CN115144505A - Uplc-ms/ms法同时测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种UPLC‑MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，应用超高效液相色谱‑质谱联用(UPLC‑MS/MS)同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657的浓度，前处理采用乙腈作为沉淀剂，并进一步稀释进样；进样量比较少大大降低对仪器的污染；该方法应用了梯度洗脱的方式，并解决了化合物的残留；与现有文献相比，尿液样本量为50μL，对于终末期肾衰患者，收集临床样本容易，实验方法更加友好。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测人尿液中药物浓度的方法，具体涉及一种 UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物 LBQ657浓度的方法。
背景技术
我国高血压合并慢性肾脏病(CKD)降压现状不容乐观，超过50％的患者联合使用降压药，但血压达标率仅15％。心脑血管疾病是透析患者死亡的首位原因，透析患者合并心衰的比例高达45％以上，但是透析合并心衰的患者生存率显著下降，危害加剧。
沙库巴曲/缬沙坦(LCZ696，商品名诺欣妥)是一种双重的血管紧张素受体拮抗剂(ARB)和脑啡肽酶抑制剂(NEPi)，一种由沙库巴曲和缬沙坦以1:1摩尔比形成的钠盐复合物。研究表明LCZ696在慢性肾脏病患者中的降压效果、心血管及肾脏中的保护作用。LCZ696经口服后，沙库巴曲和缬沙坦迅速被吸收并分解为沙库巴曲和缬沙坦，沙库巴曲迅速转化为LBQ657(NEPi的活性代谢物)，且沙库巴曲和缬沙坦主要通过肾脏途径排泄。但是研究的病人肾小球滤过率均大于30ml/min/1.73m2。目前尚无LCZ696在终末期肾衰病人的尿液药代动力学的研究。以及沙库巴曲和缬沙坦在健康人尿液中的回收率已有报道，在经腹膜透析的终末期肾病患者尿液中的回收率尚不清楚。
现有Jimmy Flarakos等发表[Disposition and metabolism of[(14)C]Sacubitril/Valsartan(formerly LCZ696)an angiotensin receptor neprilysininhibitor,in healthy subjects(文献1)]发现13％的缬沙坦，0.8～2.8％的沙库巴曲，52～68％的LBQ657通过尿液排泄，本专利方法的用途为慢性肾病终末期的患者，其特点一是有无残存肾功能导致三个化合物的排泄差异大，加上病人个体间的尿液排泄量差异也大，导致三个化合物的线性范围难以预测；二是三个化合物的线性范围差异相比于健康人来说进一步加大，因为肾功能不全患者不影响缬沙坦以及沙库巴曲的AUC，但是LBQ657的半衰期从健康人的12小时分别延长到38.5小时，AUC提高了2.70倍，可能出现缬沙坦和沙库巴曲的LLOQ的信噪比低，而LBQ657的灵敏度已经饱和(进样相同的量，其中缬沙坦的响应比沙库巴曲低了5倍，比LBQ657的低了2倍)的情况，这对于同时测定三个化合物的难度进一步加大；三是缬沙坦、沙库巴曲和 LBQ657能够与尿液蛋白高度结合，结合率为94％～97％，终末期肾衰患者易出现蛋白尿，导致尿液中游离药物的浓度更低，更进一步对灵敏度提出了更高的需求。
Surya P.Ayalasomayajula等发表的文章[Effect of renal function on thepharmacokinetics of LCZ696(sacubitril/valsartan),an angiotensin receptorneprilysin inhibitor，(文献2)]采用了HPLC-MS/MS法测定了尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的浓度，其给药方案是给药400mg，每天一次，线性范围均为10～10000ng/mL。该文献给药剂量比慢性肾病终末期的推荐剂量(50 mg)高了8倍，并且SuryaP.Ayalasomayajula等也发现缬沙坦以及沙库巴曲的稳态Cmax与肾功能无关，故该文献的定量下限并不能满足需求。而且该文献采用了HPLC-MS/MS法，由于使用色谱柱进行分离耗费时间较长、灵敏度较低，并不适用于快速、高通量的生物样品分析。另外，UPLC-MS/MS应用梯度洗脱时极容易残留，冯仕银等人发表的文章[LC-MS/MS法测定人血浆及尿液中缬沙坦的浓度及其药动学研究(文献3)]采用了LC-MS/MS法,但并没有解决残留问题，并且残留物主要是残留在进样阀，为了解决残留，对流动相性质及其起始比例，洗针液及其洗针程序，进样阀的转动等提出了更高要求。
CN110031568A(文献4)使用的内标缬沙坦-d3，内标与待测物只相差3 个质量数，彼此之间的干扰大；Levi
等人发表的文章[Direct analysis of valsartan orcandesartan in human plasma and urines by on-line solid phase extractioncoupled to electrospray tandem mass spectrometry(文献5)]采用了在线固相萃取法测量尿液中缬沙坦的浓度，样品无需人工处理但是试剂消耗多，批间的重复性难以保证。冯仕银等发表的[LC-MS/MS法测定人血浆及尿液中缬沙坦的浓度及其药动学研究(文献6)]采用乙腈蛋白沉淀法，并采用 HPLC-MS/MS检测人尿液样品中的缬沙坦，进样量为15μL。该方法虽然采用蛋白沉淀法，但是并未对处理后的样品进行稀释，并且进样量比较大，后续一方面会对色谱柱造成较大破坏，也会因为样品中的杂质较多对液相系统和质谱造成堵塞。以及Javed ShaikhAfzal Shaikh等发表的[High performance liquid chromatographicassay of amlodipine,valsartan and hydrochlorothiazide simultaneously and itsapplication to pharmaceuticals,urine and plasma analysis (文献7)]采用高效液相色谱-紫外检测器，但该分析方法的线性范围窄，紫外检测器专属性差，仅用于测定特定时间段多种药物联合用药时的缬沙坦浓度。
因此，目前已有的检测人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657浓度的方法并不适用于慢性肾衰患者临床药代动力学研究的样本检测。本领域急需能够用于检测慢性肾病终末期患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的浓度的快速灵敏的方法，同时还需解决残留问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，解决了不能快速灵敏地同时检测慢性肾病终末期患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657浓度的问题。本发明应用了梯度洗脱的方式，并解决了化合物的残留，而且进样量比较少大大降低对仪器的污染。
为了达到上述目的，本发明提供了一种UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，该方法针对的是慢性肾病终末期患者尿液样品；该方法包含：采用乙腈蛋白沉淀法对样品进行前处理，样品前处理后采用等体积的稀释剂进行稀释，其中所述稀释剂为50％乙腈-0.1％甲酸水(体积百分数)；采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测：温度：40℃，流动相：A相0.1％甲酸水溶液，B 相是体积比为50:50:0.2的甲醇-乙腈-甲酸，洗脱方式：梯度洗脱。
其中洗脱梯度洗脱条件：
0min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；
1.50min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量80％；
2.00min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量98％；
2.60min时，流动相流速为0.3mL/min，冲洗自动进样器高压阀；
2.61～3.00min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量98％；
3.01min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量65％；
3.51min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；
4.00min时，流动相流速为0.3mL/min，停止进样。
所述的流动相B相的含量是体积百分数；A相的含量为1-B相含量。在反相色谱柱起始梯度设置成65％的B相，是让目标化合物有保留；0-1.5min 流动相B相梯度的上升是将目标化合物缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657洗脱出来；1.50-3min 98％的B相是将色谱柱脂溶性的杂质洗脱出来，3.01-4min的 B相恢复成起始梯度65％，是为了平衡色谱柱。
所述的超高效液相色谱串联质谱中，高效液相色谱仪是岛津LC-30AD 超高效液相色谱，串联质谱仪是日本岛津公司8060型串联质谱仪。
优选地，所述的高效液相色谱仪，色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18，规格为2.1mm×50mm，1.7μm。
优选地，所述的高效液相色谱仪，配有自动进样器，该自动进样器为 SIL-30AC HT自动进样器。
优选地，所述的所述串联质谱仪，配有Turbo Ionspray离子源以及 LabSolutions6.70数据处理系统。
优选地，所述的所述串联质谱仪，辅助数据处理软件为Microsoft Office。
优选地，所述的自动进样器温度设为15℃。
优选地，所述的超高效液相色谱串联质谱的进样溶剂含有机相比例超过了75％。该进样溶剂中含有的机相比例指的是样品沉淀离心后取上清与稀释剂等比例混匀之后的有机相体积百分含量，样品沉淀离心后上清液的有机相含量几乎是100％。在反相高效液相色谱的使用过程中，如果采用梯度洗脱，则进样溶剂有机相的比例要求高于流动相有机相的初始比例，不然会有严重的溶剂效应，导致色谱峰变形。
所述的超高效液相色谱串联质谱，在洗针时，解决残留的洗针程序为：洗针液R0及外置泵R3连通的溶液均为甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸 (25:25:25:25:1,v/v)，洗针程序为洗针液R0清洗进样针的外壁，进样前后各润洗3s，洗针速度35μL/s，洗针体积500μL，外置泵R3的程序为清洗泵->清洗进样口，用于进一步在进样前后清洗进样针的外壁。所述的清洗泵-> 清洗进样口的具体操作就是在液相采集方法中自动进样器洗针程序中增设外置泵R3用来在进样前后清洗进样针的外壁。
所述的超高效液相色谱串联质谱的分析中所用内标为待分析物的氘代衍生物，选用缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ657-d4。
所述的超高效液相色谱串联质谱的进样量为4μL。所述的进样量是尿液样本经过蛋白沉淀并稀释处理后进样到液质联用仪器分析所用的量。
本发明提供了一种所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法在缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657临床药代动力学研究中的用途。
本发明的一种UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，解决了不能快速灵敏地同时检测慢性肾病终末期患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657浓度的问题。具有以下优点：
1、本发明前处理采用乙腈作为沉淀剂，并进一步稀释进样，采用1：1 稀释比例，进样量仅为4μL，大大降低了对仪器的污染。
2、本发明与现有文献相比，尿液样本量(前处理过程中每一个样本的尿液用量)为50μL，对于终末期肾衰患者，收集临床样本容易，实验方法更加友好。
3、本发明使用内标缬沙坦-d9，可以大大减少缬沙坦与内标之间的干扰。
4、传统的尿液检测方法存在明显的缬沙坦残留，本发明采用外置泵洗涤进样针、增加自动进样器高压阀的冲洗与梯度洗脱结合的办法，初始有机相得比例由40％提高到65％。
5、本发明所测量的为腹膜透析患者尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657 浓度，由于患者具有慢性肾病，导致三个化合物的代谢周期延长，药物的峰值浓度更大，因而具有更大的线性范围。
6、本发明应用于终末期肾病患者的尿液分析，分析腹膜透析对药物的代谢的影响以及腹膜透析患者肾功能对药物清除的影响，定量上限进一步提高。
附图说明
图1为本发明缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲 -d4和LBQ-d4的二级全扫描质谱图一。图中(A)缬沙坦、(B)沙库巴曲、 (C)LBQ657。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
图2为本发明缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲 -d4和LBQ-d4的二级全扫描质谱图二。图中(D)缬沙坦-d9、(E)沙库巴曲 -d4、(F)LBQ657-d4。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
图3为本发明UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图一。图中，A：空白尿液；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
图4为本发明UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图二。图中，B：加标空白尿液；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
图5为本发明UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图三。图中，C：给药尿液样品；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。横坐标：时间；纵坐标：强度。
图6为本发明方法验证阶段代表性标准曲线图。图中(A)缬沙坦；(B) 沙库巴曲；(C)LBQ657。横坐标：待测物的浓度；纵坐标：待测物与内标的峰面积比。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明以下实验例中使用的实验药品、材料、试剂以及分子结构式：
1、药品及试剂名称
2、结构式
LCZ696由沙库巴曲和缬沙坦组成，缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657以及本发明中使用的内标物质缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ-d4的化学结构式分别为以下式A、式B、式C、式D、式E和式F。
实验例1工作液的制备
1、工作液稀释剂，其制备方法包括：
在200mL溶剂瓶中加入50mL甲醇、50mL水，超声混匀后于室温下储存，标记为溶剂D。
2、缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657混合标准曲线系列工作液，其制备方法包括：
(1)取缬沙坦(XST)、沙库巴曲(SKB)和LBQ657(LBQ)分别用甲醇、DMSO、DMSO配制成1.00mg/mL缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的储备液，转移至透明聚丙烯管中-40℃冰箱冷冻保存。
(2)将步骤(1)中配成的缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657储备液用50％甲醇(溶剂D)按表1所示稀释成下列浓度的标准系列工作液，并在-40℃条件下储存备用。
3、缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657质控工作液，其制备方法与标准系列工作液的过程基本相同，区别在于：
在步骤(2)中，将步骤(1)中配成的缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657储备液用50％甲醇(溶剂D)按表2所示稀释成下列浓度的质控样品工作液，并在 -40℃条件下储存备用。
4、内标工作液，其制备方法包括：
(1)精密称取缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ-d4(内标)分别用甲醇、 DMSO、DMSO溶解配成浓度为1.00mg/mL缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ-d4的储备液。
(2)将步骤(1)中配成的缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ657-d4储备液用乙腈按表3所示稀释成下列浓度的内标工作溶液，-40℃冰箱冷冻保存。
实验例2尿液样品前处理
1、空白尿液样品，其制备方法包括：
(1)取空白人尿液(健康人的尿液)50μL，置于1.5mL聚丙烯管中，加入乙腈150μL，室温涡旋2min制得样品。
(2)将步骤(1)中制得的样品于室温下在转速为14000rpm下离心5 min，转移50μL上清液至另一干净的聚丙烯管中，用50μL 50％乙腈含0.1％甲酸将上清液稀释，再涡旋1min混匀，得到用于进行UPLC-MS/MS分析测定的溶液。
2、零点尿液样品，其制备方法与空白尿液样品的过程基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，取空白人尿液50μL，置于1.5mL离心管中，加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合2min制得样品。
3、标准曲线样品，其制备方法与空白尿液样品的过程基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，取实验例1制备的10μL标准系列工作液加至190μL 空白人尿液中，分别配制成缬沙坦/沙库巴曲/LBQ657浓度为2.00/1.00/20.0、4.00/2.00/40.0、10.0/5.00/100、25.0/12.5/250、100/50.0/1000、250/125/2500、 500/250/5000、1000/500/10000ng/mL的混合标准尿液样品；混匀后，再分别取该标准尿液样品50μL，加入150μL内标工作液，涡流混合2min制得样品。
4、质控尿液样品，其制备方法与空白尿液样品的过程基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，取实验例1制备的10μL质控工作液加至190μL空白人尿液中，分别配制成缬沙坦/沙库巴曲/LBQ657浓度为2.00/1.00/20.0、 6.00/3.00/60.0、50.0/25.0/500、750/375/7500ng/mL的混合质控尿液样品，混匀后，再分别取该混合质控尿液样品50μL，加入150μL内标工作液，涡流混合2min制得样品。
5、未知尿液样品，其制备方法与空白尿液样品的过程基本相同，区别在于：
在步骤(1)中，取慢性肾病终末期患者服用诺欣妥后尿液样品50μL，置于1.5mL离心管中，加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合 2min制得样品。
实验例3测试尿液样品的稳定性
质控尿液样品的稳定性，其方法包括：
(1)取实验例1制备质控样品工作溶液HQC\MQC\LQC三个水平的工作液 20μL，置于1.5mL离心管中，加入380μL空白人尿液，涡旋2min制备成缬沙坦、沙库巴曲、LBQ657的高、中、低三个浓度的尿液样品。
(2)将步骤(1)制备的尿液样品在室温下放置8小时后，加入实验例1 制备的150μL内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白尿液样品的步骤(2)制得样品，考察制得的样品室温放置8小时的稳定性；
(3)将步骤(1)制备的尿液样品加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白尿液样品的步骤(2)制得样品，考察制得的样品在自动进样器中放置30小时的稳定性；
(4)将步骤(1)制备的尿液样品加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白尿液样品的步骤(2)制得样品，考察制得的1个样品重复进样6次的稳定性；
(5)将步骤(1)制备的尿液样品先冻存在-80℃冰箱12小时后，取出在室温下融化，再储存在-80℃冰箱，如此重复5次后，取出，加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白尿液样品的步骤(2)制得样品，考察制得的样品循环冻融5次后的稳定性；
(6)将步骤(1)制备的尿液样品分别在-40℃和-80℃冰箱储存81天后，取出在室温下融化，加入实验例1制备的150μL内标工作液，涡流混合2min，按实验例2制备空白尿液样品的步骤(2)制得样品，分别考察制得的样品在 -40℃和-80℃储存81天的稳定性。上述所有稳定性实验的结果见表4。
表4缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的稳定性
实验例4UPLC-MS/MS分析测定
1、主要仪器
超高效液相色谱-质谱联用仪(UPLC-MS/MS)是岛津LC-30AD超高效液相色谱，配有电喷雾离子源以及LabSolutions 6.70数据处理系统，液相色谱系统包括SIL-30AC HT自动进样器。XPE26电子分析天平(METTLER公司)；VX-Ⅱ多管涡旋振荡器(天根生化科技(北京)有限公司)；5810R 离心机(德国Eppendorf公司)。
2、试验条件与结果
(1)色谱
色谱条件：所用的分析柱为美国Waters公司的色谱柱，其规格为1.7μm， 2.1×50mmACQUITYUPLC BEH C18，流动相A为0.1％甲酸水溶液。流动相 B为甲醇-乙腈-甲酸(50:50:0.2，v/v)的混合溶液，柱温40℃，洗脱梯度为 0min(65％B)→1.50min(80％B)→2.0min(98％B)→2.60min(Autosample Rinse)→3.00min(98％B)→3.01min(65％B)→3.8min(stop)，流动相流速0.30mL/min～0.60mL/min。
如图3所示，UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图一。图中，A：空白尿液；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。
如图4所示，UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图二。图中，B：加标空白尿液；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。
如图5所示，UPLC-MS/MS测定人尿液中缬沙坦、沙库巴曲及LBQ657 色谱图三。图中，C：给药尿液样品；字母后的数字表示：1：缬沙坦；2：缬沙坦-d9；3：沙库巴曲；4：沙库巴曲-d4；5：LBQ657；6：LBQ657-d4。
(2)质谱
质谱条件：电喷雾离子化源，正离子方式检测；检测器电压为2.22kV；接口温度为300℃，加热块温度为400℃；碰撞诱导解离CID gas为270kPa；雾化气流：3L/min；加热气流：15L/min；干燥气流：15L/min；扫描方式为多反应监测模式即MRM模式，用于定量分析的离子对分别为：
缬沙坦：m/z 436.00→m/z 291.10，其CE为-20V；
缬沙坦-d9：m/z 445.00→m/z 300.20，其CE为-20V；
沙库巴曲：m/z 412.25→m/z266.15，其CE为-20V；
沙库巴曲-d4：m/z 416.25→m/z 266.15，其CE为-20V；
LBQ657：m/z 384.20→m/z 266.15，其CE为-30V；
LBQ-d4：m/z 388.20→m/z 266.15，其CE为-30V；每一个通道的扫描时间为30msec。
采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测，解决其残留的洗针程序为：洗针液R0及外置泵R3均为甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸，所述的甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸的体积比为25:25:25:25:1；洗针程序为R0清洗进样针的外壁，进样前后各润洗3s，洗针速度35μL/s，洗针体积500μL，外置泵R3的程序为清洗泵->清洗进样口(Rinse Pump->Rinseport)，用于进一步清洗进样针的外壁。解决其残留的方法一是在化合物出峰之后，增加自动进样阀的高压阀的冲洗，在2.60min在Autosample模块增加冲洗(Rinse) 命令，用流动相冲洗高压阀；；解决其残留的方法二是在所有化合物出峰后提高色谱柱的流速，流速在2.61～3.01min为0.6mL/min，此时有机相比例为 98％，增加对系统及色谱柱脂溶性物质的洗脱。
如图1所示，缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲 -d4和LBQ-d4的二级全扫描质谱图一。图中(A)缬沙坦、(B)沙库巴曲、 (C)LBQ657。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
如图2所示，缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657和内标缬沙坦-d9、沙库巴曲 -d4和LBQ-d4的二级全扫描质谱图二。图中(D)缬沙坦-d9、(E)沙库巴曲-d4、 (F)LBQ657-d4。横坐标：质荷比；纵坐标：强度。
3、数据处理与分析
应用LabSolutions 6.70药代动力学软件对所测数据进行分析，并采用辅助数据处理软件Microsoft Office 2010，获得药物的24小时尿液累积排泄量见表5，24小时尿液回收率见表6。
注:10个病人没有尿液
4、UPLC-MS/MS定量方法学验证
(1)标准曲线
标准曲线样品为实验例2中的制备的标准曲线样品，以待测物的浓度(即标准曲线样品)为横坐标(x)，待测物与内标的峰面积比为纵坐标，用加权 (W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得缬沙坦、沙库巴曲、LBQ657的直线回归方程，得出标准曲线。
如图6所示，方法验证阶段代表性标准曲线图。图中，A：缬沙坦；B：沙库巴曲；C：LBQ657。横坐标：待测物的浓度；纵坐标：待测物与内标的峰面积比。结果表明缬沙坦(A)在尿液2～1000ng/mL范围内，沙库巴曲 (B)在尿液1～500ng/mL，LBQ657(C)在尿液10～10000ng/mL范围内线性关系良好。
(2)未知尿液样品测定与质量控制
对实验例2中制备的未知尿液样品分析，并以当日的标准曲线计算各时间点样品中缬沙坦、沙库巴曲、LBQ657的浓度，由质控尿液样品(QC样品) 决定当日数据的取舍。要求每个分析批的质控尿液样品的准确度(RE)在理论值的±15％范围内，可以有1/3的浓度点超限，但同一浓度至少有50％符合标准。
5、实际应用
40名腹膜透析终末期肾衰患者口服诺欣妥后，收集24小时的尿液，测定尿液中缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657浓度，并三个化合物的尿液回收率，结果显示，24小时缬沙坦、沙库巴曲和LBQ657的尿液回收率低于健康人的这三个化合物回收率，这与受试人群为肾功能不良的终末期肾衰患者有关，从而导致LCZ696的尿液排泄减少，回收率结果见表6。
本发明采用UPLC-MS/MS法同时测定人尿液样品中缬沙坦、沙库巴曲、 LBQ657的浓度。尿液样品经处理后，采用ESI源，以MRM扫描方式进行定量分析，尿液中的内源性物质不干扰缬沙坦、沙库巴曲、LBQ657的测定。本发明方法准确、选择性强，并且符合NMPA颁布的“化学药物临床药代动力学研究技术指导原则”([H]GCL1-2)有关要求，适合缬沙坦、沙库巴曲、 LBQ657在人尿液中回收率研究。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (10)
1.一种UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，该方法针对的是慢性肾病终末期患者尿液样品；
该方法包含：
采用乙腈蛋白沉淀法对样品进行前处理，样品前处理后采用等体积的稀释剂进行稀释，其中所述稀释剂为50％乙腈-0.1％甲酸水；
采用超高效液相色谱串联质谱对稀释后的样品进行检测：
温度：40℃，流动相：A相0.1％甲酸水溶液，B相是体积比为50:50:0.2的甲醇-乙腈-甲酸，洗脱方式：梯度洗脱；
其中，梯度洗脱条件设置为：
0min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；
1.50min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量80％；
2.00min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量98％；
2.60min时，流动相流速为0.3mL/min，冲洗自动进样器高压阀；
2.61～3.00min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量98％；
3.01min时，流动相流速为0.6mL/min，流动相中的B相含量65％；
3.51min时，流动相流速为0.3mL/min，流动相中的B相含量65％；
4.00min时，流动相流速为0.3mL/min，停止进样。
2.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱串联质谱中，高效液相色谱仪是岛津LC-30AD超高效液相色谱，质谱仪是日本岛津公司8060型串联质谱仪。
3.根据权利要求2所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱仪，色谱柱：ACQUITYUPLC BEH C18，规格为2.1mm×50mm，1.7μm。
4.根据权利要求2所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱仪，配有自动进样器，该自动进样器为SIL-30AC HT自动进样器。
5.根据权利要求2所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的质谱仪，配有Turbo Ionspray离子源以及LabSolutions 6.70数据处理系统。
6.根据权利要求2所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，辅助数据处理软件为Microsoft Office。
7.根据权利要求4所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的自动进样器温度设为15℃。
8.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱串联质谱，在洗针时，解决残留的洗针程序为：洗针液R0及外置泵R3连通的溶液均为体积比为25:25:25:25:1的甲醇-乙腈-异丙醇-水-甲酸，洗针程序为洗针液R0清洗进样针的外壁，进样前后各润洗3s，洗针速度35μL/s，洗针体积500μL，外置泵R3的程序为清洗泵->清洗进样口，用于进一步在进样前后清洗进样针的外壁。
9.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱串联质谱的分析中所用内标为待分析物的氘代衍生物，选用缬沙坦-d9、沙库巴曲-d4和LBQ657-d4。
10.根据权利要求1所述的UPLC-MS/MS法同时测定人尿液生物样品中缬沙坦、沙库巴曲及其代谢物LBQ657浓度的方法，其特征在于，所述的超高效液相色谱串联质谱的进样量为4μL。
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