CN115343386A - 一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法 - Google Patents
一种hplc-ms/ms联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种HPLC‑MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，属于生物分析领域，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱‑质谱联用检测；(3)人血浆中吡仑帕奈的测定。采用本发明的检测方法，在血浆样品进行预处理时以吡仑帕奈‑d5作为内标，采用ZORBAX Eclipse XDB‑Phenyl作为色谱柱进行梯度洗脱，样品配制简单，分析时间短，对检测设备要求低，具有检测所需血浆量少，重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小等优点，有利于药物的临床监测和吡仑帕奈的药代动力学及生物等效性研究。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法。
背景技术
癫痫是一种常见的、复杂的神经系统疾病，是神经元高度同步化放电所致反复痫性发作的慢性疾病。癫痫的主要临床表现为发作性感觉、运动、行为及自主神经等出现不同程度的障碍，严重威胁人类的健康及患者的生活质量。癫痫是神经科仅次于头痛的第二大常见病，全世界癫痫患者约5000万，我国的癫痫患者已超过900万，而且有逐年递增趋势，目前对于新诊断的癫痫患者，药物治疗仍是首选，尽管有30％左右的患者经过抗癫痫药物(AEDs)治疗后疗效欠佳，但仍有70％左右的患者通过药物治疗痫性发作可以得到良好控制。
吡仑帕奈是世界首例AMPA受体拮抗剂，通过抑制突触后AMPA受体谷氨酸活性，减少神经元过度兴奋。吡仑帕奈片于2012年在欧洲、美国批准上市，于2019年在中国批准上市，用于成人和12岁及以上儿童癫痫部分性发作患者(伴或不伴继发性全面性癫痫发作)的加用治疗。
现有文献报道中使用HPLC-UV、HPLC-FL、HPLC-UV/FL以及LC/MS/MS等方法对血浆中吡仑帕奈进行检测。但是，通常存在着前处理复杂、耗时，血浆用量大，分析时间长及定量下限高等缺点。例如，国外文献High-performance liquid chromatography–tandem massspectrometry method for the determination of perampanel,a novel-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor antagonist in humanplasma报道使用LC/MS/MS检测人血浆中吡仑帕奈的方法：流动相：水-乙酸-200mM醋酸铵(100:0.1:0.1，v/v/v)和乙腈-乙酸-200mM醋酸铵(100:0.1:0.1，v/v/v)；流速0.2ml/min；色谱柱：YMC-Pack Pro C8TM(50mm×3.0mm)。处理步骤：取用100μL血浆，加入10μL内标工作液，再加入4mL叔丁基甲基醚液液萃取，涡旋5min混匀，在4℃和710g下离心10min，有机层氮气吹干，500μL乙腈-水-乙酸-200mm醋酸铵(70:30:0.1:0.1，v/v/v/v)复溶，10μL进样分析，该方法采用液液萃取，操作步骤繁杂，需氮吹复溶，前处理十分耗时。但是该方法分析物提取回收率为86.3-90.5％，内标提取回收率为92.1％，提取回收率较差。国外文献Simpleand rapid validated HPLC-fluorescence determination of perampanel in theplasma of patients with epilepsy报道HPLC-FL检测人血浆中吡仑帕奈的方法：色谱柱Kinetex PFP(100×2.6mm，4.6μm)；流动相0.03M乙酸钠pH 3.7和乙腈(40/60，v/v)；流速为0.8mL/min；样品制备取用250μL血浆，用乙腈蛋白沉淀。该方法虽然采用蛋白沉淀进行前处理，但血浆用量为250μL，血浆用量大，且该方法的定量下限为20ng，灵敏度较差；且该方法水相为0.03M乙酸钠pH 3.7，酸性环境对仪器的损害较大，对色谱柱耐用性要求高，不适合高通量的样品分析。
鉴于上述的缺陷，需开发更简单、可靠的样品预处理方法以及血浆药物浓度检测的方法，用于人血浆中吡仑帕奈的测定。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，具有前处理所需血浆量少、操作简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率高等优点。
本发明的技术方案如下：
一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为乙腈-水混合溶液；流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的测定；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；在0.5-2.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至75:25；在2.3-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为75:25；在3.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由75:25匀速渐变至55:45；在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；具体的梯度洗脱过程如表1：
表1吡仑帕奈液相色谱梯度
本发明在测定人血浆中吡仑帕奈时，采用梯度洗脱的方式进行分析，分析时间仅为4.5min，分析的时间短，大大缩短了分析时间；采用API 4000的质谱可以达到2.00ng/mL的定量下限，降低了对仪器的要求，使大批量生物样本分析更加方便、可行。
本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中吡仑帕奈时，流动相A为乙腈-水混合溶液，在一种优选方案中，在梯度洗脱过程中，流动相A中乙腈-水的体积比90～98:10～12，可以但不局限于90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3或98:2，为了取得更好的分离效果，流动相A中乙腈-水的体积比为95:5。
为了改善色谱分离选择性，本发明选择在甲酸铵水溶液中添加少量甲酸。例如，流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液，其中，0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液是指以浓度为3～7mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.2％甲酸。对于本发明而言，在流动相B中，甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度可以但不局限于3mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、5.5mM、6.0mM或7.0mM，优选地，甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为4～6mM，进一步优选地，甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度为5.0mM。在甲酸铵水溶液中甲酸的含量为0.05～0.2％，可以但不局限于0.05％、0.1％、0.15％、0.2％，优选地，在甲酸铵水溶液中甲酸的含量为0.1～0.15％，进一步优选地，在甲酸铵水溶液中甲酸的含量为0.1％。
在一种更优选方案中，流动相B为包含0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液。
本发明采用HPLC/MS-MS联用检测人血浆中吡仑帕奈时，色谱柱采用ZORBAXEclipse XDB-Phenyl；优选地，色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm。
进一步的，柱温为35～45℃，优选为40℃。
进一步的，流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.9mL/min。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈-水溶液和0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液作为流动相，以ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl作为色谱柱，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，且血浆样品用量少、样品前处理简单、分析时间短、线性范围宽、重现性好、灵敏度高、基质效应影响小。
理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征。在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。本发明采用HPLC/MS-MS联用同时检测人血浆中吡仑帕奈时，采用吡仑帕奈-d5作为内标，内标为同位素内标，使得二者在溶解性及色谱保留行为较相似，在色谱分析条件下，内标物能与样品中各组分充分分离，重现性、准确度均较好。
在步骤(1)中，本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，采用乙腈作为沉淀剂。采用蛋白沉淀法进行前处理人血浆样品，可以简化样品前处理步骤，节省时间，且使用的试剂危害更小，可以避免血浆中基质杂峰对化合物峰形的影响，使检测方法选择性更高，定量下限更低，同时获得令人惊讶的高回收率。
本发明的检测方法还包括配制内标工作液：称取吡仑帕奈-d5对照品，采用乙腈溶解并稀释得到浓度为1.00mg/ml吡仑帕奈-d5的储备液，再用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为100ng/mL的内标工作液。
在一种优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，震荡及离心后取上清液，与复溶液混合，即得待测样品；其中，复溶液为乙腈和水的混合溶液，在混合溶液中乙腈和水的体积比为40～60:60～40，可以但不局限于40:60、45:55、50:50、55:45或60:40。
在一种更优选方案中，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取50μL人血浆样品，向其中加入50μL内标工作液和350μL乙腈，震荡及离心后取上清液，再与100μL复溶液混合后，即得待测样品；其中，复溶液为乙腈和水的混合溶液，在混合溶液中乙腈和水的体积比为50:50。
进一步地，本发明对人血浆样品采用蛋白沉淀法进行前处理，其中，震荡及离心的条件为：以2000rpm/min涡旋震荡10min后，在4℃的条件下以4000rpm/min速度离心10min。
本发明在色谱检测时，将待测样品置于自动进样器，进行LC-MS/MS分析，进样体积为5μL，进样器温度5℃。
采用本发明的前处理方法处理待测样品并进行液相色谱-质谱联用检测时，提取回收率接近于100％，吡仑帕奈的总体提取回收率为101.11％。
本发明的检测方法，步骤(2)采用液相色谱-质谱联用检测的步骤包括：
本发明详细的色谱条件为：色谱柱采用ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl(4.6×750mm，3.5μm)，按照上述提到的洗脱过程进行梯度洗脱，柱温为35～45℃，优选为40℃；流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.9mL/min；进样量为1～20μL，例如，5μL。
本发明的质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压5500V，离子源温度550℃；吡仑帕奈，[M+H]+，m/z 350.2→247.4，DP值100V，CE值36V；吡仑帕奈-d5，[M+H]+，m/z 355.0→248.2，DP值135V，CE值31V。
采用本发明的前处理方法处理人血浆样品，可以针对血浆中吡仑帕奈的浓度进行测定，测定的浓度范围宽，其中，血浆中吡仑帕奈的检测范围为2.00～500ng/mL。
本发明的检测方法，步骤(3)人血浆中吡仑帕奈的测定步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品前处理方法制备，按步骤(2)液相色谱-质谱联用检测，分别记录吡仑帕奈浓度对应的峰面积，分别将吡仑帕奈和内标的峰面积比值以权重系数w＝1/x2进行线性回归，方程表达式，y＝ax+b，计算得到所述待测血浆中吡仑帕奈的浓度。
本发明的检测方法能够用于临床药代动力学样本监测。临床药物代谢动力学参数的计算的步骤包括：用DAS3.2.8计算药动学参数。用非房室模型(Non-compartmentalanalysis，NCA)分析，计算各受试者的药代动力学参数，包括：Cmax、Tmax、t1/2、AUC0-t，同时计算各参数的均数和标准差。
采用本发明的技术方案，优势如下:
(1)本发明采用ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl作为色谱柱，并筛选出合适的色谱条件，使吡仑帕奈色谱峰达到要求，在较短的分析时间内测定吡仑帕奈，能快速、高效地检测样品，适用于大批量血浆样品检测。
(2)本发明采用吡仑帕奈-d5作为内标，内标物能与样品中组分充分分离，样品配制简单，分析时间短，对检测设备要求低，重现性、准确度好。
(3)本方法使用样本量仅为100μL，所用样本量较少适用于大批量血浆样品检测。本发明的检测方法线性范围为2.00～500ng/mL，该线性范围较宽，定量下限低，可以分析不同剂量给药后的血浆样品，应用范围较广且可以避免做多次方法学验证。
(4)本发明的方法进行了包括特异性、准确度、精密度、基质效应、提取回收率、稳定性的全部方法验证，能用于评价各种剂量的吡仑帕奈在人体内的药代动力学评价及药物安全性评价。
附图说明
图1是吡仑帕奈和吡仑帕奈-d5的离子扫描图；其中，图1-1是吡仑帕奈子离子扫描图；
图1-2是吡仑帕奈-d5子离子扫描图；
图2是LC-MS/MS法分别测定血浆中吡仑帕奈的特异性色谱图；其中：
图2-1、2-2、2-3、2-4、2-5和2-6为6批不同个体空白血浆色谱图；在每一张附图中，左边色谱图为吡仑帕奈，右边为吡仑帕奈-d5；
图3是混合空白血浆色谱图；左边色谱图为吡仑帕奈，右边为吡仑帕奈-d5；
图4是定量下限样品色谱图；左边色谱图为吡仑帕奈，右边为吡仑帕奈-d5；
图5是健康受试者口服吡仑帕奈后收集的血浆样品色谱图；
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的检测方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
材料与方法
1.仪器与试剂
高相液相色谱(Shimadzu LC-20AD系列)；质谱(API 4000，Applied Biosystems/Sciex)；纯水仪(MilliDirectQ，Millipore)；微量天平(XP6，METTLER TOLEDO)；离心机(HeraeusMuitifuge X1R，ThermoFisher)；振荡器(LPD2500，LE PARD)。
乙腈(Merck，HPLC级别)，水(超纯水，实验室自制)，甲酸(Aladdin，HPLC级别)，甲酸铵(Aladdin，HPLC级别)。空白血浆(抗凝剂：肝素钠)来源于健康受试者。吡仑帕奈(TLC，批号：3378-049A1)、吡仑帕奈(TLC，批号：3378-069A3)。
2.液质条件
液相条件：色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl柱，4.60mm×75mm,3.5μm；柱温：40℃；进样器温度：5℃；流动相A为乙腈-水(95:5,v/v)；流动相B为0.1％甲酸-5mM甲酸铵溶液(以5mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.1％甲酸)；梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；在0.5-2.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至75:25；在2.3-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为75:25；在3.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由75:25匀速渐变至55:45；在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45。流速为0.9mL/min；洗针模式：Beforeand after aspiration；弱洗：甲醇:水(50:50,v/v)；清洗体积：500μL；强洗：甲腈，清洗体积：500μL。
质谱条件：离子检测方式：多反应监测(MRM)；离子化方式：气动辅助电喷雾离子化(ESI)；离子极性：正离子(Positive)；检测对象：吡仑帕奈BLPN，[M+H]+，m/z 350.2→247.4，DP值100V，CE值136V；吡仑帕奈-d5 BLPN-d5，[M+H]+，m/z 355.0→248.2，DP值135V，CE值31V。质谱参数：IonSpray Voltage：5500V；TEM：550℃。
3.标准品溶液的配制
吡仑帕奈工作溶液的配制：精密称取两份吡仑帕奈固体对照品适量，经质量校正系数校正后，用乙腈溶解并稀释后得到两份最终浓度为1.00mg/mL吡仑帕奈的储备液，储备液保存于-20℃冰箱。经储备液检查合格后，精密量取一份吡仑帕奈储备液，用甲腈:水(50:50,v/v)稀释，配制一系列浓度为40.0，80.0，200，1000，3000，5000，9000，10000ng/mL的标准曲线样品工作溶液，再精密量取另一份吡仑帕奈储备液用乙腈:水(50:50,v/v)稀释，配制浓度为120，600，7500ng/mL的QC工作溶液。
吡仑帕奈-d5工作溶液的配制：取适量吡仑帕奈-d5标准品，经质量校正系数校正后，用乙腈溶解，配制成终浓度为1.00mg/mL的储备液，储备液保存于-20℃冰箱。精密量取一定量的吡仑帕奈-d5储备液用乙腈:水(50:50,v/v)稀释，配制成浓度为100ng/mL的内标工作液。
4.标准曲线样品及质控样品的配制
对于每个浓度水平的标准曲线样品和质控样品，其配制过程举例如下：在380μL的空白血浆中加入20.0μL相应的工作溶液，混合均匀。配制体积可据实际情况适当调整，配成含吡仑帕奈浓度分别为2、4、10、50、150、250、450、500ng/mL的标准曲线样品和浓度分别为2ng/mL(LLOQ QC)、6ng/mL(LQC)、30ng/mL(MQC)、375ng/mL(HQC)的质控样品。
5.样品前处理
向2.0mL 96孔板中加入50μL的样品(待测生物样品，标准曲线样品、质控样品)；对于双空白样品和空白样品，加入100μL的空白基质。在双空白样品中加入50μL溶剂甲醇:水(50:50，v/v)，除双空白样品在外，在所有孔中加入50μL的内标工作液，后加入350μL乙腈。将96孔板以2000rpm/min涡旋震荡10min。将96孔板在4℃的条件下以4000rpm/min速度离心10min。取200μL上清液加入至干净的96孔板中，加入200μL复溶液乙腈:水(50:50，v/v)混匀置于进样室或者相同温度冰箱中待测。
6.方法学考察内容
根据2020年新版《中国药典》中《生物样品定量分析方法验证指导原则》对检测方法进行方法学验证，以确保检测的准确性、可重复性和稳定性。验证包括以下内容：特异性、标准曲线、精密度和准确度、基质效应、提取回收率、稳定性。
7.药代动力学研究
选取30名受试者，给药剂量4mg，单次给药：受试者于给药前(0h)、给药后5min、10min、20min、0.5h、0.75h、1h、1.25h、1.5h、1.75h、2h、2.5h、3h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h、216h、240h、264h、288h、312h、336h，采集静脉血4mL置于肝素钠抗凝管中，将管身轻柔颠倒混匀6-8次，冰浴条件放置。在采集后1h内，以4℃，2000g开始离心，离心10min，离心后，分离上层血浆，取其中约1mL血浆至冻存管a用于检测，另将剩余的血浆转移至冻存管b用于备份。分装后将检测及备份样品放入超低温冰箱(≤-60℃)保存。从全血样品采集到开始离心的时间不超过1h，采集到放入≤-60℃冰箱储存的时间不超过2h。转运至检测单位后保存在超低温冰箱中(≤-60℃)。
结果与讨论
1.专属性
本试验所采用的色谱条件下，吡仑帕奈的保留时间为2.43min左右，如图3；内标(吡仑帕奈-d5)的保留时间为2.41min左右，如图2所示；分别取6种不同来源的空白血浆各100μL，除不加内标外，按样品预处理操作，获得空白血浆样品色谱图，如图2-1～图2-6；定量下限样品色谱图见图4。取健康受试者口服吡仑帕奈后收集的血浆样品按样品预处理操作，得健康受试者血浆样品色谱图，如图5。
2.准确度、精密度试验
由6批来自不同供体的空白基质混合成的基质配制含吡仑帕奈为2ng/mL(LLOQQC)、6ng/mL(LQC)、30ng/mL(MQC)、375ng/mL(HQC)的质控样品，每个浓度各配制6份样品，并配制两条标准曲线(由两条标准曲线样品回归得到)，计算吡仑帕奈的峰面积As和内标峰面积Ai的比值f，以f代入当天的标准曲线求得实测浓度及实测浓度平均值和准确度，计算批内精密度及准确度，结果见表2。结果表明：除最低定量限(LLOQ)外，吡仑帕奈的批内质控样品的精密度RSD均小于15％，批内准确度RE至少有三分之二不超过±15％，且每个浓度水平至少二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±15％。最低定量限咪达那新样品的批内质控样品的精密度RSD均小于20％，批内准确度RE至少有三分之二不超过±20％，且每个浓度水平至少有二分之一数量的质控样品与其理论值的偏差不超过±20％，综上，精密度及准确度均符合要求。
表2批内、批间样品检测的精密度和准确度
3.基质效应考察
基质样品配制：取6份不同来源个体的空白血浆，每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白基质提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。
溶液样品的配制：以纯水代替空白血浆进行前处理步骤，后将工作溶液进行稀释配制成相应浓度使加入100μL空白基质提取液或100μL纯水提取液后浓度与低、中、高浓度质控样品前处理后进样浓度一致，且每一浓度3个重复样本。
结果显示，吡仑帕奈基质效应(以峰面积比值计算)总基质效应因子为1.02～1.07，偏差小于5.9％，血浆基质不影响吡仑帕奈准确定量。基质效应数据结果见表3。
表3基质效应
计算方式：基质效应因子：对照溶液峰面积比/样品峰面积比
在高脂(300mg/dL甘油三酯)和溶血(2％溶血)基质中加入待测物使成LQC、HQC浓度水平，经标样校准后，每个浓度水平上述样品的平均测定值与其理论值的偏差≤±15.0％，精密度≤15.0％。该方法条件下，溶血基质(≤2％溶血)和高脂基质(≤300mg/dL甘油三酯)均不影响吡仑帕奈测定准确度和精密度，具体数据结果见表3-3和3-4。
表3-3溶血评价
表3-4高脂评价
4.提取回收率考察
基质样品配制：取6份不同来源个体的空白血浆，每个不同来源的空白血浆制备九个重复的双空白样品，按样品预处理操作，得到空白血浆提取液，提取之后加入一定的分析物和内标，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致(每个浓度水平，三个重复)。
质控样品配制：取低、中、高三种浓度的质控样品按照样品处理方法处理，每一浓度水平配制6份。
通过基质样品与质控样品待测物与内标峰面积比值响应的比较评价待测物的回收率；通过质控样品与基质样品内标物峰面积响应的比较评价内标物的回收率。
回收率的接受标准为：每个浓度水平和所有浓度水平的回收率的精密度应在15％之内。吡仑帕奈总提取回收率(以峰面积比值计算)为101.11％，其中在低、中、高三个浓度水平的回收率分别为102.82％、101.12％和99.40％，具体数据分别见表4。
表4待测物提取回收率
5.稳定性考察
进样室稳定性：考察精密度、准确度的分析批首次进样分析后，放置于自动进样器(5℃)168h后，再次进样分析，记录色谱图。结果见表5，吡仑帕奈的血浆样品处理后的进样溶液在进样器中放置168h稳定性良好，符合生物样品分析的要求。
室温稳定性：将配置好的低、高两个浓度水平的质控样品，含吡仑帕奈浓度为6.00ng/mL，375ng/mL，每个浓度水平的样品混合均匀后，于室温放置24h后进行样品预处理，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图。结果如表6所示，血浆样品在室温条件下放置24h稳定性良好。
冻融稳定性：新鲜配制含吡仑帕奈浓度为6.00ng/mL，375ng/mL的样品，分别放入-20℃冰箱和-80℃冰箱中进行4次冻融循环。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％。结果见表7-1及表7-2，样品在-20℃冰箱和-80℃冰箱经过4次冻融循环后，稳定性良好。
长期稳定性：新鲜配制含吡仑帕奈浓度为6.00ng/mL，375ng/mL的样品，分别放入-20℃冰箱和-80℃冰箱中冻存91天后检测。接受标准为：稳定性样品的平均测定值与其理论值的％RE不应超过±l5.0％，各浓度水平下稳定性样品测定值的％RSD应≤15.0％。结果见表8，样品在-20℃冰箱和-80℃冰箱冻存91天，稳定性良好。
表5进样室稳定性
表6室温稳定性
表7-1-20℃冻融稳定性
表7-2 -80℃冻融稳定性
表8长期稳定性
综上所述，采用本发明的方法，相对于现有技术中所报道的方法，除了分析时间短，血浆用量低，灵敏度高，适用性强等有时外，在方法学验证也取得了更好的效果，药物的提取回收率高，未见明显基质效应，本发明方法还具有快速、通量高的优点。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱-质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈-水混合溶液；所述流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中吡仑帕奈的测定；所述梯度洗脱过程如下：在0-0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；在0.5-2.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至75:25；在2.3-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为75:25；在3.5-4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由75:25匀速渐变至55:45；在4.0-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45。
2.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，色谱条件包括：色谱柱采用ZORBAX Eclipse XDB-Phenyl；优选地，色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm；柱温为35～45℃，优选为40℃；流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.9mL/min。
3.根据权利要求2所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，所述流动相A为乙腈-水混合溶液，在所述混合溶液中乙腈与水的体积比为90～98:10～12，优选地，在混合溶液中乙腈与水的体积比为95:5；所述流动相B为包含0.1～0.15％甲酸的4～6mM甲酸铵水溶液，优选地，所述流动相B为包含0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液。
4.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品通过蛋白沉淀法进行前处理；采用吡仑帕奈-d5作为内标，采用乙腈作为沉淀剂。
5.根据权利要求4所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，内标工作液的配制过程如下：称取吡仑帕奈-d5对照品，采用乙腈溶解并稀释得到浓度为1.00mg/ml吡仑帕奈-d5的储备液，再将所得储备液用体积比为50:50的甲醇与水混合溶液稀释得到浓度为100ng/mL的内标工作液。
6.根据权利要求5所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：人血浆样品加入内标工作液和沉淀剂，震荡及离心后取上清液，与复溶液混合，即得待测样品；所述复溶液为乙腈和水的混合溶液，在所述混合溶液中乙腈和水的体积比为40～60:60～40。
7.根据权利要求6所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品前处理包括：取50μL人血浆样品，向其中加入50μL内标工作液和350μL乙腈，震荡及离心后取上清液，再与100μL复溶液混合后，即得待测样品；所述复溶液为乙腈和水的混合溶液，在所述混合溶液中乙腈和水的体积比为50:50。
8.根据权利要求6或7所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，所述涡旋及离心的条件为：以2000rpm/min涡旋震荡10min后，在4℃条件下以4000rpm/min速度离心10min；将待测样品置于自动进样器，进行HPLC-MS/MS分析，进样体积为5μL，进样器温度为5℃。
9.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子多反应监测扫描，喷雾电压5500V，离子源温度550℃；吡仑帕奈，[M+H]+，m/z 350.2→247，DP值100V，CE值36V；吡仑帕奈-d5，[M+H]+，m/z355.0→248.2，DP值135V，CE值31V。
10.根据权利要求1所述的HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，该方法可用于临床药代动力学样本监测。
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