CN113720930A - 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中奥美拉唑的方法 - Google Patents

一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中奥美拉唑的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种HPLC‑MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱‑质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中：流动相A为甲醇‑乙腈混合溶液，在混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为3～5:7～5；流动相B为2～20mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中奥美拉唑浓度的测定。本发明以氘代奥美拉唑作为内标物，采用Welch Ultimate XB‑C18进行梯度洗脱，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中奥美拉唑浓度的重现性、准确度均较好。本发明方法可用于评价奥美拉唑各剂型的生物等效性。

Description

一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法。
背景技术
奥美拉唑属于苯并咪唑类抗酸分泌化合物，能通过特异性抑制胃壁细胞表面的H+/K+-ATP酶系统而抑制胃酸分泌。奥美拉唑呈弱碱性，遇酸后容易转化成次磺胺化合物，次磺胺化合物肠道生物利用度很低。首次给药生物利用度为35％，连续用药后生物利用度可提高到60％，其原因可能是由于本品使胃酸抑制而使其在胃内分解减少。市售的复方奥美拉唑，能够特异性地作用于胃壁细胞顶端膜构成的分泌性微管和胞浆内的管状泡上，即胃壁细胞质子泵H+-K+ATP酶所在部位，抑制壁细胞泌酸的最后步骤，使壁细胞的H+不能转运到胃腔中去，以致胃液中胃酸量大为减少，对各种刺激因素引起的胃酸分泌均有很强的抑制作用。
目前，国内文献有报道采用液质联用测定奥美拉唑含量的方法。例如，文献液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中奥美拉唑及其代谢产物奥美唑砜的质量浓度(陈晨，沈阳药科大学，2020)，中公开了血浆中奥美拉唑的检测方法，但是在洗脱的过程中未公开使用洗针液，且检测方法有残留，可能使样品检测结果与真实值有差距。文献液相色谱-串联质谱法测定人血浆中奥美拉唑的血药浓度及其药动学(任秀华，华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部)中也公开了血浆中奥美拉唑的检测方法，但是在检测方法中使用非氘代内标兰索拉唑作内标，无法控制分析物与内标的基质效应相同，可能使样品检测结果与真实值有差距，血浆用量为200μL，血浆用量较多不适用于大批量分析样品。
中国专利CN 111337615 A公开了血浆中奥美拉唑的检测方法，但是在检测方法中采用等度洗脱，奥美拉唑的保留时间在6.63min，运行时间为10min，不适用于大批量样品分析。
为满足临床大批量样品分析评价药物生物等效性的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法以及用于检测人血浆中奥美拉唑浓度的方法。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率较高的检测人血浆中奥美拉唑浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为甲醇-乙腈混合溶液，在混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为3～5:7～5；流动相B为2～20mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中奥美拉唑浓度的测定；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至45:55；在3.2-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55。具体的梯度洗脱过程如表1：
表1：奥美拉唑液相色谱梯度
Figure BDA0003179687660000021
本发明采用HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑时，在一种优选方案中，在梯度洗脱过程中，弱洗针液为甲醇-乙腈-水混合溶液，为了更好的实施本发明，在弱洗针液中甲醇、乙腈和水的体积比为1～3:4～2:5，在不影响本发明效果的情况下，在进一步优选方案中，在弱洗针液中甲醇、乙腈和水的体积比为2:3:5。在实验过程中发现，采用常用的强洗针液，例如，甲醇、乙腈、甲醇-乙腈、甲醇-乙醇、甲醇-异丙醇以及甲醇-乙腈-异丙醇作为强洗针液，除了甲醇-乙腈-异丙醇之外，其他溶剂作为强洗针液均出现高浓度样品后的残留样品中分析物的峰面积会超过定量下限样品分析物峰面积的20％，影响高浓度样品之后的样品的准确测定。对于本发明而言，强洗针液为甲醇-乙腈-异丙醇混合溶液，可有效去除残留，使得检测结果准确和可靠，在一种优选方案中，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1～2:2～3:1，在不影响本发明效果的情况下，在进一步优选方案中，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1:2:1。
本发明采用HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑时，在一种优选方案中，流动相A中，甲醇-乙腈的体积比为4:6。进一步地，流动相B为10mM甲酸铵水溶液。为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸，即流动相B为0.1％甲酸-10mM甲酸铵水溶液。
本发明采用HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑时，采用Welch Ultimate XB-C18作为色谱柱，进一步地，该色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为3μm，即Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用上述提及的流动相进行梯度洗脱，以Welch Ultimate XB-C18作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且重现性好、灵敏度高、分析速度快基质效应影响小。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明采用HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑时，采用奥美拉唑-d3作为内标，以氘代奥美拉唑做内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中奥美拉唑浓度的重现性、准确度均较好。
在步骤(1)中，本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，采用乙腈作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血浆样品，可以避免繁琐耗时的液液萃取过程，同时获得令人惊讶的高回收率。本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，以UltimateXB-C18作为色谱柱，在其他条件的配合下，奥美拉唑总体提取回收率为99.99％。
在一种方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；其中，内标工作液中内标为奥美拉唑-d3；沉淀剂为乙腈。所述稀释剂为甲醇和水的混合溶液，优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为40～60:6～40；更优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
本发明的检测方法还包括配制内标工作溶液：称取奥美拉唑-d3对照品，用甲醇溶解得到浓度为1.00mg/ml奥美拉唑-d3储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为200ng/mL奥美拉唑-d3内标工作液。
在一种更优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取20μL人血浆样品，加入20μL内标工作液和160μL乙腈，涡旋及离心后取50μL上清液，再与200μL稀释剂混合后，即得待测样品；所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，其中涡旋及离心的条件为：涡旋10min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。
本发明在色谱检测时，将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2μL，进样器温度5℃。
本发明的检测方法，步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：本发明详细的色谱条件为：采用Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)作为色谱柱，按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱，柱温为30～45℃，优选为40℃；流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.4mL/min。
本发明的质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压5500V，离子源温度550℃；奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z 349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。
本发明的检测方法，步骤(3)人血浆中奥美拉唑浓度的测定步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品前处理方法制备，按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测，记录奥美拉唑对应的峰面积，将奥美拉唑和内标的峰面积比值以权重系数w＝1/x2进行线性回归，方程表达式，y＝ax+b，计算得到所述待测血浆中奥美拉唑的浓度。
本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括：用WinNonlin 8.0计算药动学参数，包括：Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t，同时计算各参数的均数和标准差。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明以氘代奥美拉唑作为内标物，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中奥美拉唑浓度的重现性、准确度均较好。
(2)本发明的检测方法在梯度洗脱过程中采用甲醇-乙腈-异丙醇混合溶液作为请洗针液(例如，体积比为1:2:1)，可有效去除残留，使得检测结果准确和可靠。
(3)本方法使用样本量仅为20μL，所用样本量较少，适用于大批量血浆样品检测。本发明的检测方法线性范围为3.00～3000ng/mL，该线性范围较宽，定量限低，适于分析不同规格给药后的血浆样品，应用范围较广。
(4)本发明的检测方法选择特定的流动相，在梯度洗脱的过程中，优化洗脱的时间和流动相的比例，具有重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小以及回收率高等优点，并进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证，能可靠用于评价奥美拉唑各剂型在人体内的生物等效性。
附图说明
图1是奥美拉唑子离子扫描图；
图2是奥美拉唑-d3子离子扫描图；
图3是LC-MS/MS法测定血浆中奥美拉唑的特异性色谱图；
(3-1～3-6)6批不同个体空白血浆色谱图；
其中，图3-1～图3-6各图中，左侧色谱图为奥美拉唑，右侧色谱图为奥美拉唑-d3；
图4是混合空白血浆色谱图；
其中，左侧色谱图为奥美拉唑，右侧色谱图为奥美拉唑-d3；
图5是定量下限样品色谱图；
其中，左侧色谱图为奥美拉唑，右侧色谱图为奥美拉唑-d3；
图6是对比例2中奥美拉唑的色谱图；
其中，左侧色谱图为定量上限样品奥美拉唑的色谱图，右侧色谱图为残留样品奥美拉唑的色谱图；
图7是对比例3中奥美拉唑的色谱图；
其中，左侧色谱图为强洗针液为乙腈的残留样品中奥美拉唑的色谱图，右侧色谱图为强洗针液为甲醇:乙腈:异丙醇(1:2:1，v/v/v)的残留样品中奥美拉唑的色谱图。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
材料与方法
1.仪器与试剂
高相液相色谱(Shimadzu LC-30AD系列)；质谱(API 4000，Applied Biosystems/Sciex)；纯水仪(MilliDirectQ，Millipore)；微量天平(XP6，METTLER TOLEDO)；离心机(HeraeusMuitifuge X1R，ThermoFisher)；振荡器(LPD2500，LE PARD)。
甲醇(Merck，HPLC级别)，乙腈(Merck，HPLC级别)，水(超纯水，实验室自制)，甲酸(Aladdin，HPLC级别)，甲酸铵(Aladdin，HPLC级别)，异丙醇(国药集团化学试剂有限公司，HPLC级别)。空白的血浆来源于健康受试者。奥美拉唑(中国食品药品检定研究院，批号：100367-201706)，奥美拉唑-d3(TLC，批号：1194-005A3)
2.液质条件
液相条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为甲醇-乙腈(4:6，v/v)；流动相B为0.1％甲酸-10mM甲酸铵水溶液(以10mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至45:55；在3.2-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55。流速0.4mL/min；洗针方式：Rinse Port Only；弱洗针液：甲醇:乙腈:水(2:3:5，v/v/v)；清洗体积：500μL；强洗针液：甲醇:乙腈:异丙醇(1:2:1,v/v/v)。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z 349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。质谱参数：IonSpray Voltage：5500V；TEM：550℃。具体奥美拉唑与奥美拉唑-d3的离子扫描图如图1和图2所示。
3.标准品溶液的配制
奥美拉唑工作溶液的配制：精密称取两份奥美拉唑对照品，经质量校正系数校正后，用甲醇溶解，得到两份浓度均为1.00mg/mL的奥美拉唑储备液，储备液保存于-20℃冰箱中。储备液经检查合格后，精密量取一份奥美拉唑储备液用甲醇:水(50:50，v/v)稀释，配制一系列浓度为60,000，54,000，30,000，12,000，3,000，600，120，60.0ng/mL的奥美拉唑标准曲线样品工作溶液，精密量取另一份奥美拉唑储备液用甲醇:水(50:50，v/v)稀释，配制浓度分别为48,000，2,400，180ng/mL的QC工作溶液。
奥美拉唑-d3工作溶液的配制：精密称取奥美拉唑-d3对照品，经质量校正系数校正后，用甲醇溶解，得到浓度为1.00mg/mL的奥美拉唑-d3储备液，储备液保存于-20℃冰箱中。精密量取一定量的奥美拉唑-d3储备液用甲醇:水(50:50，v/v)稀释，配制成浓度为200ng/mL的内标工作液。
4.标准曲线样品及质控样品的配制
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，其配制过程举例如下：在190μL的空白血浆中加入10μL相应的工作溶液，混合均匀，配制体积可据实际情况适当调整，依次配制含奥美拉唑浓度分别为3.00，6.00，30.0，150，600，1500，2700，3000ng/mL的标准曲线样品和浓度分别为3.00ng/mL(LLOQ QC)、9.0ng/mL(LQC)、120ng/mL(MQC)、2400ng/mL(HQC)的质控样品。
5.样品前处理
向1.0mL 96孔板中加入20μL的样品(待测生物样品，标准曲线样品、质控样品)；对于双空白样品和空白样品，加入20μL的空白基质。在双空白样品中加入50μL溶剂甲醇:水(1:1，v/v)，除双空白样品在外，在所有孔中加入20μL的内标工作液，再加入160μL沉淀剂乙腈，然后将96孔板以1600rpm/min涡旋震荡10min，继续将96孔板在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min。取50μL上清液加入至干净的96孔板中，再加入200μL稀释剂甲醇:水(1:1，v/v)混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。
6.方法学考察内容
根据2015年版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
结果与讨论
1.专属性
本试验所采用的色谱条件下，奥美拉唑的保留时间为1.82min左右，如图5；内标(奥美拉唑-d3)的保留时间为1.81min左右，如图4；分别取6种不同来源的空白血浆各20μL，除不加内标外，按样品预处理操作，获得空白血浆样品色谱图，如图3-1～图3-6；定量下限样品色谱图见图5；结果说明，血浆中内源性物质不影响奥美拉唑的检测，同时，内标也不影响奥美拉唑的检测。
2.准确度、精密度试验
配制含奥美拉唑浓度分别为3.00ng/mL、9.00ng/mL、120ng/mL、2400ng/mL的质控样品，每个浓度各配制6份样品，并配制两条标准曲线(由两套标准曲线样品回归得到)，计算奥美拉唑的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，记作f，以f代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度，计算批内精密度及准确度，结果见表2。结果表明：除最低定量限(LLOQ)外，奥美拉唑的批内质控样品的精密度RSD均小于15％，批内准确度RE至少有67％不超过±15％，且每个浓度水平至少50％数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15％。最低定量限奥美拉唑样品的批内质控样品的精密度RSD均小于20％，批内准确度RE至少有67％不超过±20％，且每个浓度水平至少有50％数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20％，综上，精密度及准确度均符合要求。
表2批内、批间样品检测的精密度和准确度
Figure BDA0003179687660000081
Figure BDA0003179687660000091
3.基质效应考察
基质样品配制：使用6批来自不同供体的空白血浆，每批空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白基质提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。
溶液样品的配制：以纯水代替空白血浆进行前处理步骤，后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入50μL空白基质提取液或50μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品前处理后进样浓度一致。且每一浓度3个重复样本。
结果显示，奥美拉唑基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为0.99～1.03，精密度小于1.7％，血浆基质不影响奥美拉唑准确定量。基质效应数据结果见表3。
表3基质效应
Figure BDA0003179687660000101
4.提取回收率考察
基质样品配制：使用6批不同供体的空白血浆混合而成的血浆，制备18个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白血浆提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，6个重复)。
质控样品配制：取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。
通过比较单个质控样品中分析物或内标响应值与提取后加入分析物、内标的双空白样品响应值均值，来评价回收率。
回收率的接受标准为：每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15.0％之内。奥美拉唑提取回收率(以峰面积比值计算)为99.99％，其中低、中、高三个浓度提取回收率分别为100.69％，99.75％，99.54％。结果见表4。
表4提取回收率
Figure BDA0003179687660000111
5.稳定性考察
处理后样品稳定性：考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后，放置于自动进样器(5℃)96h后，新鲜配制的标准曲线样品和已经分析过的样品，进样分析，记录色谱图，结果见表5，奥美拉唑血浆样品处理后的进样溶液在进样器中放置96h稳定性良好，符合生物样品分析的要求。
室温稳定性：将配制好的低、高浓度水平的质控样品，含奥美拉唑浓度分别为9.00ng/mL，2400ng/mL，每个浓度水平的样品混合均匀后，于室温放置23h后，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图，结果如表6所示，血浆样品在室温条件下放置23h稳定性良好。
冻融稳定性：新鲜配制含奥美拉唑浓度分别为9.00ng/mL，2400ng/mL的样品，分别放入-80℃冰箱中进行4次冻融循环。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％，结果见表7，样品在-80℃经过4次冻融循环后，稳定性良好。
长期稳定性：新鲜配制含奥美拉唑浓度分别为9.00ng/mL，2400ng/mL的样品，分别放入-80℃冰箱中冻存78天后检测。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％，结果见表8，样品在-80℃冻存78天，稳定性良好。
表5制备后样品稳定性
Figure BDA0003179687660000121
表6生物样品前处理过程中的稳定性(室温稳定性)
Figure BDA0003179687660000122
表7冻融稳定性
Figure BDA0003179687660000123
Figure BDA0003179687660000131
表8长期稳定性
Figure BDA0003179687660000132
本发明方法建立了血浆中奥美拉唑的HPLC-MS/MS测定方法，专属性良好，血浆中内源性物质不干扰样品的测定，奥美拉唑标准曲线线性范围为3.00～3000ng/mL，线性关系良好：高浓度(2400ng/mL)、中浓度(120ng/mL)、低浓度(9.00ng/mL)三个浓度水平的质控样品检测结果的批内和批间精密度均小于15.0％；定量下限的质控样品(3.00ng/mL)检测结果的批内和批间精密度均小于20.0％。奥美拉唑总基质效应因子为0.99～1.03，精密度小于1.7％，血浆基质不影响奥美拉唑准确定量。奥美拉唑提取回收率为99.99％。奥美拉唑血浆于室温放置23h后稳定性良好；在冷冻\解冻4个循环稳定性良好；血浆样品处理后在5℃自动进样器中放置96h稳定性良好；奥美拉唑血浆样品在-80℃条件下放置78d稳定性良好，符合生物样品分析要求。
综上所述，本发明方法所建立的HPLC-MS/MS法测定人体血浆中奥美拉唑浓度的方法符合2020版药典《生物样品定量分析方法验证指导原则》中的相关要求，可用于临床试验的血浆样品分析检测。
对比例1
液相条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为乙腈；流动相B为0.1％甲酸-10mM甲酸铵水溶液(以10mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至45:55；在3.2-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55。流速0.4mL/min；洗针方式：Rinse Port Only；弱洗针液：甲醇:乙腈:水(2:3:5，v/v/v)；清洗体积：500μL；强洗针液：甲醇:乙腈:异丙醇(1:2:1,v/v/v)。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z 349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。质谱参数：IonSpray Voltage：5500V；TEM：550℃。
结果发现：将流动相A调整为乙腈，色谱峰出现拖尾现象，峰形不对称，定量下限为6.00ng/mL，导致线性范围变窄。
对比例2
液相条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为甲醇-乙腈(4:6，v/v)；流动相B为0.1％甲酸-10mM甲酸铵水溶液(以10mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70；在0.5-0.7分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至80:20；在0.7-1.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；在1.8-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-2.9分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至30:70；在2.9-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为30:70。流速0.4mL/min；洗针方式：Rinse Port Only；弱洗针液：甲醇:乙腈:水(2:3:5，v/v/v)；清洗体积：500μL；强洗针液：甲醇:乙腈:异丙醇(1:2:1,v/v/v)。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z 349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。质谱参数：IonSpray Voltage：5500V；TEM：550℃。
结果发现：如图6所示，调整梯度洗脱过程，定量上限样品后的残留样品中分析物容易产生残留，影响高浓度样品后的样品测定的准确度，出现残留的可能原因是初始水相比例比较高，导致残留物累积，在出峰位置被洗脱出来。
对比例3
液相条件：色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(2.1×100mm，3μm)；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为甲醇-乙腈(4:6，v/v)；流动相B为0.1％甲酸-10mM甲酸铵水溶液(以10mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至45:55；在3.2-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55。流速0.4mL/min；洗针方式：Rinse PortOnly；弱洗针液：甲醇:乙腈:水(2:3:5，v/v/v)；清洗体积：500μL；强洗针液：乙腈。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z 349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。质谱参数：IonSpray Voltage：5500V；TEM：550℃。
结果发现：如图7所示，调整强洗针液，定量上限样品后的残留样品中分析物容易产生残留，影响高浓度样品后的样品测定的准确度。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为甲醇-乙腈混合溶液，在混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为3～5:7～5；所述流动相B为2～20mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中奥美拉唑浓度的测定；所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55；在0.5-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由45:55匀速渐变至95:5；在2.0-2.8分钟内，流动相A和流动相B的体积比为95:5；在2.8-3.2分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至45:55；在3.2-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为45:55。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，在梯度洗脱过程中，弱洗针液为甲醇-乙腈-水混合溶液，优选地，在弱洗针液中甲醇、乙腈和水的体积比为1～3:4～2:5，更优选地，在弱洗针液中甲醇、乙腈和水的体积比为2:3:5；强洗针液为甲醇-乙腈-异丙醇混合溶液，优选地，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1～2:2～3:1，更优选地，在强洗针液中甲醇、乙腈和异丙醇的体积比为1:2:1。
3.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，所述流动相A中甲醇-乙腈的体积比为4:6；所述流动相B为10mM甲酸铵水溶液；优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.20％甲酸；更优选地，在流动相B中，以甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸。
4.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，液相色谱条件包括：色谱柱为Welch Ultimate XB-C18，优选地，该色谱柱的长度为100mm，直径为2.1mm，填料粒径为3μm；柱温为30～45℃，优选为40℃；流速为0.2～0.6mL/min，优选为0.4mL/min。
5.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，涡旋及离心后取上清液，与稀释剂混合，即得待测样品；所述内标工作液中内标为奥美拉唑-d3；所述沉淀剂为乙腈；所述稀释剂为甲醇和水的混合溶液，优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为40～60:6～40；更优选地，在所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
6.根据权利要求5所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，在步骤(1)中，内标工作溶液的配制如下：称取奥美拉唑-d3对照品，用甲醇溶解得到浓度为1.00mg/ml奥美拉唑-d3储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为200ng/mL奥美拉唑-d3内标工作液。
7.根据权利要求6所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取20μL人血浆样品，加入20μL内标工作液和160μL乙腈，涡旋及离心后取50μL上清液，再与200μL稀释剂混合后，即得待测样品；所述稀释剂中甲醇和水的体积比为50:50。
8.根据权利要求6或7所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，所述涡旋及离心的条件为：涡旋10min，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min；将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2μL，进样器温度5℃。
9.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压5500V，离子源温度550℃；奥美拉唑，[M+H]+，m/z 346.2→198.1，DP值70V，CE值30V；奥美拉唑-d3，[M+H]+，m/z349.3→198.2，DP值80V，CE值30V。
10.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中奥美拉唑的方法，其特征在于，该方法可用于临床药代动力学样本监测。
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Applicant after: NANJING HEALTHNICE PHARMACEUTICAL CO.,LTD.

Address before: 211505 room 2002, building B4, No. 9, Kechuang Avenue, Zhongshan Science Park, Jiangbei new area, Liuhe District, Nanjing, Jiangsu Province

Applicant before: NANJING YINUO MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant before: NANJING HEALTHNICE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY CO.,LTD.

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