KR100902571B1 - 액체크로마토그래피를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시분석방법 - Google Patents

액체크로마토그래피를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 시료의 pH를 8~10으로 조절하는 제 1 단계;
상기 제 1 단계에서 얻은 시료를 고체상 추출법을 수행하는 제 2 단계; 및
상기 제 2 단계에서 얻은 시료를 포름산을 이용하여 pH 3~5로 조절한 암모늄 포메이트 완충용액 및 유기 용매를 이동상으로 하며, 상기 완충용액 및 유기 용매의 혼합비가 95:5~20:80이 되도록 시간에 따라 농도구배를 주면서 액체 크로마토그래피 분석컬럼을 통과시켜 분리하는 제 3 단계를 포함하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 디메틸암페타민, 메스암페타민, 엠디엠에이, 엠디엠에이 및 각각의 대사체를 포함한 총 7 성분을 동시에 분석할 수 있어 신속하고 경제적이며, 고체상 추출컬럼 및 분석컬럼을 이용하여 바람직한 분석감도를 확보할 수 있으며, 동위원소가 치환된 내부표준물질을 사용하여 종래기술에 비해 정확도 높은 분석을 수행할 수 있다.
디메틸암페타민, 암페타민 유도체, 다성분 동시 분석, 액체크로마토그래피, 질량분석기

Description

액체크로마토그래피를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시분석방법{Simultaneous determination of demethylamphetamine, amphetamine and their metabolites by liquid chromatography}
본 발명은 액체크로마토그래피를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료의 pH를 조절하여 추출하고, 고체상 추출법으로 정제한 후, pH를 조절한 완충용액과 유기용매의 농도구배를 이용하여 액체크로마토그래피를 통해 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 총 7 종의 성분을 동시에 분석하는 방법에 관한 것이다.
환각효과를 갖는 암페타민계 유도체 범주에 포함되는 마약류는 암페타민(AP, amphetamine), 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 엠디이에이 (MDEA, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine) 등이다. 특히 국내에서 가장 많이 남용되는 마약인 메스암페타민은 중추신경 흥분 작용을 일으키며 체내 대사과정을 거쳐 대사체로 암페타민이 형성된다. 다음으로 남용 빈도가 높은 암페타민계 마약은 엠디엠에이로 주요 대사체는 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine)이며 1990년대 후반 이후 남용이 급증하였다. 이러한 메스암페타민과 엠디엠에이의 급격한 남용 증가는 심각한 사회적 문제가 되었다.
2002년 이후 메스암페타민의 아민기에 메틸기가 첨가된 구조의 신종 마약 디메틸암페타민(DMA, dimethylamphetamine)이 밀반입되어 국내 유통 사례가 빈번하자 2006년 12월 향정신성의약품으로 추가 지정되었다. 디메틸암페타민은 체내 대사과정을 거쳐 디메틸암페타민엔옥사이드(DMANO, dimethylamphetamine-N-oxide), 메스암페타민, 암페타민이 대사체로 생성 된다(Inoue and Suzuki, Xenobiotica, 17 (1987) 965; Beckett and Al-Sarraj, Biochem. J., 130 (1972) 32). 특히 디메틸암페타민과 디메틸암페타민엔옥사이드는 열에 불안정한 물질로 고온에서 작동하는 기체크로마토그래피를 이용한 분석법 적용에 어려움이 있는 것으로 보고되어 있다(Sato et al., Forensic Sci Int., 128 (2002) 146). 따라서 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용해서 디메틸암페타민 복용자의 시료를 분석하게 되면 디메틸암페타민과 디메틸암페타민엔옥사이드의 두 가지 물질은 확인이 어렵고 반면에 메스암페타민과 암페타민의 검출은 용이하다. 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석 결과는 디메틸암페타민을 검출하지 못하게 되는 경우 메스암페타민 복용자의 시료를 분석한 결과와 동일한 결과를 얻게 되므로 따라서 기체크로마토그래피를 이용한 분석법으로는 디메틸암페타민과 메스암페타민 중 어느 약물을 복용한 경우인지를 판별하기 어렵게 된다. 이는 메스암페타민과 디메틸암페타민 모두 체내 대사산물로 메스암페타민과 암페타민을 포함하고 있기 때문이다.
상기에 언급한 바와 같이, 디메틸암페타민의 경우 체내 대사과정을 거쳐 생성된 주요 대사체인 디메틸암페타민엔옥사이드의 효과적인 분석을 위해서는 물질의 열적 안정성을 고려해야하며, 이러한 안정성을 해치지 않는 분석방법이 요구된다. 또한 다양한 종류의 마약류가 빠르게 확산됨에 따라 여러 마약류를 동시에 신속하고 효과적으로 확인할 수 있는 다성분 동시 분석방법이 구축되어야 한다.
메스암페타민, 엠디엠에이, 엠디이에이, 디메틸암페타민의 복용 여부를 판별하기 위해서는 모약물(parent drug)인 메스암페타민, 엠디엠에이, 엠디이에이, 디메틸암페타민 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민, 디메틸암페타민엔옥사이드, 엠디에이를 모두 포함한 7종을 분석해야 한다.
마약류 복용 여부 확인에 광범위하게 사용되는 분석방법으로는 주입된 시료가 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 시료를 성분별로 분리하는 고온의 주입구를 통해 시료를 주입하여 분석하는 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법(Kikura et al., J. Chromatogr. B, 741 (2000) 163)과 상온에서 시료를 이온화하여 분석하는 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법(Cheng et al., Forensic Sci Int., 166 (2007) 146; Sato et al., Forensic Sci Int., 128 (2002) 146; Katagi et al., J. Anal. Toxicol., 24 (2000) 354)이 보고되어 있다.
그러나 이러한 분석법들은 상기에 소개한 7 종의 약물중 일부분을 분석하는 방법이어서 남용빈도가 높은 마약류를 모두 분석하기 위해서는 각각의 약물에 대해 실험방법을 달리하여 실험을 수행해야 하므로 시간이 많이 소요되고 분석 비용도 증가하는 단점이 있다. 특히 종래의 디메틸암페타민 분석법 중 기체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법은 디메틸암페타민과 디엠에이엔옥사이드 분석에 효과적이지 않으며 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법의 경우 분석대상물질에 대한 보고된 분석 감도가 충분치 않아 피채취자의 인권을 고려하여 다량의 시료를 채취하기 어려운 경우에는 분석 대상 약물의 농도가 검출한계 이하가 되어 분석의 실효성이 떨어지게 된다.
따라서 여러 종류의 마약류를 동시에 분석할 수 있는 방법의 개발과 열적 안정성이 낮은 물질의 분석에 적합하며, 소량의 시료에서도 충분한 분석감도를 확보할 수 있으며 신속하고 미량분석이 가능한 분석방법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.
상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 본 발명은 액체크로마토그래피 및 질량분석기를 이용한 분석방법을 연구한 결과, 적합한 완충용액을 이용한 시료의 pH 조절, 자동화된 고체상 추출법의 정립, 액체크로마토그래피-질량분석기에 주입하여 소량의 시료로도 바람직한 분석감도를 확보하며, 추출조작을 자동화하여 절차를 간편하게 하여 운전을 용이하게 하는 것을 목적으로 하고 종래와 다른 시료의 pH 설정, 이동상 및 분석컬럼 등의 사용을 통하여 화학적 물성이 다른 다수의 마약류 성분을 검출 및 정량할 수 있는 방법 제공을 목적으로 한다.
다만, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 평균적 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 구현예는 시료의 pH를 8~10으로 조절하는 제 1 단계; 상기 제 1 단계에서 얻은 시료를 고체상 추출법을 수행하는 제 2 단계; 및 상기 제 2 단계에서 얻은 시료를 포름산을 이용하여 pH 3~5로 조절한 암모늄 포메이트 완충용액 및 유기 용매를 이동상으로 하며, 상기 완충용액 및 유기 용매의 혼합비가 95:5~20:80이 되도록 시간에 따라 농도구배를 주면서 액체 크로마토그래피 분석컬럼을 통과시켜 분리하는 제 3 단계를 포함하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분은 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 엠디이에이(MDEA, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine), 디메틸암페타민(DMA, dimethylamphetamine) 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민(AP, amphetamine), 디메틸암페타민엔옥사이드(DMANO, dimethylamphetamine-N-oxide), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine)인 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 제 1단계에서 시료의 pH를 9로 조절하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 상기 제 1 단계의 시료의 pH는 탄산염 완충용액을 사용하여 조정하여 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 상기 제 2 단계의 고체상 추출법에 사용되는 고체상 추출 컬럼은 친지용성과 친수용성을 함께 가지고 있는 컬럼충진제를 사용 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 상기 제 2 단계의 고체상 추출법에서는, 컬럼의 활성화, 시료의 주입, 세척과정, 분석물질의 용리 단계를 포함하는 자동화된 고체상 추출법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 상기 제 3 단계는 액체 크로마토그래피 분석 컬럼을 통과시켜 분리된 시료를 질량분석기(Mass spectrometry)로 분석하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일구현예는 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 동위원소가 치환된 내부표준물질을 이용하여 정량하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유 도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
기타 본 발명의 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 본 발명에 의하면 한번의 분석으로 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 총 7 성분을 동시에 분석할 수 있어 분석을 신속하게 할 수 있으며, 좀 더 정확도 높은 분석을 할 수 있다.
이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며, 본 발명은 후술할 청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명은 본 발명은 시료의 pH를 8~10으로 조절하는 제 1 단계;
상기 제 1 단계에서 얻은 시료를 고체상 추출법을 수행하는 제 2 단계; 및
상기 제 2 단계에서 얻은 시료를 포름산을 이용하여 pH 3~5로 조절한 암모늄 포메이트 완충용액 및 유기 용매를 이동상으로 하며, 상기 완충용액 및 유기 용매의 혼합비가 95:5~20:80이 되도록 시간에 따라 농도구배를 주면서 액체 크로마토그래피 분석컬럼을 통과시켜 분리하는 제 3 단계를 포함하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법을 제공한다.
본 발명의 분석대상인 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체는 총 7종으로 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 엠디이에이(MDEA, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine), 디메틸암페타민(DMA, dimethylamphetamine) 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민(AP, amphetamine), 디메틸암페타민엔옥사이드(DMANO, dimethylamphetamine-N-oxide), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine)이며, 다음의 화학식 1 내지 7로 표시된다.
Figure 112009007567738-pat00001
Figure 112009007567738-pat00002
Figure 112009007567738-pat00003
Figure 112009007567738-pat00004
Figure 112009007567738-pat00005
Figure 112009007567738-pat00006
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본 발명의 상기 분석 방법에서, 제 1 단계를 수행하는 것은 시료로부터 분석 대상 마약류 성분의 추출하기위해 pH의 조절 없이 처리할 경우 회수율이 낮아 정량분석에 어려움이 많기 때문이다.
따라서 pH를 조절하여 낮은 회수율을 높이기 위하여, 고체상 추출과정 처리단계에 먼저 시료에 완충용액을 첨가하여 pH를 알칼리 상태로 조절하는 것이며 바람직하게는 pH 8~10으로 조정한다. 이를 벗어나는 경우, 도 1에서 나타나듯이 현저히 회수율이 낮아진다.
이때 완충용액으로는 회수율을 높일 수 있는 탄산염 완충용액을 사용하는 것이 바람직하나 임의의 목적에 따라 통상적으로 사용하는 완충용액을 변경하여 사용할 수 있다. 또한, 그 농도는 0.2 M 이 바람직하다.
또한, 상기 제 2 단계에서 자동화된 고체상 추출법을 이용할 수 있는데, 추출컬럼을 이용하여 용리액(eluent)의 바람직한 정제과정을 거쳐 매트릭스 효과(matrix effect: 정량하고자하는 시료 또는 다른 매트릭스의 영향으로 실제 보 다 적게 검출되거나 그 반대로 많은 양이 있는 것처럼 나타나는 현상)를 줄이고, 추출조작을 자동화하여 절차를 간편하게 하여 운전을 용이하도록 하는 것이다.
이때 추출컬럼으로는 크로마토그램(chromatogram) 상의 분석 대상 마약류의 피이크(peak)의 모양이 대칭을 이루고 높은 회수율을 얻을 수 있는 추출컬럼인 친수용성(hydrophilicity)과 친지용성(lipophilicity) 모두를 포함하는 컬럼의 사용이 바람직하다.
이 과정을 거침으로써 시료의 매트릭스 효과가 감소하여 정제 상태가 바람직하며, 재현성이 높고, 일정한 머무름 시간을 가지고 정량분석을 할 수 있다.
상기 제 3 단계에서 2 종류의 극성이 다른 이동상을 사용할 수 있다. 한 종류(이동상 A)는 완충용액을 사용하고, 다른 한 종류(이동상 B)는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이들을 시간에 따라 농도구배를 가지는 상태로 사용하는 것이 바람직하다.
이동상 A는 완충용액으로 pH를 산성으로 조절할 수 있으며, 바람직하게는 pH 3~5로 조절한다. 이를 벗어나는 경우, 총 7 종의 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분을 효과적으로 분리해 내지 못해 동시에 분석이 불가능해진다.
이동상 A는 포름산으로 pH를 4로 조정하고, 5 mM 암포늄 포메이트 완충용액을 사용하는 것이 바람직하다. 이동상 B는 극성이 높은 유기 용매를 사용할 수 있으며, 아세토니트릴을 사용할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 임의의 목적에 따라 통상적인 유기 용매를 사용할 수 있다.
이동상의 유량은 200~250μL/min을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 230 μL/min이다.
이동상 A와 B는 시간에 따라 농도구배를 줄 수 있는 데, 이동상이 5 mM 암모늄 포메이트(pH 4.0)(이동상 A)와 아세토니트릴(이동상 B)로 구성되어 있는 경우, 이동상 A와 B의 혼합비가 95:5 ~ 20:80이 시간에 따라 농도구배를 가지도록 조정하는 것이 바람직하다. 상기 범위에서 본 발명의 총 7 종의 모든 약물을 높은 분석감도 및 높은 재현성을 가지고 정량분석할 수 있다.
상기 농도 구배는 이동상 B의 비율을 5%에서 시작하여 8분 안에 80%로 상승시킨 후 1 분간 유지한 다음, 이동상 B를 5%에서 6분간 유지함으로써 컬럼내 이동상의 평형을 유지하는 것이 더욱 바람직하다. 이때 컬럼의 온도는 30℃를 유지할 수 있다.
또한, 상기 이동상 A의 완충용액에 유기산을 첨가함으로써, 유기산을 첨가하지 않았을 경우 이온화되는 비율이 너무 낮아 검출할 수 없는 약물(예를 들면 디메틸암페타민)을 효과적으로 검출할 수 있다. 유기산을 첨가하는 경우, 피이크 모양과 인텐서티(intensity)의 증가를 이룰 수 있어 정량범위내의 직선성이 향상되어 분석감도의 개선을 제공한다.
이때, 유기산으로는 포름산(formic acid)을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한편, 고성능 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 시료를 분석하는 경우, 먼저 액체크로마토그래피의 분석컬럼의 고정상과 이동상 사이에서 흡착성 또는 분배계수의 차를 이용하여 분리된 성분들은 머무름 시간의 차이를 두고 질량분 석기로 도입된다. 도입된 시료는 이온화 장치에 의하여 이동상은 제거되고 분석물질들이 이온화된다.
본 발명에서는 상기 제 3 단계에서 분석컬럼으로 역상컬럼을 사용함으로써, 분석물질을 바람직하게 검출할 수 있다. 이때 역상컬럼으로는 C18과 C8 컬럼을 사용할 수 있으며, C18 컬럼을 사용하는 것이 바람직하며, 이를 사용하는 경우, 분리능(resolution)과 인텐서티의 증가를 이룰 수 있어 검출감도 개선을 제공한다.
상기 액체크로마토그래피의 분석컬럼을 통과하여 분리된 시료는 질량분석기로 도입하여 질량분석기에 장착된 전자분무(electrospray) 이온화장치를 이용하여 이온화시킬 수 있다.
상기 질량분석기로 분석하는 단계에서 정량분석시 질량분석기의 MRM(multiple reaction monitoring) 모드에서 정량하는 것은 신호대잡음비(signal to noise ratio)을 개선하기 위한 것이다. 즉, 모 약물(parent drug)의 분자량에 해당하는 이온을 첫번째 사중극자(quadrupole)에서 선택적으로 통과시킨 후 이온을 충돌장치(collision cell)내에서 질소 가스와 충돌하여 생성되는 이온(product ion)을 두 번째 사중극자에서 검출하는 방식인 MRM 모드에서 분석을 시행하는 것이 바람직하다.
MRM을 이용하는 경우에는 같은 질량을 가진 이온이라도 한 번 더 깨지면 분자구조가 다른 경우 또 다시 깨진 이온은 다른 경향을 나타내므로 이를 정량이온쌍으로 쓰면 백그라운드(back-ground)에서 방해되는 성분이 제거되어 한 층 더 깨끗한 크로마토그램 베이스라인(base-line)을 얻을 수 있으므로 분석감도가 개선되며 높은 정확도로 다양한 종류의 마약류 성분들을 동시에 분석할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 시료인 소변의 pH를 조절하는 제 1 단계
사람의 소변 1 mL를 취하여 75 μL의 내부표준용액(1.0 μg/mL for AP-d 8 , MA-d 11 , MDA-d 5 and MDMA-d 5 , MDEA-d 5 , DMANO-d 3 and 2.0 μg/mL for DMA-d 3 )이 첨가된 시험관에 분취한 후 0.2 M 탄산염 완충용액 1 mL를 첨가하여 pH를 pH 9.0으로 조정하였다. 시료의 pH는 pH 8~12 범위에서 각각의 분석물질의 회수율을 고려하여 결정하였으며, 특히 주요 대사체인 암페타민과 엠디에이의 회수율을 중요시 하였다. 비교 결과는 도 1에 나타내었다.
2. 시료에 자동화된 고체상 추출법을 수행하는 제 2 단계
사람의 소변으로부터 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 검출시 얻어지는 추출 용리액은 소변내의 매트릭스 영향에 의해 검출량의 가감이 생길 수 있다.
따라서 제 2 단계에서는 이러한 소변내 매트릭스의 영향을 감소시키고 분석물질의 회수율을 높이기 위하여, pH가 조절된 소변 시료에 자동화된 고체상 추출법을 수행하였다.
이때 자동화된 고체상 추출장치를 사용하는 것은 추출조작을 자동화하여 절차를 간편하게 하고 운전을 용이하도록 하는 것과 운전자로부터 발생되는 오차의 요소를 제거하여 높은 정확도를 가지고 분석을 수행할 수 있기 때문이다.
고체상 추출 컬럼으로는 친지용성과 친수용성을 함께 가지고 있는 컬럼충진제가 포함된 카트리지(Waters Oasis HLB extraction cartridge, 6 mg/3 mL)를 사용하였으며 이때 사용된 자동화된 고체상 추출장치(Rapid Trace SPE workstation, Caliper Life Science, USA)를 사용할 수 있다. 추출조건은 메탄올 2 mL와 증류수 2 mL를 10 mL/min의 유속으로 카트리지에 순차적으로 흘려주어 컬럼을 활성화한 후 pH가 조절된 소변 시료를 2 mL/min의 유속으로 흘려주었다. 컬럼 세척을 위해 메탄올/증류수(3:7, v/v) 혼합용액 5 mL/min의 유속으로 1 mL를 흘려준 다음 메탄올/0.1 M 염산 혼합용액 1 mL를 2 mL/min의 유속으로 카트리지에 통과시켜 디메틸암페타민과 암페타민 유도체 성분을 용출시킨다.
3. 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하여 디메틸암페타민과 암페타민 유도체의 농도를 정량분석하는 제 3 단계
상기 제 2 단계에서 얻은 용리액을 증발시킨 잔사를 아세토니트릴/5 mM 암모늄 포메이트(1:1, v/v) 혼합용액 150 μL에 녹여 일정량(3 μL)을 액체크로마토그래피에 통과시키는 실험을 수행하였다.
이때 사용한 기기는 에질런트사의 이원펌프(binary pump), 진공가스제거기(vaccum degsser), 자동주입장치 및 컬럼오븐을 장착한 액체크로마 토그래피 (Agilent 1100 HPLC system, USA)이었다. 사용한 컬럼으로는 길이가 150 mm, 내경이 2.0 mm, 입자크기가 5 μm인 시세이도사의 C18 분석컬럼(Capcell Pak MG-Ⅱ C18, Japan)을 사용하였다.
또한 이동상으로는 포름산으로 pH를 조절한 5 mM 암모늄 포메이트(pH 4.0) 수용액(이동상 A)와 아세토니트릴(이동상 B)을 사용하였고, 유속은 230 μL/min으로 흘려주었으며 분석시의 이동상 조성 변화 조건은 도 2에 나타내었다. 즉 이동상 조성의 구배는 이동상 B의 비율을 5%에서 시작하여 8분 안에 80%로 상승시킨 후 1 분간 유지하였다. 다음 이동상 B를 5%에서 6분간 유지함으로써 컬럼내 이동상의 평형을 유지하였다.
이때 컬럼의 온도는 30℃를 유지하였다. 상기와 같이 시간에 따라 이동상 A와 B의 혼합비를 달리하여 이동상 A와 B의 혼합용액으로 용해시키는 것은 분석물질을 높은 분석감도 및 재현성을 가지고 정량분석할 수 있기 때문이다.
그 결과 도 3에서 나타난 것처럼, 본 발명의 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 소변 중 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 검출방법을 이용할 경우 분석컬럼을 통과시키는 단계에서 화학적 물성이 서로 다른 분석 물질을 분리해 낼 수 있었다.
이때 검출기로 사용한 질량분석장치(MS, mass spectrometer)는 미국 어플라이드바이오시스템즈 사이엑스사의 API2000 LC-MS로 전자분무 이온화기를 장착하였으며, 물질을 이온화시킬 때의 조건은 양이온 모드에서 분무가스, 차단가스, 네블라이징(nebulizing) 가스의 압력은 각각 35, 75, 40로 설정되었고 사용된 가스는 질소이다. 이때 분무 전압은 +5500 V, 그리고 분무시의 온도는 450℃로 설정하였다.
또한 신호대잡음비(signal to noise ratio)를 개선하기 위하여 모약물의 분자량에 해당하는 이온을 선정하고 다시 질소가스와 충돌에 의해 발생된 특징적인 이온(product ion)을 검출하는 MRM 모드에서 분석을 수행하였다.
정성 및 정량분석을 위한 분석 대상물질의 MRM 이온쌍을 표 1에 나타내었고, MRM 모드에서 질량분석기로 검출한 바탕소변, 분석물질이 첨가된 소변, 디메틸암페타민 복용자의 소변 분석결과를 도 5에 나타내었다.
그 결과 도 4에서 나타낸 것처럼, 본 발명의 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 분석방법을 이용하여 화학적 물성이 다른 7종의 마약류를 모두 정성, 정량분석할 수 있었다. 이는 소변내 매트릭스 효과를 개선하였으며, 실제 마약 복용자의 소변에 본 발명의 분석법을 적용했을 때 산업이용가능성이 크다는 것을 나타낸다.
정량분석은 크로마토그램에서 나타난 피이크의 면적을 합한 후, 내부표준법을 적용하여 검량선을 그려 함량을 결정하였다. 실제 디메틸암페타민 복용자의 소변에서 정량분석 결과를 표 2에 나타내었다.
Figure 112009007567738-pat00008
Figure 112009007567738-pat00009
4. 본 발명 및 종래 기술의 분리 성능 비교
본 발명의 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 분석방법을 이용하여 디메틸암페타민, 디메틸암페타민엔옥사이드, 메스암페타민, 암페타민에 대한 검출한계(LOD, limit of detection) 값을 종래의 디메틸암페타민 분석법 중 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 분석방법과 비교하였다.
종래 기술로써, Katagi et al., 2000, Sato et al., 2002 및 Cheng et al., 2007의 방법을 본원 발명과 비교하였으며, 그 결과를 표 3에서 보여주고 있다.
본 발명
상기 제 1단계 내지 3단계에 의해 수행된 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 총 7 종의 화합물의 검출한계를 보여주고 있다.
Katagi et al., 2000 방법
액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 아세트산을 이용하여 소변 시료를 pH 5로 조절한 후 추출 컬럼으로 Bond Elut SCX 카트리지를 이용하여 고체상추출법을 수행한 다음 시료를 아세트니트릴/5 mM 암모늄 아세테이트 혼합용액(65:35, v/v)을 이동상으로 하여 분석컬럼을 통과시켜 디메틸암페타민, 디메틸암페타민엔옥사이드, 메스암페타민, 암페타민의 총 4 종의 분석물질을 분석하는 방법이다.
Sato et al. , 2002
액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 2.8% 암모니아수 30 μL를 첨가한 소변 시료 700 μL를 일정양의 증류수로 희석한 다음 막필터(membrane filer)를 이용하여 정제한 다음 시료 일정량(100 μL)을 아세트니트릴/20 mM 암모늄 아세테이트 혼합용액(30:70, v/v)을 이동상으로 하여 분석컬럼을 통과시켜 디메틸암페타민, 디메틸암페타민엔옥사이드, 메스암페타민, 암페타민의 총 4 종의 분석물질을 분석하는 방법이다.
Cheng et al ., 2007
액체크로마토그래피-질량분석기를 이용하는 방법으로 0.5 mL 포화 탄산수소나트륨 용액을 첨가한 1.6 mL 소변 시료를 추출 컬럼으로 C18 카트리지를 이용하여 고체상추출법을 수행한 다음 수득한 유기용매층을 원심분리한 후 시료를 아세트니트릴/0.01 M 암모늄 포메이트 혼합용액(23:77, v/v)을 이동상으로 하여 분석컬럼을 통과시켜 디메틸암페타민, 디메틸암페타민엔옥사이드, 메스암페타민, 암페타민의 총 4 종의 분석물질을 분석하는 방법이다.
Figure 112009007567738-pat00010
실험 결과 본 발명의 분석방법이 디메틸암페타민과 암페타민 유도체 분석에 효과적임을 나타내고 있다. 이는 시료의 pH 조절 단계, 고체상 추출법을 수행하는 단계, 마지막 과정으로 액체크로마토그래피-질량분석기를 이용한 기기분석 단계를 포함하는 상기 검출 방법을 이용할 경우 높은 분석 감도의 확보, 정확성, 재현성, 분석의 신속성 및 간편성의 장점이 있다.
본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
도 1은 시료의 pH 8~12 범위에서 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체인 7 종의 화합물, AP, MA, MDA, MDMA, MDEA, DMA, DMANO 대한 회수율 비교 결과를 나타낸 꺾은 선형 그래프이다.
도 2는 액체크로마토그래피에 이동상 A(5 mM 암모늄 포메이트) 및 이동상 B(아세토니트릴)의 시간에 따른 농도구배조건을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체인 7 종의 화합물에 대해 액체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 4는 본 발명에 따른 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 중 AP, MA, MDA, MDMA에 대한 a) 바탕소변, b) 분석물질이 첨가된 소변, c) 실제 디메틸암페타민 복용자의 소변을 액체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.
도 5는 본 발명에 따른 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체 중 MDEA, DMA, DMANO에 대한 a) 바탕소변, b) 분석물질이 첨가된 소변, c) 실제 디메틸암페타민 복용자의 소변을 액체크로마토그래피-질량분석기로 분석한 결과를 나타낸 크로마토그램이다.

Claims (8)

  1. 시료의 pH를 8~10으로 조절하는 제 1 단계;
    상기 제 1 단계에서 얻은 시료를 고체상 추출법을 수행하는 제 2 단계; 및
    상기 제 2 단계에서 얻은 시료를 포름산을 이용하여 pH 3~5로 조절한 암모늄 포메이트 완충용액 및 유기 용매를 이동상으로 하며, 상기 완충용액 및 유기 용매의 혼합비가 95:5~20:80이 되도록 시간에 따라 농도구배를 주면서 액체 크로마토그래피 분석컬럼을 통과시켜 분리하는 제 3 단계를 포함하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  2. 제 1항에 있어서, 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분은 메스암페타민(MA, methamphetamine), 엠디엠에이(MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine), 엠디이에이(MDEA, 3,4-methylenedioxyethylamphetamine), 디메틸암페타민(DMA, dimethylamphetamine) 뿐만 아니라 체내 대사과정에서의 생성되는 대사체인 암페타민(AP, amphetamine), 디메틸암페타민엔옥사이드(DMANO, dimethylamphetamine-N-oxide), 엠디에이(MDA, 3,4-methylenedioxyamphetamine)인 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 단계에서 시료의 pH를 9로 조절하는 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  4. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 제 1 단계의 시료의 pH는 탄산염 완충용액을 사용하여 조정하는 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 제 2 단계의 고체상 추출법에 사용되는 고체상 추출 컬럼은 친지용성과 친수용성을 함께 가지고 있는 컬럼충진제를 사용하는 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제 3 단계는 액체 크로마토그래피 분석 컬럼을 통과시켜 분리된 시료를 질량분석기(Mass spectrometry)로 분석하는 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 질량분석기로 분석시 분석물질에 대해 동위원소가 치환된 내부표준물질을 이용하여 정량하는 것을 특징으로 하는 디메틸암페타민 및 암페타민 유도체의 다성분 동시 분석방법.
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160065535A (ko) * 2014-12-01 2016-06-09 주식회사 엘지화학 이온성 계면활성제 분리방법 및 분리 시스템
KR101994206B1 (ko) * 2019-03-29 2019-07-01 대한민국 암페타민 검출 방법
CN113252429A (zh) * 2021-05-11 2021-08-13 吴志洪 一种污水毒品自动萃取装置及工艺方法
CN114965840A (zh) * 2021-02-24 2022-08-30 公安部物证鉴定中心 一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100848132B1 (ko) 2008-05-27 2008-07-25 대한민국 기체크로마토그래피를 이용한 암페타민 및 대마 유도체의다성분 동시 분석방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100848132B1 (ko) 2008-05-27 2008-07-25 대한민국 기체크로마토그래피를 이용한 암페타민 및 대마 유도체의다성분 동시 분석방법

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160065535A (ko) * 2014-12-01 2016-06-09 주식회사 엘지화학 이온성 계면활성제 분리방법 및 분리 시스템
KR101725948B1 (ko) 2014-12-01 2017-04-11 주식회사 엘지화학 이온성 계면활성제 분리방법 및 분리 시스템
KR101994206B1 (ko) * 2019-03-29 2019-07-01 대한민국 암페타민 검출 방법
CN114965840A (zh) * 2021-02-24 2022-08-30 公安部物证鉴定中心 一种生物体液中草甘膦、草铵膦及代谢物的检测方法
CN113252429A (zh) * 2021-05-11 2021-08-13 吴志洪 一种污水毒品自动萃取装置及工艺方法

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