KR101718697B1 - 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 동시 신속분석법 - Google Patents

하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 동시 신속분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법에 관한 것으로, 초고속 원심분리법을 이용하여 소변 시료 중 분석 방해물질을 제거하는 전처리 단계; 상기 원심분리된 시료를 희석(dilution)하는 단계; 및 상기 희석된 시료를 검출기가 장착된 액체크로마토그래피(liquid chromatography) 법으로 분리 및 검출하는 단계를 포함하며, 내부표준물질은 펜터민-d5을 사용하며, 상기 분리 단계에서, 하이드록시펜터민, 펜터민, 메펜터민 및 내부표준물질의 머무름 시간(retention time)은 4.8분 이내를 제공한다.
본 발명에 따르면 펜터민 남용 여부를 신속히 판별할 수 있다.

Description

하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 동시 신속분석법 {Rapid and simultaneous analysis for hydroxyphermine, phentermine and mephentermine}
본 발명은 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법에 관한 것으로, 각각의 성분의 검출 여부 및 하이드록시펜터민 대비 펜터민의 함량 비율에 따라 불법 마약류인 펜터민의 남용을 확인할 수 있다.
최근 펜터민(phentermine)은 메스암페타민(methamphetamine, 필로폰)사범에 이어 향정신성의약품으로는 두 번째로 검출 빈도가 높은 마약임에도 불구하고, 펜터민 남용 여부를 확인할 수 없었다. 이유는, 우선, 펜터민의 주요 대사체인 하이드록시펜터민(N-hydroxyphentermine)에 대한 생체시료 내의 함량 측정 및 성분 확인을 위한 분석법이 확립되어 있지 않아 펜터민 남용 여부 판단을 내릴 수 없었으며, 둘째 전문의약품인 메펜터민을 복용하였을 경우 체내 대사과정을 거쳐 펜터민이 생성되므로 검출된 펜터민의 기원이 메펜터민 처방을 받은 후 복용에 의한 것인지 아니면 불법적인 펜터민 남용에 의한 것인지 여부를 명확히 판단하기 어려운 부분이 있었기 때문이다.
하이드록시펜터민은 벤젠고리의 파라 위치의 수산화기가 붙은 화합물(p-hydroxyphentermine)과 함께 펜터민 체내 대사과정의 주요 대사체로 알려져 있다(Duncan and Cho, Mol. Pharmacol., 22 (1982) 235). 이러한 대사체의 분석을 법과학 감정(forensic analysis)에 채택하는 이유는 생체시료 분석 시 모약물의 외부로부터 혼입 또는 오염(contamination)의 소지를 차단할 수 있을 뿐만 아니라 생체시료에서 대사체의 검출은 모약물(parent drug) 복용의 직접적인 증거가 될 수 있기 때문이다.
펜터민은 하이드록시펜터민의 모약물로 암페타민(amphetamine)과 유사한 구조로 약리작용이 비슷하여 규제약물로 관리되고 있는 화합물로 남용의 위험성 때문에 여러 나라에서 마약류로 지정하고 있다(Gehlawat et al., Gen. Hosp. Psychiatry, 35 (2013) 681.e9). 펜터민은 카테콜아민 유리를 증가시켜서 식욕 억제작용을 하며, 미국 식약청(US FDA)에서 1959년 단기 다이어트 약으로 승인되었고, 우리나라에는 2004년부터 도입되었다(Weintraub et al., Intern. Med., 144 (1984) 1143; Kim et al., Korean J. Fam. Med., 34 (2013) 298). 대사과정에서 펜터민은 투여량의 약 70~80%가 본래의 펜터민 자체로 배설되며, 일부 펜터민은 1상(phase I) 대사과정을 거쳐 하이드록시펜터민이 생성되어 소변으로 배출된다.
메펜터민은 펜터민의 모약물로 아드레날린성 신경전달물질을 유리시켜 직간접적으로 막아드레날린성 수용체에 작용하여 효과를 나타내는 약물로 혈압항진제로 사용되고 있다. 메펜터민은 투여량 중 상당 부분이 본래의 메펜터민으로 배설되며, 일부는 체내 대사과정 중 디메틸화(demethylation) 과정을 거쳐 펜터민이 생성되고, 다른 일부는 펜터민과 유사하게 1상 대사과정을 거쳐 하이드록시메펜터민이 생성되어 체외로 배설된다(McEvoy, Drug Information 96, 1996; Beckett et al., J. Pharmaceut. Biomed., 3 (1985) 141).
하이드록시펜터민의 모약물인 펜터민 그리고 펜터민의 모약물인 메펜터민은 구조상 하이드록시펜터민의 유사체로 분류할 수 있다. 현재까지 응용 예로는 메펜터민의 유입 경로에 대한 확인분석법을 반도핑 약물검사에 사용한 구체예는 있었지만 하이드록시펜터민까지 분석법을 확장하여 메펜터민 처방을 받은 후 복용에 의한 것인지 아니면 불법적인 펜터민 남용에 의한 것인지 여부를 명확히 판단한 구체예는 없었다(Huang et al., J. Anal. Toxicol., 34 (2010) 73).
종래의 분석법은 펜터민 및 메펜터민 약물대사 및 약물동력학 기초 연구에 주로 적용되었으며, 응용연구로는 도핑컨트롤 분야에 한정되어 사용되었다. 연구에 사용된 분석법으로는 검출기로 질량분석기를 장착한 기체크로마토그래피법과 액체크로마토그래피법이 주로 사용되었으며, 두 방법 중 기체크로마토그래피법은 액체크로마토그래피법에 비해 전처리 단계에 추출과 유도체화 과정이 포함되어 있어 시료 전처리 과정에서 최종 검출 및 함량 확인에 이르는 전체 분석시간이 증가하는 것으로 알려져 있다. 반면 액체크로마토그래피법의 경우 유도체화 과정이 불필요하고 시료 전처리 과정을 단순화할 수 있어 기체크로마토그래피법에 비해 상당 부분 분석시간을 단축할 수 있는 장점이 있다(Alder et al., Mass Spectrom. Rev., 25 (2006) 838).
따라서 종래의 분석법으로는 판단하기 어려웠던 펜터민 남용과 메펜터민 복용의 차이를 명확히 구분하기 위해서는 생체시료 내에 하이드록시펜터민 뿐만 아니라 그 유도체인 펜터민과 메펜터민을 동시에 분석하고 그 함량을 정확히 확인할 수 있는 분석방법이 요구되고 있다. 또한 체내 대사과정을 거쳐 물질의 극성이 증가한 대사체 분석에 유리한 분석법을 적용하고 추출 또는 유도체화 과정을 단순화하거나 생략함으로써 신속성을 확보하고 동시에 불법적인 마약류 남용과 처방에 의한 전문의약품 복용과의 차이를 명확히 구분할 수 있는 분석법을 제공함으로써 감정결과의 활용도를 높이고 마약류 확산 방지에 도움이 될 수 있는 법과학 정보 제공이 요구되고 있는 상황이다.
하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민을 동시에 신속히 분석하여 불법적인 마약류인 펜터민의 남용 여부를 확인할 수 있는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.
다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 평균적 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일측면은, 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법에 관한 것으로, 초고속 원심분리법을 이용하여 생체시료 중 분석 방해물질을 제거하는 전처리 단계; 상기 원심분리된 시료를 희석(dilution)하는 단계; 및 상기 희석된 시료를 검출기가 장착된 액체크로마토그래피(liquid chromatography) 법으로 분리 및 검출하는 단계를 포함하며, 내부표준물질은 펜터민-d5을 사용하며, 상기 분리 단계에서, 하이드록시펜터민, 펜터민, 메펜터민 및 내부표준물질의 머무름 시간(retention time)은 4.8분 이내를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 전처리 단계에서 분석 방해물질 제거에 사용되는 초고속 원심분리는 30000~50000 g 에서 3 분 이내로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 분리 및 검출하는 단계에서 분리관은 충진제로 C18 또는 카본으로 구성된 분리관일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 분리 및 검출하는 단계에서, 액체크로마토그래프의 분리관 온도는 15 ~ 30 ℃로 설정하고 이동상의 유량은 200~500 ㎕/min으로 설정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 분리 및 검출하는 단계에서, 액체크로마토그래프의 이동상은 2종류를 사용하며, 하나의 이동상(A)은 개미산 또는 아세트산의 유기산을 0.01~0.1% 포함하는 증류수를 사용하며, 나머지 하나의 이동상(B)는 아세토니트릴 또는 메탄올의 유기용매를 사용하며, 상기 이동상 A와 B의 혼합비가 시간에 따라 90:10~10:90의 비율로 농도 구배를 가지도록 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 분리 및 검출 단계에서 소변 시료 중 정량범위는 하이드록시펜터민은 1.5~2000 ng/mL이며 펜터민과 메펜터민은 7.5~10000 ng/mL일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 검출 단계에서 소변 시료 중 정량성 개선을 위하여 검량선(calibration curve) 작성 시 가중요인(weighting factor) 1, 1/x, 1/x2을 적용 가능할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면,상기 동시 신속분석법은 일 내(n=6) 정밀도(precision)와 정확도(accuracy)가 각각 7.6% 이내와 -10.8~10.9%이며, 일간(n=24) 정밀도와 정확도는 10.7% 이내와 -5.1~4.1% 일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동시 신속분석법은 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 시료 희석율 2.5, 5, 10 및 20배를 적용하여 분석 시 측정의 정량범위를 확장이 가능할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 동시 신속분석법에 따라 신속히 펜터민 남용을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 펜터민 남용 확인은 하이드록시펜터민 대비 펜터민의 함량 비율에 따라 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면 하이드록시펜터민에 대한 신규한 분석법을 확립하였을 뿐만 아니라, 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민을 동시에 신속히 분석가능함으로써, 펜터민의 남용 여부를 빠르게 확인할 수 있다.
도 1은 하이드록시펜터민, 펜터민, 메펜터민 및 내부표준물질에 대해 액체크로마토그래프-이중질량분석기(liquid chromatograph-tandem mass spectrometer)로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 2는 이동상의 유속(flow rate)의 변화(200~500㎕/min)에 따라 머무름 시간의 변화를 측정한 크로마토그램이다.
도 3a 및 도 3b은 펜터민, 펜터민-d5 및 하이드록시펜터민, 메펜터민의 고유한 특성을 나타내는 질량스펙트럼(product ion spectrum)이다.
도 4는 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민에 대해 분리관 하단에 표준용액을 주입하여 소변 시료의 기질 효과(matrix effect)를 측정한 크로마토그램이다.
도 5는 펜터민을 불법적으로 남용한 사람의 소변에서 확인된 하이드록시펜터민 및 펜터민 분석 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면은 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법에 관한 것으로, 초고속 원심분리법을 이용하여 생체시료 중 분석 방해물질을 제거하는 전처리 단계; 상기 원심분리된 시료를 희석(dilution)하는 단계; 및 상기 희석된 시료를 검출기가 장착된 액체크로마토그래피(liquid chromatography) 법으로 분리 및 검출하는 단계를 포함하며, 내부표준물질은 펜터민-d5을 사용하며, 상기 분리 단계에서, 하이드록시펜터민, 펜터민, 메펜터민 및 내부표준물질의 머무름 시간(retention time)은 4.8분 이내이다.
본 발명의 분석 대상 성분은 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민의 3종과 내부표준물질로 펜터민-d5 1종이며, 아래의 화학식으로 표시된다.
[펜터민]
Figure 112016062440074-pat00001
[하이드록시펜터민]
Figure 112016062440074-pat00002
[메펜터민]
Figure 112016062440074-pat00003

본 발명의 일 측면에 따른 일 구체예는 초고속 원심분리법(high speed centrifugation)을 이용하여 정제 과정을 거칠 수 있는 방법으로서, 소변 등 생체시료 내의 성분 중 성분 분석에 방해물질로 작용할 수 있는 성분을 미리 제거하여 시료의 기질효과(matrix effect)를 최소화할 수 있다. 일 구체예는 원심력은 30000~50000 g로 설정할 수 있으며, 바람직하게는 50000 g 에서 3분간 초고속 원심분리를 통해 효과적인 정제가 이루어질 수 있도록 수행가능하다.
상기 단계에서 방해 물질이 제거된 후, 희석단계로서 이후 분리 및 검출 단계에서 사용될 이동상의 초기 조성과 유사한 조성으로 소변 등 생체시료를 희석하는 것이 바람직하다. 이는 이후에 검출 단계에 액체 크로마토그래프에 분석을 위해 주입되는 시료와 액체 크로마토그래프의 이동상이 원활하게 혼합될 수 있어 이동상 내 분석 대상 성분의 확산을 최소화할 수 있게 한다. 이로써, 펜터민, 히드록시페터민 및 메펜터민의 분리능(resolution)을 개선하고 크로마토그램(chromatogram) 상의 피크(peak) 모양의 좌우 대칭 및 균형을 유지하여 정량성(quantification) 개선을 제공할 수 있다.
본 발명의 분리 및 검출 단계에서 검출기가 장착된 액체크로마토그래피법은 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 성분을 한번에 동시에 분석가능하고 크로마토그램 상의 피크(peak)의 폭이 좁고 모양이 대칭을 이루어 정량성이 있는 분리 및 분석이 될 수 있도록 조건을 설정하는 것이 바람직하다.
본 발명의 분리 단계에서 액체크로마토그래프용 분리관을 사용함으로써 분석 대상 물질을 바람직하게 분리할 수 있다. 이때 분리관으로는 카본과 C18 분리관을 사용할 수 있으며, C18 분리관을 사용하는 것이 바람직하며 이를 사용하는 경우, 분리능의 증가를 이룰 수 있고 분석 감도를 높혀, 더 소량의 성분을 검출해 낼 수 있다.
상기 분리 단계에서 액체크로마토그래프 이동상 조성으로 2 종류의 극성이 다른 이동상(mobile phase)을 사용할 수 있다. 이동상 A는 수소이온농도(pH)가 조정된 수용액을 사용하고, 이동상 B는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이들을 시간에 따라 농도 구배(gradient)를 갖는 상태로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 이동상 A 는 pH를 산성으로 조절하는 단계에서 개미산과 아세트산을 사용할 수 있으며 바람직하게는 개미산을 사용한다. 이동상에 유기산을 첨가함으로써, 유기산을 첨가하지 않았을 경우 이온화되는 비율이 너무 낮아 검출할 수 없는 화합물을 효과적으로 검출할 수 있다. 유기산을 첨가하는 경우 그 비율은 0.01~0.1%로 바람직하게는 0.05%로 피크 모양과 인텐서티(intensity)의 증가를 이룰 수 있어 정량범위 내에서 검량선의 직선성이 향상되어 분석감도의 개선을 제공한다.
상기 이동상 B는 아세토니트릴을 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 메탄올 등 극성이 높은 유기 용매를 사용할 수 있으며, 당업자는 임의의 목적에 따라 통상적인 유기 용매를 사용할 수 있다. 이때 이동상의 유량은 200~500 ㎕/min을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 400 ㎕/min 이다.
상기 분리 단계에서 이동상 A와 B는 시간에 따라 농도 구배를 줄 수 있는 데, 이동상이 0.05% 개미산이 포함된 증류수(이동상 A)와 아세토니트릴(이동상 B)로 구성되어 있는 경우, 이동상 A와 B의 혼합비가 시간에 따라 90:10~10:90의 비율로 농도 구배를 갖도록 조정하는 것이 바람직하다. 이때 분리관의 온도는 10~30 ℃를 유지할 수 있으며 바람직하게는 15 ℃를 유지한다. 상기 범위에서 본 발명의 분석 대상 성분에 대해 높은 분석감도 및 함량 측정의 높은 재현성을 제공한다.
상기 검출 단계에서 액체크로마토그래프의 분리관을 통과하여 분리된 시료는 검출기인 이중질량분석기(tandem mass spectrometer, MS/MS)에 장착된 이온화 장치를 이용하여 이온화시킬 수 있다. 이때 이온화 장치는 전자분무이온화(electrospray)와 대기압 화학적 이온화(atmospheric pressure chemical ionization) 방식을 사용할 수 있으며, 극성 물질 분석에 유리한 전자분무이온화 방식을 사용하는 것이 바람직하다. 이를 사용하는 경우, 검출한계(limit of detection)의 개선을 제공한다.
상기 검출 단계에서 분석 대상 성분을 이중질량분석기의 MRM(multiple reaction monitoring) 방식으로 함량을 측정하는 것은 선택성(selectivity)을 개선하기 위함이다. 즉, 모화합물(parent compound)의 분자량에 해당하는 이온을 첫 번째 사중극자(quadrupole)에서 선택적으로 통과시킨 후 이온을 충돌방(collision cell) 내에서 충돌 가스(collision gas)와 부딪혀 질량분석스펙트럼(product ion spectrum)이 생성된다. 이는 검출기로 이중질량분석기를 사용하여 얻은 개별 성분의 모 화합물로부터 생성된 물질의 고유한 특성을 나타내는 질량스펙트럼을 나타낸다. 질량스펙트럼의 특징적인 이온을 선정하여 MRM 방식으로 함량 측정 및 물질확인에 사용하여 검출하는 방식인 MRM 으로 분석을 시행하는 것이 방해물질의 간섭을 배제할 수 있어 검출감도 개선에 바람직하다. 이를 사용하는 경우, 높은 정확도로 여러 성분의 동시 분석이 가능하다.
본 발명에 따르면, 분석 대상 성분인 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 성분에 대해 분리관을 이용하여 검출하는 데 머무름 시간은 5분 이내이며, 일 구체예에 따르면 4.8분 이내에 모두 검출되었다.
본 발명에 따르면, 분석 대상 성분인 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 함량 측정을 위한 검량선 작성 시 가중요인 1, 1/x, 1/x2을 적용하여 측정의 정확도 및 정밀도를 개선할 수 있으며, 특히 분석 대상 성분 함량 측정의 정확도 개선에 유리한 1/x2을 가중요인으로 사용하는 것이 바람직하다. 이를 사용하는 경우, 미량 분석 시 측정의 정확도 개선을 제공한다.
본 발명에 따르면, 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민의 3개 성분을 동시에 정확하고 정밀한 함량 측정이 가능하며, 모 약물과 대사체의 비율을 측정하여, 펜터민 남용 및 메펜터민 복용 여부 확인 신속히 판별할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 소변 시료 중 하이드록시펜터민 및 그 유도체 펜터민과 메펜터민 성분에 대한 동시 신속분석법 확립
소변(urine) 시료 1 mL 가 담겨 있는 1.5 mL 폴리프로필렌 용기를 50,000 g로 3분간 초고속 원심분리하였다. 원심분리 단계에서 얻은 상층의 시료 400 ㎕에 아세토니트릴로 용해한 내부표준물질(0.15 μg/mL 농도의 testosterone-d5) 100 ㎕를 넣어 천천히 혼합한 후 시료 100 ㎕ 를 취하여 자동주입장치용 바이얼(vial)에 넣는다. 시료 중 일정량(5 ㎕)을 주입하여 액체크로마토그래프에 장착된 분리관을 이용하여 분석 대상 성분을 분리를 하였으며, 이중질량분석기를 검출기로 이용하여 각 성분을 확인하고 그 함량을 측정하였다.
상기 시료의 전처리 과정에서 신속하고 경제적인 시료 정제를 위해 초고속 원심분리법을 적용하였다. 신속성과 방해물질 제거의 효율성을 고려하여 원심분리 조건을 결정하였고 고강도 폴리프로필렌 용기에 시료를 넣고 50,000 g에서 3분간 원심분리하였다.
상기 시료의 희석단계에서 주입된 시료와 이동상이 원활하게 혼합되어 분석 대상 성분의 확산을 최소화하여 분리능을 개선하고 정량성 향상하기 위하여 초기 이동상의 조성과 유사한 조성으로 시료를 희석하였다.
상기 분리 단계에서 사용한 분석기기는 에이질런트(Agilent, USA)의 이원펌프(binary pump), 가스제거기(vacuum degasser), 자동주입장치(autosampler) 및 분리관 오븐(column oven)을 장착한 고압액체크로마토그래프(Agilent 1200 series, USA)이었다.
상기 분리 단계에 사용한 분리관으로는 역상 C18분리관 3종과 카본 충진 분리관 1종에 대해 비교의 편의성을 높이기 위해 이동상의 조성과 유량을 일정하게 설정한 후 분석 대상 성분의 머무름 시간과 피크 인텐서티를 비교하였다.
이때 분리관에 따라 분석 대상 성분의 머무름 시간 및 피크 인텐서티를 아래 표 1에 나타내었다.
구분 분리관
C18 충진제 카본 충진제
Capcell Pak MG-II C18
(150 mm X 2.0 mm i.d., 5 ㎛, Shiseido)		 Zorbax SB-C18 (100 mm X 2.0 mm, 3.5 ㎛, Agilent) Cadenza CD-C18 (100 mm X 2.0 mm, 3.0 ㎛, Imtakt) Hypercarb(50 mm X 2.1 mm, 5.0 ㎛, Thermo)
머무름
시간		 인텐서티 머무름
시간		 인텐서티 머무름
시간		 인텐서티 머무름
시간		 인텐서티
펜터민 6.66 15 e5 5.36 1.3 e5 5.59 1.3 e5 4.08 5.6 e4
메펜터민 6.99 9.2 e5 5.74 8.5 e5 5.96 6.0 e5 4.64 3.7 e5
하이드록시펜터민 7.64 2.7 e4 6.45 1.5 e4 6.67 1.3 e4 6.29 3000
표 1의 결과, 분리관으로 Capcell Pak MG-II C18 (150 mm X 2.0 mm i.d., 5㎛, Shiseido)을 사용하는 것이 분석 대상 성분의 분리능 향상 및 함량 측정 시 인텐서티 및 신호 대 잡음비 개선에 바람직하였다. 이를 사용하는 경우, 함량 측정의 분리능 및 검출한계 개선을 제공한다.
이동상으로는 유기산으로 0.05% 개미산이 포함된 증류수(이동상 A)와 유기용매로 아세토니트릴(이동상 B)을 사용하였고, 유속은 분석시간을 단축하면서도 피크의 인텐서티에 영향을 적게 주는 조건을 검색하였으며 본 발명에서는 이동상의 유속을 400 ㎕/min으로 흘려주었다. 분석 시 이동상의 유속(flow rate) 변화(200~500 ㎕/min)에 따른 머무름 시간의 변화는 도 2에 나타내었다.
이때 이동상 A에 유기산으로 개미산과 아세트산을 첨가한 후 분석 대상 성분의 머무름 시간, 피크 인텐서티 및 신호 대 잡음비(signal to noise ratio)를 측정하여 아래 표 2에 나타내었다.
구분 이동상
A : 0.1% 아세트산이 포함된 증류수
B : 아세토니트릴 		A : 0.1% 개미산이 포함된 증류수

B : 아세토니트릴
머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비 머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비
펜터민 3.04 5.9 e4 32.9 3.91 1.22 e5 35.3
메펜터민 4.30 1.0 e4 54.0 5.05 7550 29.7
하이드록시펜터민 3.42 6.0 e4 72.5 4.27 1.5 e5 301.6
표 2의 결과, 이동상 A의 유기산으로 개미산을 사용하는 것이 분석 대상 성분 함량 측정 시 인텐서티 및 신호 대 잡음비 개선에 바람직하였다. 이를 사용하는 경우, 검출한계의 개선을 제공한다.
상기 개선된 성능을 보이는 개미산이 첨가된 비율에 따른 이동상에 따른 분석 대상 성분의 머무름 시간, 피크 인텐서티 및 신호 대 잡음비를 아래 표 3에 나타내었다.
구분 이동상
A : 0.01% 개미산이 포함된 증류수
B : 아세토니트릴		 A : 0.05% 개미산이 포함된 증류수
B : 아세토니트릴		 A : 0.1% 개미산이 포함된 증류수
B : 아세토니트릴
머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비 머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비 머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비
펜터민 3.23 1.6 e5 23.8 3.80 1.5 e5 28.8 3.96 1.5 e5 52.2
메펜터민 4.44 1.1 e5 181.0 4.94 1.0 e5 173.1 5.09 9.4 e4 186.5
하이드록시펜터민 3.61 2.0 e5 407.3 4.15 1.8 e5 212.4 4.33 2.2 e5 393.4
표 3의 결과, 이동상 A의 유기산 첨가 비율로 0.05%를 사용하는 것이 분석 대상 성분 함량 측정 시 인텐서티 및 신호 대 잡음비 개선에 바람직하였다. 이를 사용하는 경우, 측정 시 검출한계 개선을 제공한다.
상기 개선된 성능을 보이는 이동상 A의 개미산이 첨가된 비율 0.05%에 따른 이동상 B에 따른 분석 대상 성분의 머무름 시간, 피크 인텐서티 및 신호 대 잡음비를 아래 표 4에 나타내었다.
구분 이동상
A : 0.05% 개미산이 포함된 증류수
B : 아세토니트릴		 A : 0.05% 개미산이 포함된 증류수
B : 메탄올
머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비 머무름
시간		 인텐서티 신호 대 잡음비
펜터민 3.74 1.5 e5 41.4 6.78 8.0 e4 33.8
메펜터민 4.91 7.8 e4 222.9 9.17 5.9 e4 147.0
하이드록시펜터민 4.11 1.9 e5 645.2 6.89 9.6 e4 191.7
이동상 조성의 농도 구배는 이동상 B의 비율을 10%에서 시작하여 5.5분 안에 30%로 상승시킨 후 다시 90%로 상승시킨 후 이동상 B를 10%에서 하강시켜 1분간 유지함으로써 분리관과 이동상의 평형이 이루어지도록 하였다. 상기와 같이 시간에 따라 이동상 A와 B의 혼합비를 달리하여 이동상 A와 B의 혼합용액으로 용리시키는 것은 분석 대상 물질을 높은 분석감도와 뛰어난 재현성을 가지고 함량을 측정할 수 있기 때문이다. 이때 분리관의 온도는 15 ℃를 유지하였다.
이때 검출기로 사용한 이중질량분석장치(tandem mass spectrometer, MS/MS)는 에이비사이엑스사(AB Sciex, USA)의 API 3200 Qtrap으로 전자분무이온화 장치를 장착하였으며, 시료 이온화에 사용된 조건은 양이온 모드에서 차단가스(curtain gas, Cur), 분무가스(nebulizer gas, GS1), 가열가스(heater gas, GS2)는 각각 30, 45, 65로 설정하였고 이때 사용된 가스는 질소였다. 이온화에 사용된 분무 전압은 +5000 V였으며, 이온화 장치 내의 온도는 550 ℃로 설정하였다.
분석 감도 및 선택성(selectivity)을 개선하기 위하여 모 화합물의 분자량에 해당하는 이온을 선정하고 다시 질소가스와 충돌에 의해 발생된 질량분석스펙트럼(도 4)에서 특징적인 이온(product ion)을 선정하여 검출하는 MRM 방식으로 분석을 수행하였다.
이때 정성 및 정량분석을 위한 분석 대상 물질의 머무름 시간, MRM 이온쌍 및 기기 조건을 아래 표 5에 나타내었다.
성분명 머무름
시간		 구분 이온쌍 기기조건(V)
DP EP CEP CE CXP
펜터민 3.71 정량이온 150-> 133 25 5 13 27 2.5
정성이온 150-> 91 25 5 13 13 2.5
펜터민-d5 (IS) 3.67 내부표준 155-> 96 28 9.5 14 29 2.6
메펜터민 4.05 정량이온 164-> 91 34 4 13.5 31 2.6
정성이온 164-> 133 34 4 13.5 15 2.6
하이드록시펜터민 4.80 정량이온 166-> 91 28 7.5 12.5 27 2.5
정성이온 166-> 133 28 7.5 12.5 13 2.5
하이드록시펜터민과 그 유도체인 펜터민과 메펜터민 및 내부표준물질을 동시에 분석하는 시간은 4.8분 이내였으며, 이때 크로마토그램을 도 1에 표시하였다. 이는 본 발명에 따른 검출기로 이중질량분석기가 장착된 액체크로마토그래프를 사용한 검출방법을 이용할 경우 분리 과정을 거쳐 MRM 이온쌍을 이용한 검출 단계에서 화학적 물성이 서로 다른 분석 대상 물질을 효과적으로 분리해 낼 수 있었다. 또한 분석 대상 성분이 소변 내에 포함되어 있는 성분과 간섭이 있는가를 확인하기 위해 기질효과(matrix effect)를 확인하였다. 도 4에 표시된 바와 같이 분석 대상 성분의 머무름 시간에서 기질에 의한 영향은 거의 없는 것으로 확인되었다.
본 발명을 이용하여 개별 성분의 검출한계와 정량한계 및 검량선의 변수를 측정한 결과를 아래 표 6에 나타내었으며, 이때 정량한계 선택 기준은 비정밀성과 부정확성(bias)이 20% 이내인 최저 농도로 선정하였고, 개별 성분의 함량 측정을 위해 크로마토그램에서 나타난 피크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량선을 작성하여 계산하였다.
구분 기울기
(a, mean ±SD)		 y-절편
(b, mean)		 결정계수
(r2)		 검출한계
(ng/mL)		 정량한계
(ng/mL)
펜터민 0.0187 ±0.0019 0.0530 0.9971 1.0 7.5
메펜터민 0.0570 ±0.0167 0.0738 0.9959 0.3 7.5
하이드록시펜터민 0.0318 ±0.0014 0.0011 0.9984 0.5 1.5
본 발명을 이용하여 분석 대상 성분인 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 측정의 정확도 및 정밀도를 개선을 위한 검량선 작성 시 가중요인 1, 1/x, 1/x2을 적용하여 미량분석 시 측정의 정확도 개선을 제공하고자 하였다.
이때 가중요인에 따라 정량한계에 대한 정확도를 정성 및 정량분석을 위한 분석 대상 물질의 정확도를 아래 표 7에 나타내었다.
구분 측정농도
(ng/mL)		 정확도 (%)
x 1/x 1/x2
펜터민 7.5 -50.0 -9.3 1.4
메펜터민 7.5 -155.1 -38.8 -12.0
하이드록시펜터민 1.5 68.1 24.6 15.5
표 7의 결과, 가중요인으로 1/x2이 사용하는 것이 분석 대상 성분 함량 측정의 정확도 개선에 바람직하였다. 이를 사용하는 경우, 미량 분석 시 측정의 정확도 개선을 제공한다.
분석법의 유효화(validation)는 소변에서 분석 대상 물질의 함량을 측정하는 데에 사용되는 특정 분석법이 믿을만하고 재현성이 있다는 것을 증명하는 일련의 과정으로, 본 발명을 이용하여 개발된 분석법의 유효화 요소로 정밀도와 정확도를 선정하여 측정하였다.
측정은 일내, 일간 정밀도를 측정하여 나타내었으며, 그 결과는 아래 표 8과 같다.
구분 측정농도
(ng/mL)		 일내(n=6) 일간 (n=24)
정밀도
(% CV)		 정확도
(% bias)		 정밀도
(% CV)		 정확도
(% bias)
펜터민


 7.5 3.4 -10.8 7.0 -1.3
20 0.9 -4.9 3.2 -2.1
75 0.5 -1.9 1.9 -3.3
300 1.5 -1.3 2.8 -5.1
메펜터민


 7.5 2.0 6.1 9.8 0.8
20 7.6 1.0 2.8 1.7
75 1.8 10.9 4.6 4.1
300 1.1 4.6 6.4 -4.6
하이드록시펜터민


 1.5 1.5 -5.9 10.7 -0.7
4.0 0.4 -6.1 3.7 -4.1
15 2.0 -2.9 2.1 -3.6
60 1.8 1.0 2.8 -2.6
표 8의 결과, 분석법의 정밀도는 정량한계와 저, 중, 고 3개 농도의 QC(quality control) 시료로 측정하였고 분석 대상 물질 모두에 대해 일내 정밀도는 7.6% 이내였고 정확도는 -10.8~10.9%였고, 일간 4세트 분석한 결과 10.7% 이내의 정밀도와 정확도는 -5.1~4.1%의 결과를 나타내었다. 본 발명의 일내, 일간 정밀도 및 정확도 값은 미국 식품의약품안전청 가이드라인(US FDA guidance on bioanalytical methods validation 2001) 기준인 20%(검출한계, LOQ) 및 15%(저농도, 중간농도, 고농도) 이내에 부합하는 양호한 값임을 확인할 수 있었다.
본 발명을 이용하여 분석 대상 성분인 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 측정범위 확장을 위해 시료 희석율 2.5, 5, 10 및 20배를 적용하여 분석 시 측정의 정량범위 개선을 제공하고자 하였다. 희석과정 후 함량 측정이 믿을만하고 재현성이 있다는 것을 증명하는 유효화 요소로 정밀도와 정확도를 선정하여 측정하였고 그 결과는 아래 표 9에 표시하였다.
구분 측정농도
(ng/mL)		 희석배수 정밀도
(% CV)		 정확도
(% bias)
펜터민



 75
 2.5 2.5 2.4
5 14.2 6.9
300

 5 1.9 6.5
10 4.5 3.8
20 5.6 1.0
메펜터민



 75
 2.5 3.2 6.0
5 5.9 13.6
300

 5 2.6 13.2
10 2.4 13.2
20 2.0 11.1
하이드록시펜터민



 15
 2.5 5.4 -0.5
5 1.6 -0.6
60

 5 1.8 2.5
10 1.3 -1.8
20 3.0 -5.3
표 9의 결과, 희석율을 2.5-20배 적용하였을 때, 분석법의 정밀도 및 정확도는 14.2% 이내였고 정확도는 -5.3~13.6%의 결과를 나타내었다. 본 발명의 정밀도 및 정확도 값은 미국 식품의약품안전청 가이드라인(US FDA guidance on bioanalytical methods validation 2001) 기준인 15%(저농도, 고농도) 이내에 부합하는 양호한 값임을 확인할 수 있었다. 이는 분석법의 정량 범위의 상한선을 넘어서 2.5-20배까지 정량할 수 있다는 의미이다. 예컨대, 정량 범위가 1-100인 경우, 20배 희석을 하면 1-2000까지 정량이 가능하다는 의미이다. 일반적으로 검량 범위 를 넘어서는 경우 외삽법을 사용해서 함량을 측정할 수 없으나, 시료를 일정 배수 희석한 데이터의 유효화(정밀도 및 정확도 측정) 과정을 거친 경우, 시료의 희석 과정을 통해 검량 범위를 넘어 20배까지 함량 측정이 가능하다는 의미가 되므로, 본 발명은 메펜터민, 펜터민, 하이드록시펜터민 함량 측정의 확장성을 확보하였음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 실제 펜터민 투여자에 대한 펜터민 남용 및 메펜터민 복용 여부 판별
실제 펜터민 복용자 6명의 소변을 실시예 1의 동시 분석법으로 측정하였으며, 그 결과를 아래 표 10 및 도 5에 나타내었다.
이때 하이드록시펜터민 및 펜터민에 대한 함량 측정결과와 하이드록시펜터민 대비 펜터민의 농도비를 아래 표 10에 나타내었다. 도 5는 하기 표 10의 일 구체예로서 시료번호 S128071의 소변 시료의 분석 결과를 보여준다. 메펜터민은 검출이 되지 않았고, 하이드록시펜터민 48.1 ng/mL과 펜터민 6249.8 ng/mL이 동시에 검출되었다.
시료번호 펜터민
(ng/mL)		 하이드록시펜터민
(ng/mL)		 농도비
(펜터민/하이드록시펜터민)
S117341 5234.9 25.4 206.5
S118731 393.4 불검출 -
S128071 6249.8 48.1 129.9
S136311 6923.0 43.0 161.0
S136321 5060.5 17.1 295.9
S136412 2673.3 6.3 424.3
메펜터민과 펜터민의 대사과정을 보면, 메펜터민이 대사되어 펜터민 생성이 된 후 하이드록시펜터민이 생성되는 비율은 극히 적다고 알려져 있다. 따라서, 하이드록시펜타민이 검출되는 경우, 메펜터민이 아니라 펜터민으로 부터 대사된 것으로 추정될 수 있다.
또한, 표 10의 결과에 따르면, 본 발명의 분석법으로 측정된 펜터민의 농도범위는 393.4-6923.0 ng/mL으로 측정되었으며 하이드록시펜터민은 6.3~48.1 ng/mL로 측정되었다. 이를 근거로 하이드록시펜터민 대비 펜터민의 농도비를 측정한 결과 129.9 -424.3배로 확인되었다.
피검자의 소변에서 펜터민이 검출되는 경우, 피검자는 펜터민 복용을 부인하며, 메펜터민을 복용하였다고 진술하는 경우가 있었다. 이 경우, 하이드록시펜터민을 동시 검출하기 전까지는 피검자의 메펜터민 또는 펜터민의 복용의 진위 여부를 확인할 수 없었다. 그러나 본 발명에서 메펜터민, 펜터민과 함께 하이드록시펜터민을 동시에 분석할 수 있게 됨으로써, 하이드록시펜터민이 검출되는 경우, 메펜터민의 복용에 의한 것이 아니라 펜터민 남용에 의한 것임을 추정할 수 있고, 나아가 펜터민 대 하이드록시펜터민 비율이 129.9-424.3 인 경우, 피검자의 소변에서 펜터민이 검출되는 경우, 펜터민 남용에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 동시분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법으로서
    (a) 초고속 원심분리법을 이용하여 소변 시료 중 분석 방해물질을 제거하는 전처리 단계;
    (b) 상기 원심분리된 시료를 희석(dilution)하는 단계;
    (c) 상기 희석된 시료를 검출기가 장착된 액체크로마토그래피(liquid chromatography) 법으로 분리 및 검출하는 단계를 포함하며, 상기 분리 및 검출하는 단계에서, 액체크로마토그래프의 이동상은 2종류를 사용하며, 하나의 이동상(A)은 개미산 또는 아세트산의 유기산을 0.01~0.1% 포함하는 증류수를 사용하며, 나머지 하나의 이동상(B)는 아세토니트릴 또는 메탄올의 유기용매를 사용하며, 상기 이동상 A와 B의 혼합비가 시간에 따라 90:10~10:90의 비율로 농도 구배를 가지도록 하며, 내부표준물질은 펜터민-d5을 사용하며, 상기 분리 단계에서, 하이드록시펜터민, 펜터민, 메펜터민 및 내부표준물질의 머무름 시간(retention time)은 4.8분 이내이며,
    (d) 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 동시 분석법에 의해 각각의 상기 화합물을 정량하는 단계; 및
    (e) 상기 정량 단계에서 하이드록시펜터민 유무를 확인하여 펜터민 남용을 확인하는 단계를 포함하며,
    단, 상기 동시 분석법에 의한 펜터민 남용 여부를 확인하는 방법에서, 메펜터민만을 복용한 복용자의 소변 분석시 하이드록시펜터민은 검출되지 않으며, 하이드록시펜터민이 검출되는 경우 마약류 펜터민 복용에 의해 펜터민 대사에 의해 발생한 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 전처리 단계에서 분석 방해물질 제거에 사용되는 초고속 원심분리는 30000~50000 g 에서 3 분 이내로 수행하는 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 분리 및 검출하는 단계에서 분리관은 충진제로 C18 또는 카본으로 구성된 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 분리 및 검출하는 단계에서, 액체크로마토그래프의 분리관 온도는 15 ~ 30 ℃로 설정하고, 이동상의 유량은 200~500 μg/mL로 설정하는 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 분리 및 검출 단계에서 소변 시료 중 정량범위는 하이드록시펜터민은 1.5~2000 ng/mL이며 펜터민과 메펜터민은 7.5~10000 ng/mL인 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 검출 단계에서 소변 시료 중 정량성 개선을 위하여 검량선(calibration curve) 작성 시 가중요인(weighting factor) 1, 1/x, 1/x2을 적용 가능한 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 동시 신속분석법은 일내(n=6) 정밀도(precision)와 정확도(accuracy)가 각각 7.6% 이내와 -10.8~10.9%이며, 일간(n=24) 정밀도와 정확도는 10.7% 이내와 -5.1~4.1% 인 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 동시 신속분석법은 하이드록시펜터민, 펜터민 및 메펜터민 시료 희석율 2.5, 5, 10 및 20배를 적용하여 분석 시 측정의 정량범위를 확장이 가능한 것을 특징으로 하는 하이드록시펜터민, 펜터민, 및 메펜터민 동시 신속분석법으로부터 마약류 펜터민 남용여부를 확인하는 방법.
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