CN105372340A - 高效液相色谱-串联质谱法测定低含量帕立骨化醇的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明针对分析化学技术领域，具体涉及一种高效液相色谱-串联质谱法测定低含量帕立骨化醇的方法及其应用。该方法采用高效液相色谱-串联质谱法进行测定，并采用内标法，用度他雄胺作为内标物。该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，其检测限能达到40pg/ml，定量限能达到80pg/ml。可广泛应用于低含量帕立骨化醇制剂中含量的测试及溶出度的测试，特别是帕立骨化醇软胶囊溶出度的测试。

Description

高效液相色谱-串联质谱法测定低含量帕立骨化醇的方法及其应用

技术领域

本发明针对分析化学技术领域，具体涉及一种低含量帕立骨化醇含量的测试方法及其应用。

背景技术

帕立骨化醇为维生素D活性物质骨化三醇的类似物，用于继发性甲状旁腺功能亢进症(主要表现为PTH升高)的预防和治疗。分子式为C₂₇H₄₄O₃，化学名为(7E,22E)-19-去甲基-9,10-开环麦角甾-5,7,22–三烯-1α,3β,25-三醇，其结构式如下：

帕立骨化醇软胶囊中主药规格包括1μg/粒、2μg/粒和4μg/粒，均属于低规格。参照FDA中帕立骨化醇软胶囊的溶出度检测方法，以含0.4％月桂基二甲基氧化胺(LADO)的溶液500ml为溶出介质，溶出度测试终浓度约为4ng/ml。该检测方法采用普通的液相色谱法，由于主药规格低，难以满足溶出度定量测定的要求。另外，该方法选择的溶出介质在帕立骨化醇最大吸收波长252nm处有较大吸收，干扰主峰帕立骨化醇的测定。也就是说，现有技术缺少一种对低含量帕立骨化醇进行定量测定的有效方法。

基于上述原因，本发明探索了一种新的适用于低含量帕立骨化醇含量测试的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种低含量帕立骨化醇的测定方法，该方法能准确的检测极低含量的帕立骨化醇。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

低含量帕立骨化醇的测定方法，采用高效液相色谱-串联质谱法进行测定。

高效液相色谱-串联质谱技术(LC-MS)以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，将色谱对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析，而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便，因此广泛应用于药物分析、食品分析和环境分析等许多领域。

进一步，所述测定采用内标法，用度他雄胺作为内标物。

内标法，即internalstandardmethod，其是将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。因此，如何寻找、筛选出一种合适的内标物尤为重要。对于内标物一般应满足如下要求：能完全溶解于样品中，且不与待测组分发生化学作用；峰位尽可能与待测组分的峰位靠近，但能与待测组分完全分开(分离度R≥1.5)的纯物质；若得不到纯品，必须预先测定其准确含量，且杂质峰不得干扰待测组分峰。

本申请发明人经过反复研究和筛选，终于发现了一种特别适合于液质联用测定法测帕立骨化醇含量的内标物：度他雄胺，即Dutasteride，其结构式如下：

目前，度他雄胺作为一种医药原料或中间体进行使用，主要用于前列腺疾病和男性脱发的治疗。

进一步，所述质谱采用多重反应监测模式，帕立骨化醇和度他雄胺分别采用至少一对母离子及子离子的组合进行定量监测。

图1为帕立骨化醇Q1全扫描质谱图。图中响应值高(可提高检测限，便于定量)且受干扰小的离子，都可以考虑作为母离子进行检测；再对母离子作进一步扫描，同样从响应值高且受干扰小的角度，选出适宜的子离子进行检测即可。如图1所示，其中m/z为399.6左右、417.9左右等的离子都可以作为母离子使用，优选m/z为399.6±1的离子为母离子。图2为帕立骨化醇母离子峰m/z399.6的子离子扫描质谱图。子离子的优选原则同前所述，此处优选m/z为273.4±1的离子为子离子。

进一步，所述度他雄胺采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为529.8±1，子离子m/z为461.5±1。

进一步，所述液相色谱采用的条件包括：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，50×4.6mm，3.5μm。

流动相：乙腈-水，体积比为50:50；并添加适量有机酸或者挥发性有机酸盐。所述流动相中加入有机酸或者挥发性有机酸盐，有助于得到更好的分离色谱峰，并减少拖尾等。具体地，所述有机酸可为甲酸和/或乙酸，体积百分比为0.05％-0.15％，优选0.1％；所述挥发性有机酸盐可为甲酸铵和/或乙酸铵，浓度为5-20mmol/L，优选10mmol/L。

进样量：50-100μl，优选100μl。

进一步，所述质谱采用的条件包括：

离子源：API3000大气压力化学离子源(APCI)，采用正离子模式检测；干燥气：N₂；离子化温度(TEM)为400℃，干燥气压力(Gas2)为75psi，雾化气(Gas1)为10，气帘气(CurtainGas)为10，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)为5500V；雾化电流(NebulizerCurrent)为3μA。

帕立骨化醇化合物参数：母离子m/z为399.6，子离子m/z为273.4，去簇电压(DP)25V，聚焦电压(FP)115V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)30V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)8V。

内标物化合物参数：母离子m/z为529.8，子离子m/z为461.5，去簇电压(DP)30V、聚焦电压(FP)140V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)50V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)15V。

上述的低含量帕立骨化醇的测定方法，由于专属性强、灵敏度高、准确度好，可广泛用于低含量帕立骨化醇制剂的测试，尤其是用于低主药规格的帕立骨化醇制剂的溶出度的测试，进一步优选其在帕立骨化醇软胶囊溶出度测试中进行应用。

具体地，本发明还提供一种测定帕立骨化醇软胶囊溶出度的方法，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好。

为实现上述目的，采用的技术方案为：

一种测定帕立骨化醇软胶囊溶出度的方法，其包括如下内容：

(1)溶液制备：以含0.4％月桂基二甲基氧化胺(LADO)的溶液为溶出介质，采用转篮法(具体参照药典方法)采集样品溶液；

(2)测试方法及参数设置：采用内标法，以度他雄胺为内标物，用高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪进行测定；

测试参数的设置包括：

液相色谱仪：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，50×4.6mm，3.5μm；

流动相：乙腈-水，体积比为50:50；并添加有机酸，优选甲酸，使其体积百分比为0.05％～0.15％，优选0.1％；或者添加挥发性有机酸盐，使其浓度为5～20mmol/L，优选10mmol/L；

进样量：50-100μl，优选100μl；

质谱仪：

离子源：API3000大气压力化学离子源(APCI)，采用正离子模式检测；干燥气：N₂；离子化温度(TEM)为400℃，干燥气压力(Gas2)为75psi，雾化气(Gas1)为10，气帘气(CurtainGas)为10，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)为5500V；雾化电流(NebulizerCurrent)为3μA；

帕立骨化醇化合物参数：母离子m/z为399.6，子离子m/z为273.4，去簇电压(DP)25V，聚焦电压(FP)115V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)30V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)8V；

内标物化合物参数：母离子m/z为529.8，子离子m/z为461.5，去簇电压(DP)30V、聚焦电压(FP)140V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)50V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)15V。

(3)具体操作及结果处理

取帕立骨化醇软胶囊1粒，以0.4％月桂基二甲基氧化胺溶液500ml(添加约10ng/ml的度他雄胺作为内标物)为溶出介质，转速为每分钟100转，依转篮法操作，经20、30、45、60分钟时，取溶出液适量，用0.45μm有机膜滤过，取续滤液作为样品溶液。

另取帕立骨化醇对照品储备溶液适量，用含内标物的溶出介质定量稀释制成每1ml中约含帕立骨化醇4ng的溶液，作为对照品溶液。

分别取样品溶液和对照品溶液各100μl，按上述参数进行测试，记录HPLC-MRM图谱(高效液相色谱-质谱多反应监测图谱)。溶出度的计算方式如下：

式中，A_对主：对照品溶液中主峰面积；

A_样主：样品溶液中主峰面积；

A_对内：对照品溶液中内标物峰面积；

A_样内：样品溶液中内标物峰面积；

C_对主：对照品溶液帕立骨化醇浓度，ng/ml；

n：主药规格，μg。

上述用液相色谱-串联质谱法测定帕立骨化醇软胶囊溶出度的方法，将液相色谱质谱联用，帕立骨化醇软胶囊溶出溶液无需浓缩提取，直接进样，解决了帕立骨化醇软胶囊主药规格低，溶出溶液浓度仅有几个纳克，溶出介质干扰大，检测灵敏度低下的问题；同时，采用内标法能够对其溶出度进行准确定量。

本发明的另一目的还包括保护度他雄胺的一种应用，即：度他雄胺作为内标物在高效液相色谱法或者高效液相色谱-串联质谱法测定帕立骨化醇含量中的应用。

本发明的有益技术效果是：

本发明建立了一种专属性强、灵敏度高、准确度好的低含量帕立骨化醇的测试方法，其检测限能达到40pg/ml，定量限能达到80pg/ml。解决了传统高效液相色谱法测定低含量帕立骨化醇时，尤其是对其制剂进行溶出度测试时，由于溶出药物浓度低测不出测不准，以及溶出介质波长吸收干扰等问题。可广泛应用于低含量帕立骨化醇制剂中含量的测试及溶出度的测试，特别是帕立骨化醇软胶囊溶出度的测试。

附图说明

图1为帕立骨化醇Q1全扫描质谱图(纵座标是强度Intensity(单位：cps)，横座标是质荷比m/z)；

图2为帕立骨化醇母离子峰m/z399.6的子离子扫描质谱图(纵座标是强度Intensity(单位：cps)，横座标是质荷比m/z)；

图3为帕立骨化醇检测限的HPLC-MRM色谱图(纵座标是强度Intensity(单位：cps)，横座标是时间(单位：min)，图4-图6坐标含义相同)；

图4为帕立骨化醇定量限的HPLC-MRM色谱图；

图5为帕立骨化醇软胶囊溶出度的HPLC-MRM色谱图；

图6为内标物度他雄胺的HPLC-MRM色谱图。

具体实施方式

以下参照附图对本发明的实施例进行详细描述，其中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件进行。

以下实施例的试验仪器、材料及测试条件如下：

(1)仪器：美国AppliedBiosystems公司API3000型高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪(Agilent1100色谱仪，APCI源，Analyst1.4.2质谱工作站)。

(2)材料：帕立骨化醇软胶囊购自重庆华邦制药有限公司，规格为2μg/粒；帕立骨化醇对照品购自USP对照品(含量99.6％)，度他雄胺购自重庆华邦制药有限公司(含量99.5％)。

(3)液相色谱-质谱条件：

色谱柱：AgilentXDB-C18柱(50mm×4.6mm，3.5μm)；

进样量：100μl；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；

流动相：乙腈-水-甲酸(体积比)为50:50:0.1；

内标物质：度他雄胺；

质谱仪的条件参数：离子源：API3000大气压力化学离子源(APCI)，采用正离子模式检测；干燥气：N2；离子化温度(TEM)为400℃，干燥气压力(Gas2)为75psi，雾化气(Gas1)为10，气帘气(CurtainGas)为10，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)5500V；雾化电流(NebulizerCurrent)为3μA；

帕立骨化醇MRM扫描参数：m/z399.6→273.4，DP25、CAD6.00、FP115、CE30、CXP8、EP10；

内标物(度他雄胺)MRM扫描参数：m/z529.8→461.5，DP30、CAD6.00、FP140、CE50、CXP15、EP10。

实施例1本发明测试方法的检测限和定量限的研究

精密称取帕立骨化醇对照品(含量98.6％)0.02516g，置250ml量瓶中，加无水乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；精密移取该溶液适量，以0.4％月桂基二甲基氧化胺溶液500ml(添加约10ng/ml的度他雄胺作为内标物)为溶出介质，定量稀释制成每1ml约含帕立骨化醇40pg和80pg的溶液。按照上述液相色谱-质谱条件，分别精密量取100μl，注入液相色谱仪，记录HPLC-MRM图谱。

如图3和图4所示，图3为帕立骨化醇检测限色谱图(其信噪比符合S/N＝3:1的要求)，图4为帕立骨化醇定量限色谱图(其信噪比符合S/N＝10:1的要求)。当帕立骨化醇溶液浓度为80pg/ml时，连续5针，RSD为2.25％，即能满足溶出量大于10％(即400pg/ml)时定量测定的要求。

实施例2本发明方法在帕立骨化醇软胶囊溶出度测定中的应用

采用上述液相色谱-质谱条件，其中样品溶液制备过程如下：取帕立骨化醇软胶囊1粒，以0.4％月桂基二甲基氧化胺溶液500ml(添加约10ng/ml的度他雄胺作为内标物)为溶出介质，转速为每分钟100转，依转篮法操作。经20、30、45、60分钟时，取溶出液适量，用0.45μm有机膜滤过，取续滤液作为样品溶液。另取帕立骨化醇对照品储备溶液适量，用前述同样的溶出介质定量稀释制成每1ml中约含帕立骨化醇4ng的溶液，作为对照品溶液。

按照上述液相色谱-质谱条件，分别取样品溶液和对照品溶液各100μl，上LC-MS/MS进行检测，记录HPLC-MRM色谱图。分别将帕立骨化醇峰面积和度他雄胺峰面积带入下面公式进行计算：

A_对主：对照品溶液中主峰面积

A_样主：样品溶液中主峰面积

A_对内：对照品溶液中内标物峰面积

A_样内：样品溶液中内标物峰面积

C_对主：对照品溶液帕立骨化醇浓度，ng/ml

最后得到，样品20、30、45、60分钟的溶出度分别为62％、85％、96％、100％。如图5和图6所示，图5为帕立骨化醇软胶囊45分钟溶出度的HPLC-MRM色谱图，图6为内标物质度他雄胺的HPLC-MRM色谱图。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱-串联质谱法进行测定。

2.根据权利要求1所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：所述测定采用内标法，用度他雄胺作为内标物。

3.根据权利要求2所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：所述质谱采用多重反应监测模式，帕立骨化醇和度他雄胺分别采用至少一对母离子及子离子的组合进行定量监测。

4.根据权利要求3所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：所述帕立骨化醇采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为399.6±1，子离子m/z为273.4±1。

5.根据权利要求3或4所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：所述度他雄胺采用的母离子及子离子的组合为：母离子m/z为529.8±1，子离子m/z为461.5±1。

6.根据权利要求1至3任一项所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：

所述液相色谱采用的条件包括：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，50×4.6mm，3.5μm；

流动相：乙腈-水，体积比为50:50；并添加适量有机酸或者挥发性有机酸盐；

进样量：50-100μl；

所述质谱采用的条件包括：

离子源：API3000大气压力化学离子源(APCI)，采用正离子模式检测；干燥气：N₂；离子化温度(TEM)为400℃，干燥气压力(Gas2)为75psi，雾化气(Gas1)为10，气帘气(CurtainGas)为10，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)为5500V；雾化电流(NebulizerCurrent)为3μA；

帕立骨化醇化合物参数：母离子m/z为399.6，子离子m/z为273.4，去簇电压(DP)25V，聚焦电压(FP)115V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)30V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)8V；

内标物化合物参数：母离子m/z为529.8，子离子m/z为461.5，去簇电压(DP)30V、聚焦电压(FP)140V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)50V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)15V。

7.根据权利要求6所述的低含量帕立骨化醇的测定方法，其特征在于：所述有机酸为甲酸和/或乙酸，体积百分比为0.05％-0.15％；所述挥发性有机酸盐为甲酸铵和/或乙酸铵，浓度为5-20mmol/L。

8.权利要求1-7任一项所述低含量帕立骨化醇的测定方法在帕立骨化醇制剂的溶出度测试中的应用。

9.一种测定帕立骨化醇软胶囊溶出度的方法，其特征在于：

以含0.4％月桂基二甲基氧化胺(LADO)的溶液为溶出介质，采用转篮法采集样品溶液；采用内标法，以度他雄胺为内标物，用高效液相色谱三重四极杆串联质谱联用仪进行测定；

测试参数的设置包括：

液相色谱仪：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱，50×4.6mm，3.5μm；

流动相：乙腈-水，体积比为50:50；并添加有机酸，使其体积百分比为0.05％-0.15％；或者添加挥发性有机酸盐，使其浓度为5-20mmol/L；

进样量：50-100μl；

质谱仪：

离子源：API3000大气压力化学离子源(APCI)，采用正离子模式检测；干燥气：N₂；离子化温度(TEM)为400℃，干燥气压力(Gas2)为75psi，雾化气(Gas1)为10，气帘气(CurtainGas)为10，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)为5500V；雾化电流(NebulizerCurrent)为3μA；

帕立骨化醇化合物参数：母离子m/z为399.6，子离子m/z为273.4，去簇电压(DP)25V，聚焦电压(FP)115V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)30V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)8V；

内标物化合物参数：母离子m/z为529.8，子离子m/z为461.5，去簇电压(DP)30V、聚焦电压(FP)140V，入口电压(EP)10V，碰撞能量(CE)50V，碰撞气(CAD)6，碰撞室射出电压(CXP)15V。

10.度他雄胺作为内标物在高效液相色谱法或者高效液相色谱-串联质谱法测定帕立骨化醇含量中的应用。