据处理简单的特点。LC-MS是有机物分析实验室，药物、食品检验室，生产过程控制、质检等部门必不可少的分析工具。

液相色谱质谱联用仪特点：液相色谱和质谱连接，可以增加额外的分析能力，能够准确鉴定和定量像细胞和组织裂解液，血液，血浆，尿液和口腔液等复杂样品基质中的微量化合物。高效液相色谱质谱系统(ABSciex Eksigent LC/MS和LC/MS/MS)提供了一些独特的优势，包括：(1)快速分析和流转所需的最少样品准备；(2)高灵敏度并结合可分析多个化合物能力，甚至可以跨越化合物的种类；(3)高精确度，高分辨率鉴定和量化目标分析物。

尽管人们通过液相色谱-质谱联用解决了诸多分析化学领域的难题，然而，进行LC-MS分析时，其样品通常要求是水溶液或甲醇溶液，并且特别地要求液相色谱的流动相中不应含有或者尽可能少地含有不挥发的盐。

但是，令人遗憾的是，作为液相色谱例如高效液相色谱的流动相，通常需要向其中添加一些不具 挥发的缓冲盐以获得优异的色谱分离效果，但是这些包含不具挥发的缓冲盐的色谱洗脱馏份在用于接下来的质谱测定时，这些不挥发性缓冲盐是难以除去或者难以与色谱洗脱馏份中的目标物分离开的。例如，中国药典2010年版二部第6页收载的乙酰谷酰胺在测定其中的杂质即有关物质时，通过液相色谱法进行分离分析，该液相色谱使用的流动相中包含磷酸二氢钾，在此情况下如果要确定其中杂质峰的归属或者化学结构的情况下，使杂质峰色谱馏份导入质谱仪来检测是有益的，但是杂质峰色谱馏份中所包含的磷酸二氢钾不具挥发性，不利于质谱测定。如果采用当前常的方法对该杂质峰色谱馏份进行浓缩论(通常采用氮气吹干的方法)，尽管目标物即杂质浓缩了，但是其中的磷酸盐也同样地会成比例地浓缩，并且可能会引起pH的改变，影响待测成分的稳定性，因此这种浓缩方法不是降低MS待测物中不挥发性缓冲盐浓度的适宜方法。因此这种浓缩方法无法实现降低MS待测物中不挥发性缓冲盐浓度的目的。

因此，化学分析领域技术人员迫切期待有一种能够有效地降低液相色谱-质谱法测试物中不挥发性缓冲盐含量甚至除去的方法。

发明内容

本申请的目的在于提供一种能够有效地降低液相色谱-质谱法测试物中不挥发性缓冲盐含量甚至除去的方法。已经出人意料地发现，使液相色谱洗脱馏份照本申请方法进行处理后，可以显著地降低该液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐的含量。本申请基于该发现而得以完成。

为此，本发明第一方法提供了一种用于液相色谱-质谱分析测试中降低液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份；

(2)使所述洗脱馏份与助剂充分混合(任选的可额外加入有机溶剂(例如甲醇和/或乙腈)混合)；

(3)使所得混合液通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；和，任选的

(4)将所得清液进行浓缩，即得。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱是反相高效液相色谱。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱洗脱所用的流动相是水相和有机相的混合液。在一个实施方案中，所述有机相例如但不限于：甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃、异丙醇及其组合；特别是甲醇和乙腈。在一个实施方案中，所述水相中包含不挥发性缓冲盐。

根据本发明根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述水相和有机相的体积比可以是5：95～95：5的范围。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐例如但不限于磷酸盐、枸橼酸盐、醋酸盐、高氯酸盐中的一种或多种。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐的碱根是选自碱金属或碱土金属离子的碱根或者是铵根。在一个实施方案中，所述碱根选自：钠离子、钾离子、镁离子、钙离子，优选的碱根是钠离子、钾离子、或铵根离子。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐包括但不限于：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、枸橼酸钠、枸橼酸钾、枸橼酸二钠、枸橼酸二钾、枸橼酸三钠、枸橼酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、高氯酸钠、高氯酸钾及其组合。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述目标物是所述检测物中的主要成分或者非主要成分(例如杂质)。在一个实施方案中，所述主要成分或非主要成分是已知物质或者是未知物质。在化学分析领域，已知物质或未知物质在液相色谱中分离得到目标物色谱峰或者洗脱馏份后，该目标物接着进入质谱仪检测，可以根据质谱检测结果确定该目标物化学结构，从而可以对已知物质作准确确认，或者对未知物质的化学结构/组成进行分析。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中将所述检测物配制成溶液所用的溶剂是流动相或者是选自下列的溶剂：水、甲醇、乙腈、乙醇及其组合。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述助剂是无机硫酸盐。在一个实施方案中，所述无机硫酸盐选自硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、其无水物、其水合物、及其组合。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述洗脱馏份与所述助剂在混合时以重量比1：0.01～100的比例混合，例如以重量比1：0.05～10的比例混合，例如以重量比1：0.1～5的比例混合，例如以重量比1：0.5～2的比例混合。二者重量比的调节是容易实现的，例如根据不挥发性缓冲盐的降低程度适当调整洗脱馏份与助剂的混合比例。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中所述水相和有机相的体积比可以是5：95～95：5的范围。已经发现，只要检测物和目标物通常溶解于此流动相中都可以实现降低其中所用不挥发性缓冲盐的目的。并且，由于本发明第一方面的方法特别地用于针对某一检测物和/或目标物的LC-MS测定，并且本发明第一方面的方法是在这种LC-MS方法中间增加的几个简单样品处理步骤。因此，本领域技术人员公知的非常容易理解，这种适合于检测物和/或目标物分析的LC-MS法是完全能够接受增加本发明几个操作步骤的。即，容易想见，本发明方法适合于任何满足本发明测定条件的LC-MS方法，例如只要这些LC-MS的LC中所用流动相、缓冲盐符合所规定的条件，本发明方法就适用于这些LC-MS。因此，本发明方法中检测物和目标物、以及其使用的LC和MS方法条件是不必作具体限定的，尽管本发明在后文中以具体药物分析的方法对本发明方法进行了验证。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，相对于步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的不挥发性缓冲盐而言，步骤(3)所得清液中的不挥发性缓冲盐的残余率(％)达到50％以下，例如可以达到5～50％的程度，例如可以达到5～40％的程度，例如可以达到5～35％的程度，例如可以达到5～30％的程度，例如可以达到5～25％的程度。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，相对于步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的目标物而言，步骤(3)所得清液中的目标物的残余率(％)达到70％以上，例如可以达到70～100％的程度，例如可以达到70～95％的程度，例如可以达到70～90％的程度，例如可以达到75～90％的程度。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(2)中有机溶剂的体积是洗脱馏份体积的0～100倍，例如0～50倍，例如0～25倍，例如0～10倍，例如0～5倍。

鉴于本发明所用的助剂多为颗粒或微粒，通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离都容易得到适宜后续测定的澄清溶液，即人们通常所说的清液。因此一般的离心或者过滤的方式都可以使用，例如，对于过滤而言，一般的微孔滤膜都可以实现这些功能，例如孔径0.45μm或者0.22μm的微孔滤膜均可使用。

鉴于本发明方法处理所得的目标物部分可以是检测物中的主要成分或者微量的杂质成分，因此在必要的情况下，特别是微量的杂质的情况下，对经本发明方法处理所得的清液进行浓缩是有必要的，以便获得足够浓度的目标物进行后续的质谱测定。而对于目标物是主要成分的情况，由于清液中所含目标物的量较大，足够用于后续的质谱测定，因此该清液可以不进行浓缩。

通常而言，浓缩可通过挥发除去溶剂的方法(例如氮气吹干的方式)。在此浓缩情况下，来源于流动相的洗脱馏份中不挥发性缓冲盐是不能有效除去的，这些不挥发性缓冲盐会对后续的质谱检测带来巨大压力，并且可能会引起pH的改变，影响待测成分的稳定性。已经出人意料地发现，通过本发明的方法，可以有效地降低液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐含量(或者说浓度)。

进一步地，本发明第二方面提供了一种对检测物中的目标物进行液相色谱-质谱分析的方法，其包括以下步骤：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份；

(2)使所述洗脱馏份与助剂充分混合(任选的可额外加入有机溶剂(例如甲醇和/或乙腈)混合)；

(3)使所得混合液通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；

(4)取上一步骤所得清液直接用于质谱测定，或者将所得清液进行浓缩后再用于质谱测定。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱是反相高效液相色谱。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述液相色谱洗脱所用的流动相是水相和有机相的混合液。在一个实施方案中，所述有机相例如但不限于：甲醇、乙腈、乙醇、四氢呋喃、异丙醇及其组合；特别是甲醇和乙腈。在一个实施方案中，所述水相中包含不挥发性缓冲盐。

根据本发明根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述水相和有机相的体积比可以是5：95～95：5的范围。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐例如但不限于磷酸盐、枸橼酸盐、醋酸盐、高氯酸盐中的一种或多种。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐的碱根是选自碱金属或碱土金属离子的碱根或者是铵根。在一个实施方案中，所述碱根选自：钠离子、钾离子、镁离子、钙离子，优选的碱根是钠离子、钾离子、或铵根离子。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述不挥发性缓冲盐包括但不限于：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、枸橼酸钠、枸橼酸钾、枸橼酸二钠、枸橼酸二钾、枸橼酸三钠、枸橼酸三钾、醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、高氯酸钠、高氯酸钾及其组合。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述目标物是所述检测物中的主要成分或者非主 要成分(例如杂质)。在一个实施方案中，所述主要成分或非主要成分是已知物质或者是未知物质。在化学分析领域，已知物质或未知物质在液相色谱中分离得到目标物色谱峰或者洗脱馏份后，该目标物接着进入质谱仪检测，可以根据质谱检测结果确定该目标物化学结构，从而可以对已知物质作准确确认，或者对未知物质的化学结构/组成进行分析。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中将所述检测物配制成溶液所用的溶剂是流动相或者是选自下列的溶剂：水、甲醇、乙腈、乙醇及其组合。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述助剂是无机硫酸盐。在一个实施方案中，所述无机硫酸盐选自硫酸镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、其无水物、其水合物、及其组合。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述洗脱馏份与所述助剂在混合时以重量比1：0.01～100的比例混合，例如以重量比1：0.05～10的比例混合，例如以重量比1：0.1～5的比例混合，例如以重量比1：0.5～2的比例混合。二者重量比的调节是容易实现的，例如根据不挥发性缓冲盐的降低程度适当调整洗脱馏份与助剂的混合比例。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，其中所述水相和有机相的体积比可以是5：95～95：5的范围。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，相对于步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的不挥发性缓冲盐而言，步骤(3)所得清液中的不挥发性缓冲盐的残余率(％)达到50％以下，例如可以达到5～50％的程度，例如可以达到5～40％的程度，例如可以达到5～35％的程度，例如可以达到5～30％的程度，例如可以达到5～25％的程度。

根据本发明第二方面任一实施方案的方法，相对于步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的目标物而言，步骤(3)所得清液中的目标物的残余率(％)达到70％以上，例如可以达到70～100％的程度，例如可以达到70～95％的程度，例如可以达到70～90％的程度，例如可以达到75～90％的程度。

根据本发明第一方面任一实施方案的方法，其中步骤(2)中有机溶剂的体积是洗脱馏份体积的0～100倍，例如0～50倍，例如0～25倍，例如0～10倍，例如0～5倍。

本申请的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本申请任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。

下面对本申请作进一步的描述。

本申请所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本申请不一致时，以本申请的表述为准。此外，本申请使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本申请仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本申请所表述的含义为准。

示例性的，在实现本发明过程中，可以通过测定本发明步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的不挥发性缓冲盐的浓度(其在本发明中可以记为C1，以摩尔浓度表示是更方便的，特别是在组合使用多种缓冲盐的情况下，例如同时使用磷酸二氢甲和磷酸氢二钠时，可以测定磷酸根离子的总摩尔浓度)，接着测定本发明步骤(3)所得清液中的不挥发性缓冲盐的浓度(其在本发明中可以记为C2，其浓度表示方法与 C1相同)，然后按下式计算使用本发明方法处理后的缓冲盐残余率(％)：

缓冲盐残余率(％)＝(C2÷C1)×100％

已经发现，使用本发明方法，可以使该缓冲盐残余率达到50％以下，例如可以达到5～50％的程度，例如可以达到5～40％的程度，例如可以达到5～35％的程度，例如可以达到5～30％的程度，例如可以达到5～25％的程度。可见，通过本发明简单的处理方法容易地实现缓冲盐的大量去除。

目标物洗脱馏份和清液中的不挥发性缓冲盐的浓度可以使用诸多现有技术的方法测定。例如，典型的，醋酸盐、磷酸盐和枸橼酸盐可参照徐明明方法(氨基酸注射液中乙酸盐和磷酸盐的毛细管区带电泳法测定，中国医药工业杂志，2015,46(1):59)测定。又例如，典型的，高氯酸盐可参照史亚利方法(离子色谱-质谱联用技术测定饮用水及环境水样中痕量高氯酸盐，分析试验室，2007,26(4):34)测定。由于本发明采用C1和C2的相对变化来表征本发明技术效果，因此只要C1和C2二者之间具有相对可比性即可，对这些具体的缓冲盐的测定的准确性不需要有特别高的要求。文献报道的其它测定方法也是完全可以适用的。

示例性的，在实现本发明过程中，可以通过测定本发明步骤(1)所得目标物洗脱馏份中的目标物的浓度(其在本发明中可以记为D1，其方便地可以以摩尔浓度计)，接着测定本发明步骤(3)所得清液中的目标物的浓度(其在本发明中可以记为D2，其浓度表示方法与D1相同)，然后按下式计算使用本发明方法处理后的缓冲盐残余率(％)：

目标物残余率(％)＝(D2÷D1)×100％

已经发现，使用本发明方法，可以使该目标物的残余率(％)达到70％以上，例如可以达到70～100％的程度，例如可以达到70～95％的程度，例如可以达到70～90％的程度，例如可以达到75～90％的程度。

目标物浓度的测定方法是根据具体产品的测定条件容易实现的，这在下文的具体实例中可以容易的了解到。

本发明采用简单的处理方法，可以实现LC-MS法的LC洗脱馏份中不挥发性缓冲盐浓度的大大降低，并且目标物质不会损耗。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明的技术方案范畴。以下各实施例中，使用到的具体的无机硫酸盐，如未特别说明，均是使用其无水物。

实施例1：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

中国药典2010年版二部130页收载了卡托普利，并且需要检查其中的杂质卡托普利二硫化物。本实例考察除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的效果。

避光操作。取卡托普利原料药，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液(临用新制)；另取卡托普利二硫化物对照品，精密称定，加甲醇适量溶解，再用流动相定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照品溶液；再取卡托普利与卡托普利二硫化物对照品，加甲醇适量溶解，用流动相稀释制成每1ml中各约含0.1mg与15μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液。照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录VD)试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.01mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇-乙腈(70：25：5)(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相；检测波长为215nm；柱温40℃。取系统适用性试验溶液50μl，注入液相色谱仪，卡托普利峰与卡托普利二硫化物峰之间的分离度应大于4.0。取对照品溶液50μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使卡托普利二硫化物色谱峰的峰高约为满量程的50％；再精密量取供试品溶液与对照品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与卡托普利二硫化物保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得过1.0％。由此可以测定原料药中卡托普利二硫化物的含量。

接着，照上述方法，再精密量取供试品溶液50μl，注入液相色谱仪，分别截取卡托普利色谱峰部分的洗脱馏份(在此记为馏份A)以及卡托普利二硫化物色谱峰部分的洗脱馏份(在此记为馏份B)。对于馏份A，测定其中的卡托普利浓度(记为D1)以及其中的磷酸根浓度(记为C1)。对于卡托普利二硫化物色谱峰部分的洗脱馏份，亦可类似地测定其中的卡托普利二硫化物浓度以及其中的磷酸根浓度。

接着，分别地，将上述馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸镁，洗脱馏份与助剂重量比约1：1)充分混合；

(3)使所得混合液通过离心的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/10体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。(在测定MS时试样量不足的情况下，可以重复步骤(1)以获得多份洗脱馏份并使其合并，下同)。

实施例2：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸钠，洗脱馏份与助剂重量比约1：0.5)充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.45μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/5体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

实施例3：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸钙，洗脱馏份与助剂重量比约1：2)充分混合，再加乙腈(其体积是洗脱馏份的25倍)，充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.22μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/5体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

实施例4：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸钾，洗脱馏份与助剂重量比约1：1)充分混合，再加乙腈(其体积是洗脱馏份的10倍)，充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.45μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/5体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

实施例5：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(二水硫酸钙，洗脱馏份与助剂重量比约1：0.5)充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.22μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/10体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

实施例6：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质 谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸镁，洗脱馏份与助剂重量比约1：2)充分混合，再加甲醇(其体积是洗脱馏份的50倍)，充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.22μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/10体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

实施例7：除去流动相中缓冲盐磷酸二氢钠的方法

照实施例1，将其中得到的馏份A或者馏份B，照以下本发明方法步骤进行处理：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份(上面已完成本步骤，所得馏份分别是馏份A或馏份B)；

(2)使所述洗脱馏份与助剂(硫酸钠，洗脱馏份与助剂重量比约1：0.5)充分混合；

(3)使所得混合液通过过滤(微孔滤膜，0.22μm)的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利浓度或卡托普利二硫化物浓度(记为D2)，以及清液中的磷酸根浓度(记为C2)；

(4)取上一步骤所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩(至1/10体积)后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合。

结果：以上实施例1-7，经质谱测定馏份A和馏份B，各试验中的质谱结果分别与卡托普利和卡托普利二硫化物吻合；各试验中，缓冲盐残余率均在6～28％范围内，例如实施例1的缓冲盐残余率为19％；卡托普利目标物残余率均在75％～85％范围内，例如实施例2的卡托普利目标物残余率为83％；卡托普利二硫化物目标物残余率均在73％～87％范围内，例如实施例3的卡托普利二硫化物目标物残余率为82％。以上实施例1-7步骤(3)所得清液经测定，其中基本上不含有硫酸根。在补充的试验中，照以上实施例1-7的方法，不同的仅是将其中的硫酸盐改为等量的硫酸铝；结果显示缓冲盐残余率均大于93％。

实施例8：除去流动相中混合缓冲盐磷酸二氢钾和磷酸氢二钠的方法

中国药典2010年版二部179页收载了使用HPLC法测定头孢地嗪钠原料药含量的方法，本实例考察除去流动相中混合缓冲盐的效果。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾0.87g与无水磷酸氢二钠0.22g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀)-乙腈(920：80)为流动相；检测波长为262nm。取对照品溶液10ml，加0.1mol/L盐酸溶液1ml，室温放置24小时，再加0.1mol/L氢氧化钠溶液1ml，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，头孢地嗉峰与前、后相邻的降解杂质峰的分离度应分别不小于3.0和4.0。测定法：取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含头孢地嗪0.1mg的溶液，摇匀，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢地嗪对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品C20H20N6O7S4的含量。由此方法可以测定原料药供试品中头孢地嗪C20H20N6O7S4的含 量。

接着，照上述方法，再精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，截取头孢地嗪色谱峰部分的洗脱馏份(在此记为馏份A)。测定该馏份A中的头孢地嗪浓度(记为D1)以及其中的磷酸根浓度(记为C1)。

接着，将上述馏份A分别照实施例1-7中步骤(1)至(4)的操作进行处理。

结果：经质谱测定，质谱结果与头孢地嗪吻合；缓冲盐残余率在7～27％范围内，目标物残余率在72％～89％范围内。

实施例9：除去流动相中混合缓冲盐醋酸盐和高氯酸盐的方法

中国药典2010年版二部107页收载了使用HPLC法测定左氧氟沙星原料药含量的方法，本实例考察除去流动相中混合缓冲盐醋酸盐和高氯酸盐的效果。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸铵高氯酸钠溶液(取醋酸铵4.0g和高氯酸钠7.0g，加水1300ml使溶解，用磷酸调节pH值至2.2)-乙腈(85：15)为流动相；检测波长为294nm。称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质E对照品各适量，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含左氧氟沙星0.12mg、环丙沙星和杂质E各6μg的混合溶液，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，左氧氟沙星峰的保留时间约为15分钟，左氧氟沙星峰与杂质E峰和左氧氟沙星峰与环丙沙星峰的分离度应分别大于2.0与2.5。取左氧氟沙星原料药约60mg，精密称定，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取左氧氟沙星对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算左氧氟沙星含量，即得。由此方法可以测定原料药供试品中左氧氟沙星的含量。

接着，照上述方法，再精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，截取左氧氟沙星峰部分的洗脱馏份(在此记为馏份A)。测定该馏份A中的左氧氟沙星浓度(记为D1)以及其中的醋酸根浓度(记为C1)和高氯酸根浓度(记为C2)。

接着，将上述馏份A分别照实施例1～4中步骤(1)至(4)的操作进行处理。

结果：经质谱测定，质谱结果与左氧氟沙星吻合；醋酸盐残余率在11～29％范围内，高氯酸盐残余率在7～24％范围内，目标物残余率在73％～88％范围内。

实施例10：除去流动相中混合缓冲盐醋酸盐和高氯酸盐的方法

中国药典2010年版二部221页收载了使用HPLC法测定司帕沙星原料药含量的方法，本实例考察除去流动相中缓冲盐枸橼酸盐的效果。

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以枸橼酸钠缓冲液(称取枸橼酸2.104g与枸橼酸钠2.941g，加水至500ml，用70％髙氯酸溶液调节pH值至2.4)-乙腈(70：30)为流动相；检测波长为298nm。取司帕沙星对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml约含0.1mg的溶液，在4500lx的照度下照射20小时，作为系统适用性试验溶液，量取10μl注人液相色谱仪，记录色谱图，司帕沙星峰保留时间约为7分钟，司帕沙星峰与其相对保留时间约为0.9处的杂质峰的分离度应符合要求。

取司帕沙星原料药约50mg，精密称定，置100ml量瓶中，加甲醇适量，充分振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取20μl 注人液相色谱仪，记录色谱图；另取司帕沙星对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。由此方法可以测定原料药供试品中司帕沙星的含量。

接着，照上述方法，再精密量取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，截取司帕沙星峰部分的洗脱馏份(在此记为馏份A)。测定该馏份A中的司帕沙星浓度(记为D1)以及其中的枸橼酸根浓度(记为C1)。

接着，将上述馏份A分别照实施例1～4中步骤(1)至(4)的操作进行处理。

结果：经质谱测定，质谱结果与司帕沙星吻合；枸橼酸盐残余率在8～26％范围内，目标物残余率在72％～89％范围内。

本发明通过以上示例性的试验，采用简单的处理方法，可以实现LC-MS法的LC洗脱馏份中不挥发性缓冲盐浓度的大大降低，并且目标物质不会损耗。这对于后面的MS测定是极其有益的。

本申请通过上文对本申请的各个方面作了详细的说明，然而本申请并不限于这述这些具体实施方案，本申请的精神和范围应以所附权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种用于反相高效液相色谱-质谱分析测试包含卡托普利二硫化物杂质的卡托普利原料药时降低液相色谱洗脱馏份中不挥发性缓冲盐含量的方法，该方法包括如下步骤：

(1)使检测物配制成溶液，将该溶液注入液相色谱仪以进行洗脱，从液相色谱洗脱液收集待用于质谱检测的目标物洗脱馏份；具体包括如下(1a)至(1d)的操作：

(1a)避光操作；取卡托普利原料药，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为供试品溶液，该供试品溶液临用新制；另取卡托普利二硫化物对照品，精密称定，加甲醇适量溶解，再用流动相定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液，作为对照品溶液；再取卡托普利与卡托普利二硫化物对照品，加甲醇适量溶解，用流动相稀释制成每1ml中各约含0.1mg与15μg的混合溶液，作为系统适用性试验溶液；

(1b)照中国药典2010年版二部附录VD所载高效液相色谱法的规范进行试验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为70：25：5的0.01mol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇-乙腈为流动相，该流动相用磷酸调节pH值至3.0；检测波长为215nm；柱温40℃；取系统适用性试验溶液50μl，注入液相色谱仪，卡托普利峰与卡托普利二硫化物峰之间的分离度应大于4.0；

(1c)取对照品溶液50μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使卡托普利二硫化物色谱峰的峰高为满量程的50％；再精密量取供试品溶液与对照品溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与卡托普利二硫化物保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算原料药中卡托普利二硫化物的含量；

(1d)再精密量取供试品溶液50μl，注入液相色谱仪，分别截取卡托普利色谱峰部分的记为馏份A的洗脱馏份以及卡托普利二硫化物色谱峰部分的记为馏份B的洗脱馏份；对于馏份A，测定其中的卡托普利浓度其记为D1以及其中的磷酸根浓度其记为C1；对于卡托普利二硫化物色谱峰部分的洗脱馏份，类似地测定其中的卡托普利二硫化物浓度以及其中的磷酸根浓度；

(2)使所述洗脱馏份与助剂充分混合；

(3)使所得混合液通过离心或者过滤的方式使悬浮物和清液分离，分取清液；测定清液中的卡托普利或卡托普利二硫化物的记为D2的浓度，以及清液中记为C2的磷酸根浓度；和，

(4)取步骤(3)所得卡托普利清液直接用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利吻合；将所得卡托普利二硫化物清液进行氮气吹干浓缩至1/10体积后再用于质谱测定，以确定其是否与卡托普利二硫化物吻合，

其中，

所述助剂是硫酸镁，洗脱馏份与助剂重量比为1：1；

步骤(3)所得清液经测定，其中基本上不含有硫酸根。

2.根据权利要求1的方法，所述助剂是硫酸钠，洗脱馏份与助剂重量比为1：0.5。

3.根据权利要求1的方法，所述助剂是硫酸钙，洗脱馏份与助剂重量比为1：2。

4.根据权利要求1的方法，所述助剂是硫酸钾，洗脱馏份与助剂重量比为1：1。

5.根据权利要求1的方法，所述助剂是二水硫酸钙，洗脱馏份与助剂重量比为1：0.5。

6.根据权利要求1的方法，所述助剂是硫酸镁，洗脱馏份与助剂重量比为1：2。