CN114814036B - 血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血浆中阿齐沙坦和氨氯地平药物浓度的测定方法，其包括使用标准曲线样品、质控样品和空白基质，内标添加，再添加有机溶剂经蛋白沉淀后使用高效液相色谱质谱串联进行标准曲线的拟合获得回归方程，将待测物血浆样品按照同法处理，采用回归方程回算待测物的浓度。本方法具有使用样品量少、提取回收率高、灵敏度高、特异性强，精密度和准确度良好，无明显基质效应和稀释效应的优点,可用于同时测定临床样品中阿齐沙坦和氨氯地平血药浓度的检测。

Description

血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的测定方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及一种血浆中阿齐沙坦和氨氯地平药物浓度的测定方法，尤其涉及可用于同时测定临床样品中阿齐沙坦和氨氯地平血药浓度的检测。
背景技术
高血压(Hypertension)是以动脉血压持续升高为特征的进行性心血管综合征，是最常见的慢性病，也是心脑血管病最主要的危险因素，其主要并发症脑卒中、心力衰竭、心肌梗死、慢性肾脏病等不仅致残、致死率高。常用的降压药物主要包括钙离子拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、利尿剂和β受体阻滞剂5类，以及由上述药物组成的固定配比复方制剂。
阿齐沙坦是血管紧张素受体阻滞剂，与血管紧张素IIAT1受体结合从而拮抗血管紧张素II，主要通过抑制其强烈的血管收缩作用来降低末梢血管阻力，显示出降压作用。
氨氯地平作为二氢吡啶类的钙离子拮抗剂发挥作用，具有起效缓慢且持续的特点。二氢吡啶类的钙离子拮抗剂与膜电位依存性L型钙离子通道特异性结合，减少钙离子流入细胞内，从而松弛冠状动脉及末梢血管的平滑肌，起到降压作用。
临床上阿齐沙坦氨氯地平片由日本武田药品工业株式会社研发，2014年6月在日本获批上市销售，商品名规格为20mg/2.5mg和20mg/5mg，是一种市场前景非常广阔的降压药物。对于这一新的药物组合类型，仿制药企业的一致性评价以及基础药物代谢等多方面的研究正在广泛开展。
然而，现状是尚无现成的同时检测阿齐沙坦和氨氯地平的血药浓度检测方法。目前为止，研究人员通过不同分析方法分别测定两种药物阿齐沙坦和氨氯地平的浓度。现有技术文献1-4均记载了通过液相色谱质谱串联法测定氨氯地平用于生物利用度和生物等效性的分析，均采用醚或正己烷-二氯甲烷-异丙醇混合有机溶剂进行提取。高茸4)以前发表的文章待测血浆样品均较大，单次测试血浆样品量高达500微升，经其改进后血浆样品量降为50微升，但是其回收率未得到明显改善，尤其是随着质控样品浓度的升高，可见到回收率有下降趋势，提示不同浓度的样品提取回收率可能会存在差异。
现有技术文献5-7记载了通过液相色谱质谱串联法或液相色谱紫外的方法测定人或大鼠血浆中阿齐沙坦的浓度用于药代动力学的分析。
现有技术文献：
1.张丽娜，张懋璠，闫笛，韩操，谭博，宋岩，孟胜男(2014)；2种苯磺酸氨氯地平片的相对生物利用度及生物等效性对比分析；中国医科大学学报，43(1)，22-25。
2.Sisi Cao,Yang Deng,Hualin Cai,Zhenyan Hou,Miao Yan,Bikui Zhang(2017)；Pharmacokinetics and bioequivalence analysis of amlodipine tablets inChinese female and male volunteers by HPLC-MS/MS；Journal of ChinesePharmaceutical Sciences，26(4)，291–297。
3.张丽娜，刘曼，杨漫，杜爱华，张娅喃，张丹，韩静，王晓琳，刘会臣(2013)；LC-MS/MS法测定氨氯地平血药浓度及其片剂的生物等效性研究；中国药房，24(10)，910-913。
4.高茸，马亚中，赵海霞，王肇源，张伟红，袁海龙(2022)，苯磺酸氨氯地平片在中国健康受试者中的生物等效性研究，中国临床药理学与治疗学，27(1)，56–61。
5.曹聪，郑运亮，胡兴江，刘健，吴国兰，申屠建中(2017)；LC-MS/MS法测定健康人体血浆中阿齐沙坦的浓度及在药代动力学研究中的初探；药物分析杂志，37(4)，737–744。
6.樊玲，李洁，彭兆亮，王雪琦，汪电雷，杨晔，陈亚军，王淑君(2017)；UPLC分析大鼠血浆中阿齐沙坦浓度及其初步药代动力学研究；安徽中医药大学学报，36(1)，77–80。
7.曹端文，李蒲，左荣，刘小健，胡锦芳，魏筱华(2020)；阿齐沙坦片在中国健康人体内的生物等效性评价；中国新药杂志，29(1)，63–68。
以上文献记载的方法均为测定一种药物浓度的分析方法，还未见同一分析方法可用于两种药物浓度的测定。分别进行两种药物的检测会存在以下的问题：
1)会导致同一受试者采血点要取用两份血浆样品，会浪费临床样品资源，甚至需增加采血量，不利于受试者权益保护；2)会增加样品前处理时间及人力资源消耗，降低工作效率，并增加检测耗材的使用量；3)已报道的氨氯地平的分析方法主要采用液液萃取的前处理方式进行定量分析，回收率低，定量下限不高，会造成低浓度点样品检测的结果可靠性低甚至无法给出准确的浓度；4)阿齐沙坦和氨氯地平的线性范围差异较大，分别是5.00-2500ng/ml和0.0200-10.0ng/ml，同一个分析方法同时检测这两个化合物极具挑战，目前国内外还未有分析方法可同时检测这两个化合物，难以将两种药物的现有检测方法简单的加和。
综上所述，急需开发一种操作简便，通用性好，使用样品量少、提取回收率高、特别是阿齐沙坦和氨氯地平提取回收率差异小、灵敏度高、特异性强的可同时检测阿齐沙坦和氨氯地平血药浓度的方法。
发明内容
本发明的方法具有使用样品量少、提取回收率高、灵敏度高、特异性强，精密度和准确度良好，无明显基质效应和稀释效应的优点。可用于临床样品同时测定阿齐沙坦和氨氯地平血药浓度的检测。具体而言，本发明具体提供一种测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度，所述方法包括如下步骤：
S1、获得阿齐沙坦标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质、阿齐沙坦的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得阿齐沙坦标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制阿齐沙坦标准曲线和回归方程；
S2、获得氨氯地平标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质、氨氯地平的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得氨氯地平标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制氨氯地平标准曲线和回归方程；
S3、血浆样本测定步骤：取待测的人或动物血浆样品，加入含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液，经样品前处理步骤后获得待测物样品溶液，利用高效液相色谱-串联质谱法进行氨氯地平和阿齐沙坦的检测，利用阿齐沙坦标准曲线和氨氯地平标准曲线求出血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度，
所述阿齐沙坦标准曲线测定液、所述氨氯地平标准曲线测定液、所述添加内标后的待测物样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理，
样品前处理：在待测溶液中加入溶液体积0.05～0.15倍的pH值为13～14的碱金属氢氧化物水溶液，混合0.5～5分钟，再加入溶液体积2.5～4倍的pH值为2-3的酸化乙腈，振荡5～25分钟，离心取上清液，将上清液干燥去除溶剂之后，加入可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂，再直接进样。
所述空白基质为人或动物的全血经抗凝处理、分离后的血浆。
所述碱金属氢氧化物可以是氢氧化钠，氢氧化钾，优选氢氧化钠。作为pH值为13～14的碱金属氢氧化物水溶液，作为例子可以使用，0.5～1.5mol/L的碱金属氢氧化钠水溶液。
pH值为2-3的酸化乙腈，可以是利用任何无氧化还原性的酸进行酸化的乙腈，例如甲酸化乙腈，盐酸化乙腈，醋酸化乙腈等。作为具体的例子，例如可以使用，甲酸浓度为0.05～0.2wt％的乙腈。
在本发明优选的实施方式中，作为阿齐沙坦的内标的化合物为氘代马来酸阿齐沙坦(本发明中，也记做阿齐沙坦-d5)，作为氨氯地平的内标的化合物为氘代苯磺酸氨氯地平(本发明中，也记做氨氯地平-d4)。
在本发明优选的实施方式中，S1步骤中，含空白基质、阿齐沙坦的溶液中阿齐沙坦的浓度在5.00ng/ml～2500ng/ml内选取，优选浓度为5.00ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、和2500ng/ml；
在S2步骤中，含空白基质、氨氯地平的溶液的浓度在0.0200ng/ml～10.0ng/ml范围内选取，优选浓度为0.0200ng/ml、0.0400ng/ml、0.200ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、8.00ng/ml、和10.0ng/ml，
内标工作液中，含有500ng/ml的氘代阿齐沙坦，2.0ng/ml的氘代氨氯地平。
在本发明优选的实施方式中，在所述样品前处理中，作为可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂为以体积比计含20～40％乙腈的水，得到的溶液A直接进行氨氯地平的浓度检测，进而，再将溶液A利用以体积比计含15～25％甲醇的水进行30～60倍稀释，得到溶液B进行阿齐沙坦的浓度检测。
如果并未特殊说明，本发明中液体与液体含量配比的百分数，例如甲酸在乙腈水溶液中的含量配比，以体积分数计量。
在本发明优选的实施方式中，样品前处理可以为以下更优选的处理方式：
取样品100μl，加入50.0μl内标工作溶液，再加入10.0μl 1mol/L的氢氧化钠水溶液至96孔板中，震摇至少1分钟，再加入500μl含0.1％甲酸的乙腈，振荡混匀至少15分钟将上述样品板于4℃，4500rpm离心10分钟，转移400μl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中，40℃氮气吹干，然后加入200μl 30％乙腈水溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟，所得溶液A用于检测氨氯地平的浓度，
从溶液A中取出10.0μl到另一个干净的96孔板中再加入440μl 20％甲醇，室温下涡旋混匀至少5分钟得溶液B，进样高效液相色谱质谱仪用于检测阿齐沙坦。
在本发明可选的实施方式中，抗凝处理使用EDTA-K2进行抗凝处理。
在本发明可选的实施方式中，待测的人或动物血浆样品，为-60℃以下低温保存的样品。
本发明开发了一种分析方法可同时检测阿齐沙坦和氨氯地平，节省了临床样本，缩短检测时间，耗材消耗量少，结果可靠。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明阿齐沙坦和氨氯地平血药浓度定量分析方法，采用HPLC-MS/MS技术并开发出适宜的检测条件；用于检测阿齐沙坦和氨氯地平时，灵敏度高、准确率好、分析速度快。
2.前处理方法中通过引入1mol/L NaOH水溶液，并且配合使用含甲酸的乙腈作为前处理剂，可以在蛋白沉淀的同时，使阿齐沙坦和氨氯地平都很好的游离在血浆基质中，使两种药物分子都实现90％以上的回收率，使得用于药物代谢研究时，能够给出精准的实验结果。
3.两种检测可以合并使用一份血浆样品，极大的减少了血液用量，临床上极大保护了受试者的权益，在药代动力学研究中更加提高了实验动物、受试者依从性，也使得操作便捷，效率更高。
4.通过不断优化，本发明优选的实施方式中，能实现血浆定量限为：阿齐沙坦为5.00ng/ml，氨氯地平为0.0200ng/ml，为阿齐沙坦和氨氯地平的临床动力学研究提供基础，并且适用性广泛，可用于血浆中阿齐沙坦和氨氯地平的浓度分析。
附图说明
图1为本发明实施例中的阿齐沙坦母离子扫描图；
图2为本发明实施例中的氨氯地平母离子扫描图；
图3为本发明实施例中的阿齐沙坦子离子扫描图；
图4为本发明实施例中的氨氯地平子离子扫描图；
图5为本发明实施例中的阿齐沙坦-d5母离子扫描图；
图6为本发明实施例中的氨氯地平-d4母离子扫描图；
图7为本发明实施例中的阿齐沙坦-d5子离子扫描图；
图8为本发明实施例中的氨氯地平-d4子离子扫描图；
图9为本发明实施例中的阿齐沙坦定量下限图；
图10为本发明实施例中的氨氯地平定量下限图；
图11为本发明实施例中的阿齐沙坦的血浆标准曲线；
图12为本发明实施例中的氨氯地平的血浆标准曲线。
具体实施方式
以下详细记载本发明的各要素。
一种测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度，方法包括如下步骤：
S1、获得阿齐沙坦标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质、阿齐沙坦的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得阿齐沙坦标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制阿齐沙坦标准曲线和回归方程；
S2、获得氨氯地平标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质、氨氯地平的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得氨氯地平标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制氨氯地平标准曲线和回归方程；
S3、血浆样本测定步骤：取待测的人或动物血浆样品，加入含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液，经样品前处理步骤后利用高效液相色谱-串联质谱法进行氨氯地平和阿齐沙坦的检测，利用阿齐沙坦标准曲线和氨氯地平标准曲线求出血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度，
阿齐沙坦标准曲线测定液、氨氯地平标准曲线测定液、待测样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理，
样品前处理：
在待测溶液中加入溶液体积0.05～0.15倍的pH值为13～14的碱金属氢氧化物水溶液，混合0.5～5分钟，再加入溶液体积2.5～4倍的pH值为2-3的酸化乙腈，振荡5～25分钟，离心取上清液，
碱金属氢氧化物可以是氢氧化钠，氢氧化钾，优选氢氧化钠。作为pH值为13～14的碱金属氢氧化物水溶液，作为例子可以使用，0.5～1.5mol/L的碱金属氢氧化钠水溶液。
pH值为2-3的酸化乙腈，可以是利用任何无氧化还原性的酸进行酸化的乙腈，例如甲酸化乙腈，盐酸化乙腈，醋酸化乙腈等。作为具体的例子，例如可以使用，甲酸浓度为0.05～0.2wt％的乙腈。
因此，前处理工序的具体例子可以是，在待测溶液中加入溶液体积0.05～0.15倍的0.5～1.5mol/L的氢氧化钠水溶液，混合0.5～5分钟，再加入溶液体积2.5～4倍的含甲酸的乙腈，甲酸浓度为0.05～0.2wt％，振荡5～25分钟，离心取上清液，将上清液干燥去除溶剂之后，加入可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂，再直接进样。
本发明中，空白基质为人或动物的全血经抗凝处理、分离后的血浆。
本发明为同时检测血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，本发明中，利用内标法测定，即用阿齐沙坦和氨氯地平及各自内标物和空白基质配制标准曲线样品，采用稀释液进行蛋白沉淀后，采用HPLC-MS/MS法检测，进样并绘制标准曲线获得回归方程，取待测血浆添加内标工作液后，采用稀释液沉淀后按照同样的方法处理，采用回归方程计算阿齐沙坦和氨氯地平的血药浓度。与现有技术最明显的区别在于，基于少量采样和统一的前处理，可以基于同一样品检测两种药物成分。经过深入研究优化的前处理条件，平衡了两种药物成分的回收率。血浆中能与两种药物结合的蛋白成分并非清楚，何种血浆处理条件能平衡两种药物的释放，使两种药物尽量稳定地以游离态存在，并非公知常识。
作为阿齐沙坦的内标的化合物，产业界最常见为氘代马来酸阿齐沙坦(阿齐沙坦-d5)，作为氨氯地平的内标的化合物，产业界最常见为氘代苯磺酸氨氯地平(氨氯地平-d4)，本发明中也优选使用这两种内标物，其相似的化学结构有利于提高方法精密度。本发明中阿齐沙坦和氨氯地平浓度检测应用含内标的标准曲线法，本领域人员可以根据自身的实验条件，通过实验设计摸索出适合自身仪器条件的具体的高效液相色谱-串联质谱法参数。
需要说明的是，本发明的重要特征在于前处理方法，通过寻找到特殊的前处理方法，是的样品回收率稳定，从而开发出了高效、准确、精密度好的检测方法。然而，无论何种具体的HPLC-MS参数，基于在样品进入色谱柱前，通过加入溶液体积0.05～0.15倍的碱性水溶液，混合0.5～5分钟，再加入溶液体积2.5～4倍的酸化乙腈振荡5～25分钟，离心取上清液，将上清液干燥去除溶剂之后，再复溶的方式，都能最大限度的同时满足两种药物的检测灵敏度、回收率、稳定性。进一步优选使用0.08～0.12倍的氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液的浓度进一步优选为0.8～1.2mol/L，更进一步优选使用1mol/L的氢氧化钠水溶液。此外，对于甲酸，可选用其它无氧化还原性小分子类酸替代，例如盐酸、醋酸等，配制为相应浓度(pH值范围2-3)的酸化乙腈溶液作为蛋白沉淀剂。所选用的碱性水溶液，可选用其它碱性化合物配制相应浓度(pH值范围13-14)，作为样品前处理液。
经过样品前处理之后复溶的溶液，可以直接进样测定阿齐沙坦和氨氯地平，可以一次色谱分离检测两个化合物，也可以分别利用两根色谱柱分别检测两种化合物，考虑到两个化合的极性差别较大，因此利用两根色谱柱分别检测两种化合物有着更好的效率，因此优选。
经过样品前处理之后复溶的溶液，可以直接用于测定阿齐沙坦和氨氯地平。然而根据商品名的规格，可以取得阿齐沙坦和氨氯地平在血浆中的浓度并不在一定数量级，为了提高方法精密度，匹配两种药物的浓度差别，优选经过上述样品前处理之后复溶的溶液直接用于测定氨氯地平，复溶后的溶液进一步稀释后进行阿齐沙坦的测定。
在本发明优选的实施方式中，S1步骤中，含空白基质、阿齐沙坦的溶液中阿齐沙坦的浓度在5.00ng/ml～2500ng/ml内选取，优选浓度为5.00ng/ml、10.0ng/ml、50.0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、和2500ng/ml；
在S2步骤中，含空白基质、氨氯地平的溶液的浓度在0.0200ng/ml～10.0ng/ml范围内选取，优选浓度为0.0200ng/ml、0.0400ng/ml、0.200ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、8.00ng/ml、和10.0ng/ml；
内标工作液中，含有500ng/ml的氘代阿齐沙坦，2.0ng/ml的氘代氨氯地平，在上述的浓度范围内，本方法体现了良好的精密度、重现性，操作也简便。
在样品前处理中，作为可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂，可以是通常使用的，不损害色谱柱填料质量的溶剂，特别优选为水、甲醇、乙腈，或它们的混合溶剂等，这是由于这类溶剂对于HPLC条件下的色谱柱稳定性友好，如果是其他有机溶剂，出于对于色谱柱寿命的考虑，并不优选使用。也可以配合不同的色谱柱，添加适当的缓冲剂。
需要说明的是，本发明中使用的水，没有特别限制，只要是不会对试验目的造成影响的水都可以使用，例如出于分析化学实验目的，则可以使用分析实验室用水，具体地可以使用一级水、二级和三级水，按照配制标准溶液、储备溶液的一般要求，水优选一级水(参见《GBT6682-2008分析实验室用水规格和试验方法》)。本发明中所指的甲醇、乙腈也是指分析纯以上级别的溶剂。
在本发明优选的实施方式中，在样品前处理中，作为可进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂为以体积比计含20～40％乙腈的水，得到的溶液A直接进行氨氯地平的浓度检测，进而，再将溶液A利用以体积比计含15～25％甲醇的水进行30～60倍稀释，得到溶液B进行阿齐沙坦的浓度检测。
在本发明优选的实施方式中，样品前处理可以为以下更优选的处理方式：
取样品100μl，加入50.0μl内标工作溶液，再加入10.0μl 1mol/L的氢氧化钠水溶液至96孔板中，震摇至少1分钟，再加入500μl含0.1％甲酸的乙腈，振荡混匀至少15分钟将上述样品板于4℃，4500rpm离心10分钟，转移400μl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中，40℃氮气吹干，然后加入200μl 30％乙腈水溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟，所得溶液A用于检测氨氯地平的浓度。
从溶液A中取出10.0μl到另一个干净的96孔板中再加入440μl 20％甲醇，室温下涡旋混匀至少5分钟得溶液B，进样高效液相色谱质谱仪用于检测阿齐沙坦。
此处的样品可以是标准曲线样品、质控样品和从患者、实验动物、健康志愿者采集来的血样。在本发明可选的实施方式中，抗凝处理使用EDTA-K2进行抗凝处理。在本发明可选的实施方式中，待测的人或动物血浆样品，为-60℃以下低温保存的样品。常用的方法，是将待测血浆为口服阿齐沙坦和氨氯地平制剂后的人或动物全血经EDTA-K2抗凝、分离后的血浆，于≤-60℃条件下保存待测，临用前在室温条件下自然解冻即得。
实施例
下面通过实施例对本发明进行详细描述，但并不意味着对本发明任何不利限制。本文已经详细地描述了本发明，其中也公开了其具体实施例方式，对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的。
实施例1阿齐沙坦和氨氯地平人血药定量分析方法的建立
本发明采取的是HPLC-MS/MS的检测方法，先采取蛋白沉淀的方式获取阿齐沙坦和氨氯地平的测试样品，通过HPLC分离，再采用阿齐沙坦和氨氯地平人血药定量分析方法，步骤如下：
一、实验仪器及材料
a)实验器材
溶剂瓶、96-孔板、移液枪、涡旋混合器、96孔板混匀仪、液体工作站、高通量氮吹仪、离心机。
b)仪器
液相色谱：岛津液相色谱仪，含DGU-20A5R在线脱气机、LC-30AD泵、SIL-30AC自动进样器、CTO-20AC柱温箱；质谱：Triple Quad 5500/QTRAP 6500+，Applied Biosystems/MDS Sciex，Applied Biosystems/MDS Sciex；离子源：电喷雾离子源(ESI)
c)标准品
马来酸阿齐沙坦：含量99.9％，密闭，在30℃以下保存。
苯磺酸氨氯地平：纯度/含量：98.7％/93.2％，2-8℃保存。
马来酸阿齐沙坦-d5：纯度/含量：98.9％/94.3％，同位素丰度：99.5％；2-8℃保存。
苯磺酸氨氯地平-d4：纯度/含量：97.8％/96.7％，同位素丰度：99.6％；2-8℃保存。
d)空白基质
常规空白基质：由健康人员捐献的人血浆(抗凝剂EDTA-K2)。
高脂空白基质：采用20％脂肪乳和高脂餐后空白基质按体积比(1:39，v:v)混合制得高脂空白基质。
e)溶剂及试剂
甲醇、乙腈、甲酸、氢氧化钠、异丙醇、纯化水。
f)流动相及稀释液
流动相A：0.1％甲酸的水溶液；流动相B：100％乙腈；强洗针液R3：乙腈/异丙醇/水(v/v/v)＝4/3/3)；弱洗针液R0：甲醇/水(v/v)＝1/1)；蛋白沉淀剂：含0.1％甲酸的乙腈溶液；溶液1：100％甲醇溶液；溶液2：甲醇/水(v/v)＝1/1；溶液3：1mol/L NaOH；复溶液1：乙腈/水(v/v)＝3/7；复溶液2：甲醇/水(v/v)＝2/8。
g)样品
含阿齐沙坦和氨氯地平的血浆样品。
二、实验方法
a)标准品及内标储备液的制备
阿齐沙坦储备溶液：精密称量一定量的阿齐沙坦标准品粉末，置于棕色玻璃瓶中，完全溶解于适量体积的纯甲醇中，制得浓度为1.00mg/ml的储备溶液，保存于-20℃。
采用相同方法，制得浓度均为1.00mg/ml阿齐沙坦-d5储备溶液、氨氯地平储备溶液和氨氯地平-d4储备液。
b)工作液的制备
在室温黄光下，用50％甲醇稀释储备溶液制得同时含阿齐沙坦和氨氯地平的标准曲线样品工作溶液、质控样品工作溶液、内标工作溶液。标准曲线样品工作溶液和质控样品工作溶液配制于棕色玻璃瓶中，工作溶液放置于冰箱(-20℃)中保存。
i.标准曲线样品工作溶液配制浓度如下：
ii.质控样品工作液配制浓度配制：
iii.内标工作液配制：
iv.回收率参比溶液和基质效应中间溶液配制：
v.内标提取回收率中间溶液配制：
vi.化合物提取回收率中间溶液配制：
c)标准曲线及质控样品的制备
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品的制备过程，例如，在380μl的空白血浆中用移液器加入20.0μl标准曲线工作溶液，混合均匀。可以根据实际情况适当调整体积。标准曲线和质控样品于室温黄光下制备，如无必要，无需制备DQC及LLOQ QC质控样品。
i.标准曲线样品浓度
阿齐沙坦的标准曲线样品浓度：5.00ng/ml(定量下限，LLOQ)、10.0ng/ml、50.0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、和2500ng/ml(定量上限，ULOQ)。
氨氯地平的标准曲线样品浓度：0.0200ng/ml(定量下限，LLOQ)、0.0400ng/ml、0.200ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、8.00ng/ml、和10.0ng/ml(定量上限，ULOQ)。
ii.质控样品浓度
阿齐沙坦的质控样品浓度：定量下限(LLOQ，5.00ng/ml)、低浓度(LQC，15.0ng/ml)、中浓度(GMQC，100ng/ml；MQC，1250ng/ml)、高浓度(HQC，1880ng/ml)。
氨氯地平的质控样品浓度：定量下限(LLOQ，0.0200ng/ml)、低浓度(LQC，0.0600ng/ml)、中浓度(GMQC，0.400ng/ml；MQC，5.00ng/ml)、高浓度(HQC，7.50ng/ml)。
iii.稀释质控样品(DQC)
阿齐沙坦12500ng/ml和氨氯地平50.0ng/ml，以空白血浆稀释该稀释质控样本(稀释因子为8)，制得浓度为阿齐沙坦1562.5ng/ml和氨氯地平6.25ng/ml的测试样本(浓度在标准曲线范围内)。
d)样品前处理方法
样品前处理于室温黄光条件下，在96深孔板中进行。
注1：混合样品，即标准曲线样品、质控样品和测试样品等；
注2：常规样品，即除基质效应测试样品、基质效应参比样品、回收率测试样品和回收率参比样品以外的其它样品。
e)检测
i.阿齐沙坦液相色谱条件
ii.阿齐沙坦质谱条件
iii.氨氯地平检测液相色谱条件
iv.氨氯地平质谱条件
f)数据处理
回归模式 y＝ax+b，线性回归 权重因子 1/x2
y 化合物与其内标峰面积比值 x 化合物标准曲线样品理论浓度
三、本发明方法的方法学验证
为了说明本发明方法得实用性，通过线性及范围、精密度和准确度、选择性、基质效应、回收率、稳定性几个维度对此进行评价。
a)线性及范围
批内与批间精密度和准确度分析批中，采用空白基质，按照“二”项“c)”描述，新鲜制备8个浓度水平的标准曲线样品，每个浓度水平2个重复。阿奇沙坦的标准曲线样品浓度：5.00ng/ml(定量下限，LLOQ)、10.0ng/ml、50.0ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、2500ng/ml(定量上限，ULOQ)。氨氯地平的标准曲线样品浓度：0.0200ng/ml(定量下限，LLOQ)、0.0400ng/ml、0.200ng/ml、1.00ng/ml、2.00ng/ml、4.00ng/ml、8.00ng/ml和10.0ng/ml(定量上限，ULOQ)。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求对理论浓度与响应值(化合物与内标峰面积比值)进行线性回归，采用最小二乘法对标准曲线所有浓度点进行拟合，权重因子为1/x2。本发明中涉及化合物线性方程、相关系数、线性范围如下表所示：
阿齐沙坦：
氨氯地平：
由上表可知，14个分析批，R2均大于0.99，线性拟合良好。对于阿齐沙坦：定量下限为5.00ng/ml，定量上限为2500ng/ml；对于氨氯地平：定量下限为0.02ng/ml，定量上限为10.0ng/ml；
b)批内与批间精密度和准确度
按照本发明中的线性范围，按照“二”项“c)”描述，配制2套标曲曲线样品，每个浓度水平质控样品(LLOQ QC、LQC、GMQC、MQC和HQC)各6个重复。通过至少3个独立的验证分析批(批内精密度和准确度分析批，至少两天完成，采用空白基质新鲜制备)的质控样品对精密度和准确度进行评估。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算质控样品实测值与理论值的偏差、每个浓度水平质控样品的变异系数。数据统计如下表所示：
由上表可知，在批内，对于阿齐沙坦，LLOQ QC精密度最大CV为5.7％，准确度范围为-10.6％至1.4％，其它QC样品精密度最大CV为2.7％，-4.0％至3.2％。在批间，LLOQ QC精密度最大CV值为7.1，准确度为：-2.6％。对于氨氯地平，LLOQ QC精密度最大CV为9.6％，准确度范围为2.5％至5.5％，其它QC样品精密度最大CV为5.7％，准确度范围为-1.30％至4.5％。在批间，LLOQ QC精密度最大CV值为6.7，准确度为：4.0％。对于阿齐沙坦和氨氯地平，准确度在85％～115％之间，精密度CV均在10％以内，说明本方法具有很高的精密度和准确度。
c)选择性
i.空白基质中内源性物质对化合物和内标的干扰
取6个不同来源的常规空白基质、3个不同来源的高脂空白基质，制备的不添加化合物和内标的空白基质样品与相应基质制备的LLOQ样品。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：(1)对照组的LLOQ样品的精密度；(2)单一批次基质中，化合物通道的检出物峰面积占相应基质制备的定量下限样品中化合物峰面积的比，内标通道的检出物峰面积占相应基质制备的定量下限样品中内标峰面积的比。数据统计如下表所示：
由上表可知：常规空白基质和高脂基质中内源性物质对阿齐沙坦及其内标无干扰，常规空白基质中内源性物质对氨氯地平的最大干扰为15.0％，对其内标无干扰；高脂基质中内源性物质对氨氯地平无干扰，对其内标最大干扰为0.8％。说明空白基质中内源性物质对化合物干扰较小。
ii.化合物对内标的干扰
取6份混合空白基质中，只添加化合物(不添加内标，添加相应体积的内标工作液稀释液)的定量上限浓度水平的样品。按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：化合物定量上限浓度样品中内标通道检出物峰面积均值占有效标准曲线定量下限样品中内标峰面积均值的比。数据统计如下表所示：
化合物名称 定量上限样本内标面积均值 LLOQ生物样品内标面积均值 干扰％
阿齐沙坦 0 558886 0.0
氨氯地平 0 200759 0.0
由上表可知，两种化合物对相应内标均无干扰。
iii.内标对化合物的干扰
取6份混合空白基质中，只添加内标(内标浓度为常规样品中内标浓度水平，不添加化合物，添加相应体积的内标工作液稀释液)的样品。按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：只添加内标的样品中化合物通道检出物峰面积均值占有效标准曲线定量下限样品中化合物峰面积均值的比。数据统计如下表所示：
化合物名称 空白质控样本化合物面积均值 LLOQ生物样品化合物面积均值 干扰％
阿齐沙坦 0 8920 0.0
氨氯地平 0 4262 0.0
由上表可知，内标对相应化合物均无干扰。
d)基质效应
测试样品：将常规、高脂空白基质作为空白样品，按照本发明中的前处理方法，提取转上清吹干复溶后，向其中添加化合物和内标制得低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度浓度质控样品(HQC)。
参比样品：将超纯水作为空白样品，按照本上述方法，制得具备相同理论浓度(LQC、MQC及HQC)纯溶液(化合物及内标)测试样品。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：内标归一化基质效应因子(IMF)，即每个浓度每个批次(或来源)基质的测试样品中化合物(或者内标)峰面积除以同浓度参比样品中化合物(或者内标)峰面积均值得化合物(或者内标)的基质效应因子，每个浓度每个批次(或来源)基质的测试样品中化合物基质效应因子除以其内标基质效应因子得内标归一化基质效应因子。数据统计如下表所示：
由上表可知：对于阿齐沙坦，内标归一化基质效应因子在1左右，且变异系数最大值为2.9；对于氨氯地平，内标归一化基质效应因子在1左右，且变异系数最大值为8.0。说明基质对化合物和内标的影响程度相近。
e)提取回收率
i.化合物提取回收率
化合物提取回收率测试样品：采用常规质控样品或者同其制备过程的样品，包含低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度质控样品(HQC)(每个浓度各6个重复)，根据样品前处理方法处理，不加入内标溶液，以相应体积稀释剂代替，提取转上清吹干复溶后，加入相应与处理后的内标溶液浓度相当的内标中间溶液。
化合物回收率参比样品：采用与常规质控样品同一批次(或来源)的空白基质作为空白样品，平行制备18份，加入不含化合物和内标的稀释液，提取转上清吹干复溶后，加入化合物和内标溶液制得低浓度质控样品(LQC)、中浓度质控样品(MQC)和高浓度质控样品(HQC)(每个浓度各6个重复)。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：使用化合物的提取回收率测试样品峰面积比均值除以化合物的回收率参比样品峰面积比均值。数据统计如下表所示：
由上表可知：阿齐沙坦回收率在89.9％～92.3％之间，氨氯地平回收率在95.6％～101.5％之间。
ii.内标提取回收率
内标回收率测试样品：由混合空白基质样品平行制备6份，加入内标溶液。根据样品前处理方法提取转上清吹干复溶后，加入与中浓度质控样品浓度相当的化合物溶液。如果需要，体积可以适当调整。
内标回收率参比样品：同化合物回收率参比样品的制备方法，但仅选择中浓度质控样品(MQC)。
按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：内标回收率测试样品峰面积比的反比(即内标回收率测试样品的内标峰面积除以内标回收率测试样品的化合物峰面积)、内标回收率参比样品峰面积比的反比(内标回收率参比样品的内标峰面积除以内标回收率参比样品的化合物峰面积)、内标回收率测试样品峰面积比的反比均值除以内标回收率参比样品峰面积比的反比均值。数据统计如下表所示：
由上表可知：阿齐沙坦-d5提取回收率为92.3％，氨氯地平-d4提取回收率为102.7％。两个内标均有较高的提取回收率。
f)人血浆样品的稳定性
取空白血浆，制备低浓度质控样品(LQC)和高浓度质控样品(HQC)，每个浓度各6个重复。考察室温黄光条件下至少12小时稳定性、≤-20℃条件下和≤-60℃条件下的冻融稳定性。
除室温稳定性外，其它稳定性样品在规定时间点取出后室温黄光条件下自然解冻，按照“二”项“d)”规定的方法进行前处理，在“二”项“e)”规定的检测条件下测试，并按照“二”项“f)”要求计算：每个浓度的稳定性测试质控样品的测定浓度变异系数、每个浓度的稳定性测试质控样品的测试浓度均值与其理论浓度的偏差，数据统计如下表所示：
室温黄光稳定性：
冻融循环稳定性：
由上表可知：对于人血浆中的阿齐沙坦和氨氯地平，置于透明聚丙烯塑料管，在室温黄光条件下可稳定存在92.7小时，≤-60℃条件下和≤-20℃条件下冻融循环6次稳定。
四、附加比较实施例
比较例1不同前处理方法分别检测阿齐沙坦和氨氯地平
阿齐沙坦和氨氯地平作为两个化合物单独检测，各取一份生物样品，其中阿齐沙坦取用100μl，采用蛋白沉淀法，氨氯地平取用200μl，采用液液萃取法。相较于实例1，阿齐沙坦LC-MS/MS条件不变，而氨氯地平LC条件经优化后检测时间较长；阿齐沙坦线性范围、回收率等无明显变化，而氨氯地平回收率不足80％，结果见下表：
氨氯地平回收率：
由上表可知：氨氯地平回收率在68.2％～79.5％之间。基于现有文献报道方法的检测方法，氨氯地平回收率较低，且不同浓度的回收率有差异，说明不同浓度待测物样品经处理后得到的待测物浓度与真实值有差异，会影响不同浓度氨氯地平样品浓度检测的准确度。并且，所需血样比使用了本发明的方法的上述实施例1的方法多使用了2～3倍的血样，考虑到样品复测和方法重现性的试验样品再分析及备份样品的制备，应加大受试者的采血量，在临床操作中会有较大的实施难度。
比较例2不同样品前处理方法对于阿齐沙坦和氨氯地平的浓度检测的影响
阿齐沙坦和氨氯地平血浆样品在同一个分析方法中前处理，但未加氢氧化钠水溶液和酸化的乙腈溶液，采用蛋白沉淀的前处理样品方法，相较于实例1，两个化合物的LC-MS/MS条件不变或经优化，氨氯地平标准曲线拟合欠佳、回收率和稳定性均不能满足检测要求，不能用于浓度检测。代表性结果如下：
氨氯地平标准曲线拟合：
由上表可知，3个分析批，2个分析批R2大于0.99，另外1个分析批R2则小于0.99，因此方法实施中标曲拟合有风险。
氨氯地平提取回收率在71.6％～91.1％之间，平均提取回收率76.0％，且不同浓度下的回收率差异较大，整体的变异系数也较大，在此方法下，氨氯地平提取回收率不稳定，且相对较低。与之相对的是实施例1中，氨氯地平的回收率非常稳定，且回收率高。回收率的稳定对于分析方法的准确性、精密度、检测限存在很大影响，回收率不稳定的分析方法难以推广使用。
在5℃自动进样器中放置12h：
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在5℃自动进样器中放置52h：
通过上述数据可知，在5℃自动进样器中放置12h后，氨氯地平测定结果在理论浓度90％左右，52h后测定结果均低于其理论浓度的80％，存在较大偏差，说明该方法处理后的溶液中氨氯地平存在降解。考虑到生物等效性试验样本通量常较大，因此12小时的稳定性并不能满足检测要求，因此该方法的实施有较大局限性。
综合以上信息，在样品前处理方法中如果不添加氢氧化钠水溶液和酸化的乙腈溶液进行样本前处理，标曲线性拟合欠佳，且回收率也较低及存在稳定性问题，不能通过方法学验证，无法用于浓度检测。
上述披露的各技术特征并不限于已披露的与其它特征的组合，本领域技术人员还可根据发明之目的进行各技术特征之间的其它组合，以实现本发明之目的，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其使用高效液相色谱-串联质谱法测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、获得阿齐沙坦标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质和阿齐沙坦的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得阿齐沙坦标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制阿齐沙坦标准曲线和回归方程；
S2、获得氨氯地平标准曲线的步骤：配制多种浓度的含空白基质和氨氯地平的溶液，与含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液合并，经样品前处理步骤后获得氨氯地平标准曲线测定液，利用高效液相色谱-串联质谱法绘制氨氯地平标准曲线和回归方程；
S3、血浆样本测定步骤：取待测的人或动物血浆样品，加入含有作为氨氯地平的内标的化合物和作为阿齐沙坦的内标的化合物的内标工作液，经样品前处理步骤后获得待测物样品溶液，利用高效液相色谱-串联质谱法进行氨氯地平和阿齐沙坦的检测，利用阿齐沙坦标准曲线和氨氯地平标准曲线求出血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度；
所述阿齐沙坦标准曲线测定液、所述氨氯地平标准曲线测定液和所述添加内标后的待测物样品溶液在进行高效液相色谱-串联质谱法之前进行以下样品前处理，
样品前处理：在待测溶液中加入溶液体积0.05~0.15倍的pH值为13~14的碱金属氢氧化物水溶液，混合0.5~5分钟，再加入溶液体积2.5~4倍的pH值为2-3的酸化乙腈，振荡5~25分钟，离心取上清液，将上清液干燥去除溶剂之后，加入能进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂，直接进样用于测定氨氯地平，进一步稀释后进行阿齐沙坦的测定；
阿齐沙坦液相色谱中使用Phenomenex Luna® 5µm C18（2）100Å LC Column 50×3mm色谱柱，使用含0.1%甲酸的水以及乙腈作为流动相进行分离；氨氯地平检测液相色谱中使用Phenomenex Kinetex® 2.6µm C18 100Å 50×2.1mm色谱柱，使用含0.1%甲酸的水以及乙腈作为流动相进行分离；
所述空白基质为人或动物的全血经抗凝处理并分离后的血浆，
S1步骤中，含空白基质和阿齐沙坦的溶液中阿齐沙坦的浓度在5.00 ng/ml~2500 ng/ml内选取，
S2步骤中，含空白基质和氨氯地平的溶液的浓度在0.0200 ng/ml~10.0 ng/ml范围内选取。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，
作为阿齐沙坦的内标的化合物为氘代马来酸阿齐沙坦，作为氨氯地平的内标的化合物为氘代苯磺酸氨氯地平。
3.根据权利要求2所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，
S1步骤中，含空白基质和阿齐沙坦的溶液中阿齐沙坦的浓度在5.00 ng/ml、10.0 ng/ml、50.0 ng/ml、250 ng/ml、500 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml和2500 ng/ml中选取；
S2步骤中，含空白基质和氨氯地平的溶液的浓度在0.0200 ng/ml 、0.0400 ng/ml、0.200 ng/ml、1.00 ng/ml、2.00 ng/ml、4.00 ng/ml、8.00 ng/ml和10.0 ng/ml中选取；
内标工作液中，含有500 ng/ml的氘代阿齐沙坦，2.0 ng/ml的氘代氨氯地平。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，
在所述样品前处理中，作为能进行高效液相色谱-串联质谱法进样的溶剂为以体积比计含20~40%乙腈的水，得到的溶液A直接进行氨氯地平的浓度检测。
5.根据权利要求4所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，
将溶液A利用以体积比计含15~25%甲醇的水进行30~60倍稀释，得到溶液B进行阿齐沙坦的浓度检测。
6.根据权利要求3所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，
样品前处理为：取样品100 µl，加入50.0 µl内标工作溶液，再加入10.0 µl 1mol/L的氢氧化钠水溶液至96孔板中，震摇至少1分钟，再加入500 µl含0.1%甲酸的乙腈，振荡混匀至少15分钟将上述样品板于4 °C，4500 rpm离心10分钟，转移400 µl上清液至另一个干净的96孔聚丙烯板中，40 ℃氮气吹干，然后加入200 µl30%乙腈水溶液，室温下涡旋混匀至少5分钟，所得溶液A用于检测氨氯地平的浓度，
从溶液A中取出10.0 µl到另一个干净的96孔板中再加入440 µl 20%甲醇，室温下涡旋混匀至少5分钟得溶液B，进样高效液相色谱质谱仪用于检测阿齐沙坦。
7.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，抗凝处理使用EDTA-K2进行抗凝处理。
8.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，待测的人或动物血浆样品，为-60 ℃以下低温保存的样品。
9.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，所述碱金属氢氧化物为氢氧化钠或者氢氧化钾。
10.根据权利要求1所述的测定血浆中阿齐沙坦和氨氯地平浓度的方法，其特征在于，所述酸化乙腈为甲酸化乙腈、盐酸化乙腈或醋酸化乙腈。
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