CN109900820A - 一种hplcms-ms联用检测人血浆中喹硫平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物分析领域，具体涉及一种HPLCMS‑MS联用检测人血浆中喹硫平的方法。本发明的检测方法包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱‑质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中：流动相A为乙腈‑水，流动相B为乙酸铵‑水；(3)人血浆中喹硫平浓度的测定。本发明以氘代富马酸喹硫平为内标物，采用InertSustain C18柱进行梯度洗脱，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中富马酸喹硫平浓度的重现性、准确度均较好。本发明方法可用于评价喹硫平各剂型的生物等效性。

Description

一种HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及液质联用定量检测血浆中喹硫平浓度的方法。

背景技术

富马酸喹硫平，主要是一种新的非经典抗精神疾病的药物，临床研究表明该药是一种安全有效的精神病药，与多种神经递质受体有相互作用。该药主要作用于5-羟色胺2受体和多巴胺的D1、D2、D4受体，不但对精神分裂症的阳性症状有效，对阴性症状也同样有效。富马酸喹硫平起效时间快、不良反应轻，目前已成为精神分裂症与双向情感障碍治疗的一线用药。目前，有关富马酸喹硫平生物等效性研究方法的报道较少，而在中国人群中的研究更是有限。

戴婕于2013年建立了液液萃取液质联用方法检测人血浆中的喹硫平，方法使用血浆 0.2mL，血浆用量较多不适用于大批量的样品检测，且采用非氘代内标盐酸奥氮平为内标，无法控制化合物与内标的基质效应相同，可能使样品检测结果与真实值有差距，该法所用的液液萃取法较为繁琐，操作难度大耗时长。

张文静于2014年建立了蛋白沉淀液相色谱方法检测大鼠血浆中喹硫平含量，因仪器精密度不高，且样本仅为6只大鼠血浆，其方法验证数据不足以说明分析方法能可靠用于人血浆中喹硫平浓度检测。

康伟于2018年建立了蛋白沉淀液质联用方法用于检测血中的富马酸喹硫平，该方法虽然检测限及定量限低，但血浆用量0.2mL较多且定量范围窄，回收率低，不适用于大批量的样品处理。

鉴于上述的缺陷，为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及血浆药物浓度检测的方法，用于富马酸喹硫平的测定。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小，提取回收率较高的检测人血浆中富马酸喹硫平浓度的方法。

本发明的技术方案如下：

一种HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为乙腈-水，流动相B为乙酸铵水溶液；(3)人血浆中喹硫平浓度的测定。

在一种优选方案中，梯度洗脱过程如下：在0-0.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64；在0.8-1.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由36:64匀速渐变至80:20；在1.3-2.9分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；在2.9-2.91分钟内，流动相A 和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至100:0；在2.91-3.5分钟内，流动相A和流动相 B的体积比为100:0；在3.5-3.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由100:0匀速渐变至36:64；在3.6-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64。具体的梯度洗脱过程如下：

本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中喹硫平时，在一种优选方案中，流动相A中乙腈-水的体积比为95:5。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。在流动相A中，以乙腈-水的总体积为100％为基准，含有体积比为0.10～0.20％乙酸。在不影响本发明效果的情况下，在进一步优选方案中，在流动相A中，以乙腈-水的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸。

进一步的，流动相B为2mM乙酸铵水溶液。为了改善色谱分离选择性，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.10～0.20％乙酸。在不影响本发明效果的情况下，在进一步优选方案中，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸。

本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中喹硫平时，采用GL ScienceInertSustain C18作为色谱柱。进一步优选采用长度为150mm，直径为3.0mm，填料粒径为3.0μm的 Inertsil C8-3作为色谱柱。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用上述提及的流动相进行梯度洗脱，以InertSustain C18作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中喹硫平时，采用富马酸喹硫平-d8作为内标，以氘代富马酸喹硫平做内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中富马酸喹硫平浓度的重现性、准确度均较好。

在步骤(1)中，本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，采用乙腈作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血浆样品，可以避免繁琐耗时的液液萃取过程，同时获得令人惊讶的高回收率。采用本发明的检测方法，富马酸喹硫平总基质效应因子为 0.98～0.99，偏差小于0.0158％，富马酸喹硫平提取回收率为90.38％。

本发明的检测方法还包括配制内标溶液：称取富马酸喹硫平-d8对照品，用纯甲醇溶解得到浓度为1.00mg/ml富马酸喹硫平-d8储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为100ng/mL的富马酸喹硫平-d8工作液。

在一种优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；其中，稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为50:50。

在一种更优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取60μL人血浆样品，加入60μL内标工作液和480μL乙腈，涡旋及离心后取上清液，再与400μL稀释剂混合后，即得待测样品。

本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，其中涡旋及离心的条件为：涡旋 10min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。

本发明在色谱检测时，将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2μL，进样器温度5℃。

本发明的检测方法，步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：本发明详细的色谱条件为：采用GL Science InertSustain C18作为色谱柱，按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱，柱温30～45℃，优选40℃；流速0.1～1.0mL/min，优选0.5mL/min。

本发明的质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压1500 V，离子源温度550℃；喹硫平，[M+H]⁺，m/z 384.4→253.2，DP值61V，CE值31V；富马酸喹硫平-d8，[M+H]⁺，m/z 392.4→258.1，DP值69V，CE值33V。

本发明的检测方法，步骤(3)人血浆中喹硫平浓度的测定步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品前处理方法制备，按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测，记录喹硫平对应的峰面积，将喹硫平和内标的峰面积比值以权重系数w＝1/x²进行线性回归，方程表达式， y＝ax+b，计算得到所述待测血浆中喹硫平的浓度。

本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括：用DAS3.2.8计算药动学参数。用非房室模型(Non-compartmentalanalysis， NCA)分析，计算各受试者的药代动力学参数，包括：C_max、T_max、t_1/2、AUC_0-t，同时计算各参数的均数和标准差。

采用本发明的技术方案，优势如下:

(1)本发明以氘代富马酸喹硫平做内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中富马酸喹硫平浓度的重现性、准确度均较好。

(2)本方法使用样本量仅为60μL，所用样本量较少，适用于大批量血浆样品检测。本发明的检测方法线性范围为1.00～1000ng/mL，该线性范围较宽，适于分析不同规格给药后的血浆样品，应用范围较广。

(3)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证，能可靠用于评价富马酸喹硫平各剂型在人体内的生物等效性。

附图说明

图1是喹硫平子离子扫描图；

图2是喹硫平-d8子离子扫描图；

图3是LC-MS/MS法测定血浆中喹硫平的特异性色谱图；

(A～F)6个不同来源空白血浆色谱图；

其中，A～F各图左边色谱图为喹硫平，右边色谱图为喹硫平-d8；

(G)混合空白血浆色谱图；

其中，左边色谱图为喹硫平，右边色谱图为喹硫平-d8；

(H)定量下限样品色谱图；

其中，左边色谱图为喹硫平，右边色谱图为喹硫平-d8；

图4是12名受试者给予受试/参比制剂富马酸喹硫平片后血浆中喹硫平的平均血药浓度-时间曲线。

具体实施方式

通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

材料与方法

1.仪器与试剂

高相液相色谱(Shimadzu LC-20系列)；质谱(API 3000，Applied Biosystems/Sciex)；纯水仪(MilliDirectQ，Millipore)；微量天平(XP6，METTLER TOLEDO)；离心机(HeraeusMuitifuge X1R，ThermoFisher)；振荡器(LPD2500，LE PARD)。

乙腈(Merck，HPLC级别)，水(超纯水，实验室自制)，甲酸(Aladdin，HPLC级别)，异丙醇(安徽时联特种溶剂股份有限公司，HPLC级别)，醋酸铵(Aladdin，HPLC 级别)甲醇(Merck，HPLC级别)。空白的肝素钠抗凝血浆来源于健康受试者。富马酸喹硫平(中国食品药品检定研究院，纯度99.8％)，富马酸喹硫平-d8(TLC PHARMACEUTICAL STANDARDS，纯度98.9％)

2.液质条件

液相条件：色谱柱：GL Science Inc,InertSustain C18,3.0×100mm,3μm；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为乙腈:水(95:5，v/v)(以乙腈-水的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸)；流动相B为2mM乙酸铵水溶液(以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64；在0.8-1.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由 36:64匀速渐变至80:20；在1.3-2.9分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；在 2.9-2.91分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至100:0；在2.91-3.5 分钟内，流动相A和流动相B的体积比为100:0；在3.5-3.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由100:0匀速渐变至36:64；在3.6-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64；流速0.5mL/min；流速：0.5mL/min；进样量：2μL；洗针方式：Berore and after aspiration自动进样器洗针液：甲醇:乙腈:异丙醇:水:甲酸(25:25:25:25:1)(强洗)；乙腈: 水(50:50)(弱洗)；清洗体积：各500μL。

质谱条件

离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：喹硫平，[M+H]⁺，m/z 384.4→253.2，DP值61 V，CE值31V；内标：富马酸喹硫平-d8，[M+H]⁺，m/z 392.4→258.1，DP值69V，CE 值33V；质谱参数：IonSpray Voltage：1500V；CUR：8psi；CAD：8psi；TEM：550℃。具体富马酸喹硫平与富马酸喹硫平-d8离子扫描图如图1和图2所示。

3.标准品溶液的配制

富马酸喹硫平工作溶液的配制：精密称取两份富马酸喹硫平对照品适量，经质量校正系数校正后，用纯甲醇溶解后，得到两份终浓度均为1.00mg/mL的喹硫平储备液，储备液保存于-20℃冰箱。经储备液检查合格后，精密量取一份喹硫平储备液用50％甲醇-水稀释，配制一系列浓度为20,000，18,000，10,000，5,000，1,000，200，40.0，20.0ng/mL的喹硫平标准曲线样品工作溶液，精密量取另一份喹硫平储备液用50％甲醇-水稀释。配制浓度为16,000，800，60.0，20.0ng/mL的QC工作溶液。

富马酸喹硫平-d8工作溶液的配制：精密称取富马酸喹硫平-d8对照品适量，经质量校正系数校正后，用纯甲醇溶解，得到最终浓度为1.00mg/mL的富马酸喹硫平-d8储备液，储备液保存于-20℃冰箱。精密量取一定量的富马酸喹硫平-d8用50％甲醇-水稀释，配制成浓度为100ng/mL的内标工作液。

4.标准曲线样品及质控样品的配制

对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，其配制过程举例如下：在190μL的空白血浆中加入10.0μL相应的工作溶液，混合均匀。配制体积可据实际情况适当调整。配成含富马酸喹硫平浓度分别为1.00，2.00，10.0，50.0，250，500，900，1000ng/mL的标准曲线样品和浓度分别为1.00ng/mL(LLOQ QC)、3.00ng/mL(LQC)、40.0ng/mL (MQC)、800ng/mL(HQC)的质控样品。

5.样品前处理

向1mL 96孔板中加入60μL的样品(待测生物样品，标准曲线样品、质控样品)；对于双空白样品和空白样品，加入60μL的空白基质。在双空白样品中加入60μL溶剂50％甲醇-水，除双空白样品在外，在所有孔中加入60μL的内标工作液，后加入480μL沉淀剂乙腈。将96孔板以2000rpm/min涡旋震荡10min。将96孔板在4℃条件下以4000 rpm/min速度离心10min。取100μL上清液加入到干净的96孔板中，加入400μL稀释剂 50％乙腈-水混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。

6.方法学考察内容

根据2015年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。

7.生物等效性研究

选取12名健康受试者，受试者服药前及服药后0.25,0.5,0.75,1,1.33,1.67,2,2.5,3, 3.5,4,6,8,12,24,36,48h静脉采血4mL置于5mL肝素钠抗凝负压采血管中。全血采集后将管身反复翻转4-8次，放置于冰盒中。然后将其运至血浆分离处离心且在实验室间转运过程中用生物冷藏箱冷冻，并进行温度监控。采血完成后于4℃、4000rpm离心5min，分别取两个1.5mL的离心管分装上清液。其中量取约1ml至1.5mL的离心管用于检测；另将剩余的血浆至1.5mL的离心管用于留样。分装后转入低温冰箱中(-60℃)冷冻保存。

结果与讨论

1.专属性

本试验所采用的色谱条件下，喹硫平的保留时间为2.63min左右(3-(H))；内标(富马酸喹硫平-d8)的保留时间为2.62min左右(3-(G))；将富马酸喹硫平标准溶液加入空白血浆，除不加内标外，按样品预处理操作，获得含喹硫平的定量下限样品色谱图3-(H)；分别取6种不同来源的空白血浆各60μL，除不加内标外，按样品预处理操作，获得空白血浆样品色谱图，如图3-(A)～图3-(F)。

2.准确度、精密度试验

配制含富马酸喹硫平浓度分别为1.00、3.00、40、800ng/mL的质控样品，每个浓度各配制6份样品，并配制两条标准曲线(由两套标准曲线样品回归得到)，计算喹硫平的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，记作f，以f代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度，计算批内和批间精密度，结果见表1。结果表明：除最低定量限(LLOQ)外，富马酸喹硫平的批内和批间质控样品的精密度RSD均小于15％，批内准确度RE有三分之二以上不超过±15％，且每个浓度水平二分之一以上数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15％。最低定量限富马酸喹硫平样品的批内和批间质控样品的精密度RSD均小于20％，批内准确度RE有三分之二以上不超过±20％，且每个浓度水平二分之一以上数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20％，综上，精密度及准确度均符合要求。

表1批内、批间样品检测的精密度和准确度

3.基质效应考察

基质样品配制：取6份不同来源个体的空白血浆，每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白基质提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。

溶液样品的配制：以纯水代替空白血浆进行前处理步骤，后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入100μL空白基质提取液及100μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品处理后进样浓度一致，且每一浓度3个重复样本。

结果显示，喹硫平基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.98～0.99，偏差小于0.0158，血浆基质不影响富马酸喹硫平准确定量。可以表示，血浆基质不影响富马酸喹硫平的准确定量。基质效应数据结果见表2。

表2基质效应(计算方式：基质效应因子：对照溶液峰面积比/样品峰面积比)

5.提取回收率考察

基质样品配制：取6份不同来源个体的空白血浆，每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白血浆提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。

质控样品配制：取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。

通过质控样品与基质样品待测物峰面积比较评价待测物的回收率；通过质控样品与基质样品内标物峰面积响应的比较评价内标物的回收率。

回收率的接受标准为：每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15％之内。喹硫平提取回收率(以峰面积比值计算)为90.38％，其中低、中、高三个浓度提取回收率为93.58％，85.86％，91.69％。结果见表3。

表3待测物提取回收率

6.稳定性考察

进样器稳定性：考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后，放置于自动进样器(8℃)143.5h后，再次进样分析，记录色谱图，结果见表4，血浆样品处理后的进样溶液在进样器中放置143.5h稳定性良好，符合生物样品分析的要求。

室温稳定性：将配置好的低、高两个浓度水平的质控样品，含喹硫平浓度分别为3.00， 800ng/mL，每个浓度水平的样品混合均匀后，于室温放置24h后，进行HPLC-MS/MS 分析，记录色谱图。结果如表5所示。

冻融稳定性：新鲜配制含喹硫平浓度分别为3.00ng/mL，800ng/mL的样品，分别放入-20℃及-80℃冰箱中进行4次冻融循环。结果见表6及表7。

长期稳定性：新鲜配制含喹硫平浓度分别为3.00ng/mL，800ng/mL的样品，分别放入-20℃及-80℃冰箱中冻存30天后检测。结果见表8及表9。

稳定性试验接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％。

表4制备后样品的稳定性

表5室温稳定性

表6样品-20℃条件下，反复冻融4次待测物稳定性

表7样品-80℃条件下，反复冻融4次待测物稳定性

表8样品-20℃条件下，放置30天待测物长期稳定性

表9样品-80℃条件下，放置30天待测物长期稳定性

7.人体生物等效性研究

12名健康受试者按试验方案分别给予富马酸喹硫平片(受试制剂A，含富马酸喹硫平 25.0mg)和富马酸喹硫平片(参比制剂R，含富马酸喹硫平25.0mg)后，用HPLC-MS/MS 法测定血浆中富马酸喹硫平的浓度，如图4所示。12名健康受试者按试验方案给予受试富马酸喹硫平片和参比富马酸喹硫平片后，计算的富马酸喹硫平的达峰浓度C_max，达峰时间T_max，AUC_0-t。受试制剂和参比制剂中富马酸喹硫平的AUC_0-t、AUC_0-∞及C_max经对数转换后进行方差分析，结果表明：C_max、AUC_0-t、AUC_0-∞比值的90％置信区间在80％～125％范围内。T_max经非参检验(配对Wilcoxon法)，不同制剂间无显著性差异(P＞0.05)。综上所述，该结果符合《以药动学参数为终点评价指标的化学药物仿制药人体生物等效性研究技术指导原则》中的生物等效性评价要求，认定两制剂具有人体生物等效性。

本发明方法建立了血浆中喹硫平的HPLC-MS/MS测定方法，专属性良好，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，富马酸喹硫平标准曲线线性范围为1.00ng/mL～1000ng/mL，线性关系良好：高浓度(800ng/mL)、中浓度(40.0ng/mL)、低浓度(3.00ng/mL)、定量下限(1.00ng/mL)四个浓度水平的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于 15.0％；定量下限的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于20.0％。富马酸喹硫平总基质效应因子为0.98～0.99，偏差小于0.0158％，血浆基质不影响富马酸喹硫平准确定量。富马酸喹硫平提取回收率为90.38％。富马酸喹硫平血浆于室温放置24h后稳定性良好；在冷冻\解冻4个循环稳定性良好；血浆样品处理后在5℃自动进样器中放置143.5h 稳定性良好；喹硫平血浆样品在-20℃条件下放置30d稳定性良好；喹硫平血浆样品在-80℃条件下放置30d稳定性良好，符合生物样品分析要求。

综上所述，本发明方法所建立的HPLC-MS/MS法测定人体血浆中富马酸喹硫平浓度的方法符合2015版药典《生物样品定量分析方法验证指导原则》中的相关要求，可用于临床试验的血浆样品分析检测。

Claims (10)

1.一种HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈-水，所述流动相B为乙酸铵水溶液；(3)人血浆中喹硫平浓度的测定。

2.根据权利要求1所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，所述梯度洗脱过程如下：在0-0.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64；在0.8-1.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由36:64匀速渐变至80:20；在1.3-2.9分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；在2.9-2.91分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至100:0；在2.91-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为100:0；在3.5-3.6分钟内，流动相A和流动相B的体积比由100:0匀速渐变至36:64；在3.6-5.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为36:64。

3.根据权利要求1或2所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，所述流动相A中乙腈-水的体积比为95:5；所述流动相B为2mM乙酸铵水溶液；优选，在流动相A中，以乙腈-水的总体积为100％为基准，含有体积比为0.10～0.20％乙酸；更优选，在流动相A中，以乙腈-水的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸；优选，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.10～0.20％乙酸；更优选，在流动相B中，以乙酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.15％乙酸。

4.根据权利要求1或2所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，色谱条件包括：采用InertSustain C18作为色谱柱；优选该色谱柱的长度为150mm，直径为3.0mm，填料粒径为3.0μm；柱温30～45℃，优选40℃；流速0.1～1.0mL/min，优选0.5mL/min；质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压1500V，离子源温度550℃；喹硫平，[M+H]⁺，m/z 384.4→253.2，DP值61V，CE值31V；富马酸喹硫平-d8，[M+H]⁺，m/z 392.4→258.1，DP值69V，CE值33V。

5.根据权利要求1所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品通过蛋白沉淀法进行前处理；采用富马酸喹硫平-d8作为内标，采用乙腈作为沉淀剂。

6.根据权利要求1所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，包括内标溶液的配制：称取富马酸喹硫平-d8对照品，用纯甲醇溶解得到浓度为1.00mg/ml富马酸喹硫平-d8储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为100ng/mL的富马酸喹硫平-d8工作液。

7.根据权利要求5所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；所述稀释剂为乙腈和水的混合溶液，乙腈和水的体积比为50:50。

8.根据权利要求6所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取60μL人血浆样品，加入60μL内标工作液和480μL乙腈，涡旋及离心后取上清液，再与400μL稀释剂混合后，即得待测样品。

9.根据权利要求7或8所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，所述涡旋及离心的条件为：涡旋10min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min；将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2μL，进样器温度5℃。

10.根据权利要求1所述的HPLCMS-MS联用检测人血浆中喹硫平的方法，其特征在于，该方法可用于临床药代动力学样本监测。