CN110031568A - 一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法 - Google Patents

一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测人血浆中药物浓度的方法，以甲醇蛋白沉淀法对样品进行前处理，并进行进一步稀释，应用超高效液相色谱串联质谱进行检测。本发明提供的方法可以同时检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，且对色谱柱和仪器损害小。

Description

一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度 的方法
技术领域
本发明涉及检测人血浆中药物浓度的方法。具体而言，本发明涉及一种通过超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦浓度的方法。
背景技术
沙库巴曲缬沙坦钠，适用于射血分数降低的慢性心力衰竭(NYHA Ⅱ-Ⅳ级，LVEF≤40％)成人患者，能降低心血管死亡和心力衰竭住院的风险。另外，沙库巴曲缬沙坦钠可代替血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，可与其他心力衰竭治疗药物合用。沙库巴曲缬沙坦钠是一种首创的双效血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂，具有独特的作用模式，能够增强心脏的保护性神经内分泌系统(钠尿肽系统)，抑制有害系统(肾素-血管紧张素-醛固酮系统)，同时表现出了超越常规药物的更高安全性。口服给药后，沙库巴曲缬沙坦钠以沙库巴曲(脑啡肽酶抑制剂前药)：缬沙坦＝1:1的比例分布于全身，然后沙库巴曲迅速被非特异性酯酶代谢为活性的脑啡肽酶抑制剂—去乙基沙库巴曲。
为同时检测人体血浆当中沙库巴曲(AHU377)、去乙基沙库巴曲(LBQ657)和缬沙坦(Valsartan)的量，现有技术开发了一系列检测方法。
Mizuki Akahori等发表的文章(Pharmacokinetics after single ascendingdose,food effect,and safety of sacubitril/valsartan(LCZ696，),an angiotensinreceptor and neprilysin inhibitor,in healthy Japanese subjects.[J]Eur J DrugMetab Pharmacokinet,2016.)，应用液液萃取处理血浆样品，并采用HPLC-MS/MS检测AHU377、LBQ657和Valsartan三种物质。该方法虽然可以检测三种物质，但是前处理方法毒性较大，对技术人员造成较大的伤害且处理过程较为繁琐。且流动相采用0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈，甲酸量较大,长期使用对色谱柱有较大损害。
Raja Harandha等发表的文章(Development and validation of a reliableand rapid LC-MS/MS method for simultaneous quantification of sacubitril andvalsartan in rat plasma and its application to a pharmacokinetic study.[J]Biomedical Chromatography,2016.)，采用甲酸-乙腈蛋白沉淀法，并采用UPLC-MS/MS检测大鼠血浆样品中的沙库巴曲和缬沙坦。该方法虽然采用蛋白沉淀法，但是并未对处理后的样品进行稀释，后续一方面会对色谱柱造成较大破坏，也会因为样品中的杂质较多对液相系统和质谱造成堵塞。流动相为0.1％甲酸水-0.1％甲酸乙腈且采用梯度洗脱的方式，甲酸的量也会对色谱柱造成较大的破坏，梯度洗脱的方式也不稳定。并且本方法仅检测了AHU377和Valsartan两种物质。
目前，现有技术中缺乏一种可以快速检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，并对仪器设备和技术人员友好的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种新的检测方法，该方法可以同时检测沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦三种物质，操作简单，毒性小，样品前处理后进一步稀释对色谱柱和仪器损害小，采用等度洗脱即可实现分析物有效分离，色谱系统也更加稳定。
本发明的目的是提供一种同时检测人血浆样品中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度的方法：
样品前处理：甲醇蛋白沉淀法；
样品前处理后稀释进样的稀释剂：70％～90％甲醇水；
稀释比例：1:3～1:7；
检测仪器：超高效液相色谱串联质谱；
色谱柱：Waters Atlantis C18，规格为2.1mm×100mm，3.0μm；
流动相：乙腈-0.1％甲酸水；
流动相的体积比：50:50～65:35；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.2ml/min～0.6ml/min；
柱温：15℃～25℃；
进样量：5μL～10μL
质谱：使用电喷雾离子源，三重四级杆检测器，正离子多反应监测。
本发明优选方案，甲醇蛋白沉淀法中，血浆样品与甲醇体积比为1:2～1:4，优选1:2。体积比的范围都满足实验需要，优选的体积比加入有机溶剂量最小，之后进样得到的色谱峰，峰型最合适，响应信号最好。
本发明优选方案，内标为分析物的氘代衍生物，优选沙库巴曲-d4、缬沙坦-d3和去乙基沙库巴曲-d4。优选方案的内标容易购买，价格实惠。
本发明优选方案，稀释剂优选80％甲醇水，样品溶液和稀释剂的稀释体积比为1:5。发明人发现80％的甲醇水，稀释体积比1:5，得到的色谱峰峰型最好。
本发明优选方案，流动相乙腈-0.1％甲酸水的体积比是60:40。发明人发现甲酸含量增加可以提高响应值，但是很大程度上会减少色谱柱及液相和质谱系统的使用寿命。优选的流动相的比例即响应信号和峰型最好，也在仪器和色谱柱的耐受范围。
本发明优选方案，流速为0.4ml/min。优选流速，出峰时间在3min以内，既能使分析物彻底分离，也不会因为出峰时间过快或过慢影响分析需要。
本发明优选方案，柱温为20℃。
本发明优选方案，进样量为5μL。
本发明的检测方法与现有技术相比具有以下优势：
(1)样品前处理简单，低毒。
采用甲醇蛋白沉淀法，之后甲醇水稀释峰型良好，响应信号较高，溶剂使用量小，操作简单，毒性低，更适合大批量检测样品。
(2)对色谱柱和仪器损害小。
一方面：甲醇蛋白沉淀法并未加入酸，不会对色谱柱造成损伤。样品处理之后进一步经过稀释进样检测，所得峰型响应高、峰型良好，长期且大批量检样，不会堵塞色谱柱和仪器，对仪器损害小。
另一方面：发明人发现甲酸含量增加可以提高响应值，但是很大程度上会减少色谱柱及液相和质谱系统的使用寿命，尤其对价格昂贵的质谱有较大影响。本发明流动相的比例既可以提高响应信号，也在仪器和色谱柱的耐受范围。
(3)内标更合适。
理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同的或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。就本领域技术人员而言，分析物的氘代衍生物与分析物相比，基本的理化性质相同，仅分子量有差别，是最佳的内标物质。
(4)对本方法的专属性、标准曲线、精密度和准确度、提取回收率、基质效应与稳定性进行了验证，均符合药典规定。本发明所述方法已成功应用于临床药代动力学研究。
附图说明
图1-1：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。
图1-2：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-LBQ657。
图1-3：稀释剂为80％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-Valsartan。
图2-1：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。
图2-2：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-LBQ657。
图2-3：稀释剂为纯水时高效液相质谱MRM色谱图-Valsartan。
图3-1：稀释剂为50％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-AHU377。
图3-2：稀释剂为50％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-LBQ657。
图3-3：稀释剂为50％甲醇水时高效液相质谱MRM色谱图-Valsartan。
图4-1-A：AHU377—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图4-1-B：AHU377-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图4-2-A：LBQ657—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图4-2-B：LBQ657-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图4-3-A：Valsartan—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图4-3-B：Valsartan-d3—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆(样品前处理过程中不加内标)。
图5-1-A：AHU377—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图5-1-B：AHU377-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图5-2-A：LBQ657—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图5-2-B：LBQ657-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图5-3-A：Valsartan—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图5-3-B：Valsartan-d3—典型高效液相质谱MRM色谱图—空白血浆。
图6-1-A：AHU377—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图6-1-B：AHU377-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图6-2-A：LBQ657—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图6-2-B：LBQ657-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图6-3-A：Valsartan—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图6-3-B：Valsartan-d3—典型高效液相质谱MRM色谱图—标准曲线第四个浓度点血浆。
图7-1-A：AHU377—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图7-1-B：AHU377-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图7-2-A：LBQ657—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图7-2-B：LBQ657-d4—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图7-3-A：Valsartan—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图7-3-B：Valsartan-d3—典型高效液相质谱MRM色谱图—空腹给药1.75小时后血浆。
图8-1-A：分析物AHU377的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～72h。
图8-1-B：分析物AHU377的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～5h。
图8-2-A：分析物LBQ657的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～72h。
图8-2-B：分析物LBQ657的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～5h。
图8-3-A：分析物Valsartan的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～72h。
图8-3-B：分析物Valsartan的临床药代动力学研究的平均药物浓度-时间半对数曲线—采集时间0～5h。
其中，图8-1-A到图8-3-B中的T为受试制剂，R为参比制剂。
具体实施方式
为了更加清楚的对本发明进行说明，以下通过具体实施实例对本发明的具体实施方式进行更为详细的说明。但是应该理解，以下所述具体实施实例仅用于本发明进行示例性说明，而非用于本发明进行任何性质限定，其中所用材料、试剂、仪器、及操作条件仅为代表性的，其并不限于所列举的情况。所述技术领域的技术人员通过阅读以下说明可以对本发明做出不脱离本发明权利要求所限定的保护范围的改动和改进，这些改动和改进也处于本发明所要求保护的范围内。
1、试剂和药品
沙库巴曲(石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司，纯度93.66％)；
缬沙坦(中国食品药品检定所，纯度98.5％)；
去乙基沙库巴曲(TRC，纯度98.97％)；
沙库巴曲-d4(TRC，纯度95.6％)；
缬沙坦-d3(TRC，纯度97.5％)；
去乙基沙库巴曲-d4(TRC，纯度92.5％)；
乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，水为纯净水；
受试制剂：沙库巴曲缬沙坦钠片(石药集团欧意药业有限公司)，参比制剂：(Novartis Singapore Pharmaceutical Manufacturing Pte.Ltd)。
2、实验仪器
液相色谱仪：岛津液相色谱(包括ExionLC Degasser在线脱气机，ExionLC ADMultiplate Autosampler自动进样器，ExionLC AD Pump液相色谱泵，ExionLC AC ColumnOven柱温箱)。
质谱：AB公司的TRIPLE QUAD 5500型三重四极杆串联质谱仪(配有电喷雾离子化ESI源、Analyst 1.6.3软件)。电喷雾电离(ESI)，正离子模式，多反应检测模式(MRM)。
3、溶液的配制
分别精密称取适量沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦对照品，经质量校正系数校正后，分别将其溶于100％甲醇中，得到最终浓度为1.00mg·mL-1的贮备液，-20℃保存。
精密量取贮备液适量，用人白血浆逐步稀释为如下所示的系列浓度标准曲线血浆样品：
(1)沙库巴曲浓度为：5，12.5，25，75，250，750，2500，5000ng·mL-1；
(2)去乙基沙库巴曲浓度为：10，25，50，150，500，1500，5000，10000ng·mL-1；
(3)缬沙坦浓度为：10，20，50，100，300，1000，3000，10000，20000ng·mL-1。
(4)内标溶液：分别精密称取适量沙库巴曲-d4、去乙基沙库巴曲-d4、缬沙坦-d3对照品，经质量校正系数校正后，分别将其溶于100％甲醇中，得到最终浓度为1.00mg·mL-1的储备液，-20℃保存。临用前分别用甲醇进一步稀释为0.75μg·mL-1(AHU377-d4)、1.50μg·mL-1(LBQ657-d4)、3.00μg·mL-1(Valsartan-d3)的内标溶液。
4、方法学验证
参照2015年《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》，对检测方法进行验证，验证内容包括专属性、标准曲线、精密度和准确度、提取回收率、基质效应、稳定性。
具体实施例如下：
实施例1：血浆样品中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦的测定
液相条件：流动相：乙腈-0.1％甲酸水溶液(v/v，60:40)，流速：0.4ml/min，柱温和样品室温度均为20℃。
质谱条件：用AB公司的TRIPLE QUAD 5500型三重四极杆串联质谱仪(配有电喷雾离子化ESI源、Analyst 1.6.3软件)。电喷雾电离(ESI)，正离子模式，多反应检测模式(MRM)，喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，气帘气：35psi，雾化气：45psi，辅助气：40psi。离子对、驻留时间等如下：
表1.分析物和内标的质谱信息
血浆样品前处理：精密吸取血浆样品(标准曲线第四个浓度点血浆样品)100μL，置2ml塑料离心管中，精密加入内标溶液100μL和甲醇200μL，涡旋，离心(10000×g)5min后，取上清液100μL置另一2ml塑料离心管中。
稀释过程：在样品前处理得到的100μL上清液样品中加入80％甲醇水500μL进行稀释，涡旋，取5.0μL进样分析，记录色谱图，见图1-1～图1-3。由图可以看出，本发明检测方法，峰型良好。
实施例2：不同稀释剂的影响实验
按实施例1方法进行检测，当其他实验条件均相同，分别用不同稀释剂：纯水、50％甲醇水对样品前处理得到的100μL上清液进行稀释，分别进样分析，记录色谱图，见图2-1～图3-3。由色谱图可以看出当稀释剂为实施例1时所用的80％甲醇水时，峰型最好。
实施例3：方法学验证—专属性实验
取空白血浆(样品前处理过程中不加内标)、空白血浆、标准曲线第四个浓度血浆样品、空腹给药后1.75小时收集的血浆，均按实施例1项下方法处理分析，记录色谱图，分别见图4-1-A～图7-3-B。
其中，AHU377保留时间为1.37min，LBQ657保留时间为0.97min，Valsartan保留时间为1.18min，3min内出峰结束，且血浆中的杂质不干扰测定(空白血浆的图5-1-A中，色谱图存在分析物AHU377，是因为内标不纯，但含量较低并不影响后续对AHU377的检测)，本法专属性良好。
实施例4：方法学验证—标准曲线实验
分别取沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦的标准曲线血浆样品，按实施例1项下方法操作，进样测定，记录峰面积。分别以沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度为横坐标，峰面积之比为纵坐标，采用加权(1/x2)最小二乘法进行回归，得回归方程分别为R＝0.000653c+0.00108(r＝0.9994)、R＝0.00128c+0.00185(r＝0.9985)、R＝0.000273c+0.000262(r＝0.9992)。
结果表明，人血浆中沙库巴曲在5.00～5000ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，最低定量限为5.00ng·mL-1；去乙基沙库巴曲在10.0～10000ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，最低定量限为10.0ng·mL-1；缬沙坦在10.0～20000ng·mL-1浓度范围内线性关系良好，最低定量限为10.0ng·mL-1。
实施例5：方法学验证—准确度和精密度实验
分别配制以下浓度水平的标准曲线血浆样品，沙库巴曲浓度为：5ng·mL-1、12.5ng·mL-1(低)、250ng·mL-1(中)、4000ng·mL-1(高)，去乙基沙库巴曲浓度为：10ng·mL-1、25ng·mL-1(低)、500ng·mL-1(中)、8000ng·mL-1(高)，缬沙坦浓度为：10ng·mL-1、20ng·mL-1、50ng·mL-1(低)、1000ng·mL-1(中)、16000ng·mL-1(高)。上述溶液各配制6份，重复3批，并作随行标准曲线。与配制浓度对照，采用单因素方差分析法求得本法的精密度与准确度，结果见表2。沙库巴曲的日内RSD≤2.2％，日间RSD≤1.8％；去乙基沙库巴曲的日内RSD≤4.3％，日间RSD≤3.9％；缬沙坦的日内RSD≤2.9％，日间RSD≤2.6％，均符合药典规定。
表2.人血浆中AHU377、LBQ657、Valsartan的准确性和精密度结果/％(n＝6)
实施例6：方法学验证—提取回收率和基质效应实验
取空白人血浆100μL加入甲醇200μL，涡旋30s，离心(10000×g)5min，取上清液即得血浆基质样品溶液。按实施例5项下方法分别配制低、中、高浓度血样，同时配制流动相样品溶液(用流动相稀释配制所得)，各6份，按实施例1项下方法处理，分别进样并记录峰面积。计算结果见表3，提取回收率和基质效应数据均符合药典规定。
表3.分析物的提取回收率和基质效应数据
实施例7：方法学验证—稳定性实验
按实施例5项下方法分别制备沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦的低、中、高浓度质控样品，考察样品在室温放置4小时、预处理后自动进样器放置24小时、-70℃冻融循环3次稳定性。
结果表明，沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦在上述条件下所测得样品浓度与新鲜制备的样品浓度数据相比，偏差均小于15％，表明沙库巴曲、去乙基沙库巴曲和缬沙坦在上述条件下均可保持稳定。
实施例8：临床药代动力学实验
12名中国成年健康受试者，采用单中心、随机、开放、两周期、两制剂、自身交叉、单次给药的试验设计(两周期之间清洗期为7天)，比较两制剂的药代动力学行为。
在试验前前一天入住研究病房，至少给药前10h禁食，不禁水过夜，次日早晨空腹、单次口服沙库巴曲缬沙坦钠片1片(200mg/片)，在给药前0h(给药前1h内)和给药后0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1.0h、1.25h、1.5h、1.75h、2.0h、2.25h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、5.0h、6.0h、7.0h、8.0h、10.0h、12.0h、24.0h、36.0h、48.0h、72.0h，共25个时间点采集静脉血4mL，经EDTA-K2抗凝后，1h内在2～8℃条件下离心(1700×g)10min，分离血浆，-70℃冻存。药后4h后统一进食标准午餐，给药后10h后统一进食标准晚餐，给药前和给药后1h禁止饮水，整个试验期间按照医院的标准餐饮食。
测定时按实施例1项下方法处理后进样分析，平均血药浓度-时间半对数曲线图见图8-1-A～图8-3-B。数据通过Phoenix Winnonlin 8.0软件计算，主要药动学参数见表4。
表4人体主要药代动力学参数(x±s，n＝12)
注：R为参比制剂，T为受试制剂。
结论：本方法的专属性、标准曲线、精密度和准确度、提取回收率、基质效应与稳定性均符合中国药典规定，并且本发明所述方法已成功应用于临床药代动力学研究。

Claims (10)

1.一种测定人血浆中沙库巴曲、去乙基沙库巴曲、缬沙坦浓度的方法，其特征在于：
样品前处理：甲醇蛋白沉淀法；
样品前处理后稀释进样的稀释剂：70％～90％甲醇水；
稀释进样的体积比：1:3～1:7；
检测仪器：超高效液相色谱串联质谱；
色谱柱：Waters Atlantis C18，规格为2.1mm×100mm，3.0μm；
流动相：乙腈-0.1％甲酸水；
流动相的体积比：50:50～65:35；
洗脱方式：等度洗脱；
流速：0.2ml/min～0.6ml/min；
柱温：15℃～25℃；
进样量：5μL～10μL；
质谱：使用电喷雾离子源，三重四级杆检测器，正离子多反应监测。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述甲醇蛋白沉淀法中，血浆样品与甲醇体积比为1:2～1:4，优选1:2。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所用内标为分析物的氘代衍生物，优选沙库巴曲-d4、缬沙坦-d3和去乙基沙库巴曲-d4。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：稀释进样所用稀释剂为80％甲醇水。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：稀释进样时样品溶液与稀释剂的稀释比例为1:5。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：流动相乙腈-0.1％甲酸水的体积比是60:40。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：流速为0.4ml/min。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：柱温为20℃。
9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：进样量为5μL。
10.权1～9任一所述的测定方法在沙库巴曲缬沙坦钠临床药代动力学研究中的应用。
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